The authors were supported by: a CancerFree KIDS Research Grant, a March of Dimes Basil O&#8217;Connor Starter Scholar Award (#5-FY14-32), a Cincinnati Children&#8217;s Hospital Medical Center (CCHMC) Trustee Grant Award; a CCHMC Research Innovation and Pilot Funding Award; and CCHMC developmental funds. Authors also acknowledge the Capel laboratory for the initial optimization of this technique.

이들 연구에 사용 된 모든 마우스는 찰스 리버 연구소에서 얻은 CD-1 마우스였다. 이전 배양 실험은 또한 C57BL / 6J (데이터는 미도시)와 같은 다른 균주에서 수행되었지만, 임의의 변형이 사용될 수있다. 임신 성인 여성은 약 2~3개월 이전이었고, 자궁 경부 전위와 배아를 제거하기 전에 양자 개흉술 다음 CO 2 흡입을 통해 안락사시켰다. 마우스는 NIH의 지침에 따라 보관하고, 실험 프로토콜은 신시내티 아동 병원 의료 센터의 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다. 악기, 문화 미디어, 그리고 요리 1. 준비 <ol><li> 70 % 에탄올 용액을 제조 하였다. (습윤 챔버를 제조 및 / 희석 용액의 제조) 오토 클레이브에 탈 이온수. 70 % 에탄올로 아래로 분사하여 해부 도구 (집게, 가위, 27 G 바늘 주사기를) 소독. </li><li> 준비ml의 1 M의 MgCl 2 CaCl2를 3.75 1 M의 PO 4, 7,425 ml의 칼슘 및 마그네슘 (80g 염화나트륨, 2g의 KCl, 14.4 g (2) 나 HPO 4, 2.4 g의 KH 2를 함유 10X 인산염 완충 식염수 (PBS) ). 1 L 멸균 멸균 물에 용해 후 여과지로 필터링 저어. 1X PBS를 만들기 위해 물을 10 배 희석. </li><li> 가열을 30 분 동안 55 ° C에서 소 태아 혈청 (FBS)을 비활성화 필터 및 0.22 μm의 주사기 필터로 멸균. </li><li> 둘 베코의 수정 이글 중간 (DMEM)로 구성된, (완전한 DMEM, cDMEM라고도 함) 38 ㎖의 1X 전체 문화 매체를 준비, 10 % 페니실린 - 스트렙토 마이신 주식의 열 불 활성화 FBS와 1/100 희석 필터링. 이것은 일반적으로 신선한 표기하지만 1 개월, 4 ℃에서 저장 될 수있다. </li><li> 5 ㎎ / ㎖의 주식 농도 DMSO의 VEGFR 티로신 키나제 억제제 II (TKI II)를 재구성하고, 작업 솔루션을 만들기 위해 cDMEM으로 주식을 희석. 마지막 사기꾼이 연구에 대한 자기 중심은 cDMEM에서 1.875 μg의 / ㎖이다. 회사의 권장 사항에 따라, 스톡 용액은 -20 ℃에서 최대 6 개월 동안 안정하다. 작업 솔루션으로, 신선하고 같은 날에 사용합니다. 주 : 작동 용액에서이 약물의 농도 (그 방울의 두 배 희석 될 것이기 때문에) 원하는 최종 농도보다 더 높은 두 배이어야한다. 동시에, &quot;제어&quot;치료 DMSO의 동일 부피를 함유 cDMEM 동일한 볼륨을 준비한다. </li><li> 증류수에 별도로 꼬리 소화 시약 (50 mM의 NaOH를 1 M 트리스 - 염산 [pH가 8.0]) 준비합니다. </li><li> XY PCR 프라이머의 25 μm의 재고 확인 (XY 앞으로 5&#39;-TGA AGC TTT TGG CTT TGA G-3 &#39;와 XY 역을 5&#39;-CCG CTG C​​CA AAT TCT TTG G-3&#39;) 함께 뉴 클레아없는 물. </li><li> 50X TAE 버퍼 (242g 후, Trizma 자료, 57.1 ml의 빙초산을 준비, 100 ml의 0.5 M EDTA, pH가 8.5, 및 추가 물 1 L Fi를최종 볼륨). 1X TAE 런닝 버퍼를 준비한다 (20 ㎖ 50X TAE 1 L의 총 부피로 물로 희석). </li><li> 끓는 때까지 전자 레인지에서 2.5 % 아가로 오스 용액 (0.625 g의 아가로 오스, 0.5 ml의 50X TAE 버퍼, 24.5 ml의 물), 열 아가로 오스 솔루션을 만들려면, 다음 식지 약 55 ~ 65 ° C를 (터치 수)까지. 일단 멋진, 1 % 에티 디움 브로마이드 솔루션 2 μl를 추가하고 젤을 붓는다. 주의! 에 티듐 브로마이드 돌연변이와 기형이고; 니트릴 장갑과 적절한 안전 프로토콜 처리를 사용하십시오. 대안 적으로, 다른 잠재적으로 독성이 덜한 해결 겔 화제 또는 염료를 사용할 수있다. </li><li> 면역 형광 대 (0.1 % 트리톤 X-100, 10 % 소 태아 혈청 [FBS, 및 3 % 소 혈청 알부민 [BSA]를 PBS) 블로킹 용액을 제조 하였다. </li><li> 면역 용 세정액 (0.1 % 트리톤 X-100과 PBS, 1 % FBS, 및 3 % BSA)을 준비한다. </li><li> 면역을 위해 (0.1 % 트리톤 X-100과 PBS) PBTx를 준비합니다. </li><li> CU의 배양 챔버를 준비합니다lture. 물을 멸균 35 ㎖로 대형 (100mm 직경) 페트리 접시를 채우십시오. 해부와 문화를 수행 할 위치 근처에 배치합니다. </li></ol> 뮤스의 musculus에서 태아 고환 2. 분리 <ol><li> 매일 아침 질 플러그의 여성 마우스를 확인합니다. 질 플러그가 감지되는 날 정오가 E0.5 간주됩니다. 승인 동물 프로토콜에 따른 방식으로, E11.5로 임신 여성 마우스를 안락사. </li><li> 70 % 에탄올로 마우스의 복부를 스프레이. </li><li> 미세 가위를 사용하여 V 자형 절개와 배꼽 피부와 복막을 열고 내부 장기를 노출 조직의 플랩을 다시 당깁니다. </li><li> 자궁의 양쪽에있는 난소를 찾습니다. 가위를 사용하여, 모체로부터 배아를 함유 자궁을 분리 난소 및 결합 조직을 절단. </li><li> 부드럽게, 태반 반대 측면을 절단 난황 주머니를 노출하여 자궁 벽을 엽니 다. PU에 조심하지 수ncture 난황는 손상 또는 손실 배아를 방지 할 수 있습니다. </li><li> 배아 함유 난황 주머니를 제거하고 칼슘과 마그네슘과 PBS를 포함하는 접시에 그들을 배치 태반 근처 잘라. 칼슘 및 마그네슘 이온의 존재는지지 세포 유착 분자는 조직 구조를 유지하고 절개 도구에 달라 붙는 것을 방지하기 위하여 조직을 도울 것이다. </li><li> 집게로 조심스럽게 배아 밖으로 밀어 수있는 구멍을 만들 난황을 천공하여 배아의 난황과 양막을 제거합니다. 배아는 난황의 외부되면, 탯줄을 잘라. </li><li> 이 시점에서, 멸균 조직 문화 후드에있는 현미경을 사용합니다. 태아의 머리를 제거하고 목의 양쪽에 집게로 집어 버린다. </li><li> 꼬리를 제거하고 태아의 성별을 결정하는 XY PCR 분석을위한 새로운 microcentrifuge 관에 배치합니다. 주 : 수확 후 가능한 빨리 배양 생식선에 최적이지만,도이다 POSsible 꼬리 DNA를 제거하고 각 태아의 성별이 알려져 있습니다 만 원하는 섹스를 배양 할 필요가 있도록, 문화에 앞서 XX / XY의 유전자형을 수행 할 수 있습니다. 유전자형이 수행되는 동안 문화에 대한 준비가 될 때까지 4 ° C 또는 얼음에 (그들이 추적 할 수 있도록), 배아 분리 유지 될 수있다. 한 가지주의해야 할 점은 자궁 또는 문화 조건에서 외부의이 기간은 잠재적으로 문화 중 문화 또는 후속 개발을위한 생존 능력에 영향을 미칠 수 있다는 것이다. </li><li> (일반적으로 약한 손에 개최 집게) 포셉 일쌍와 배아의 겨드랑이를 달아하여 배양 접시의 바닥에 대한 앙와위에서 배아를 고정합니다. 전체 해부 과정에서 여전히 배아를 보유하는 대신에이 집게를 유지한다. </li><li> 포셉의 다른 쌍으로, 피부 커버 복부를 제거하고 부드럽게 몸 벽을 다시 노출 간, 창자, 그리고 다른 장기를 제거합니다. </li><li> 생식선은 등쪽 대동맥의 양쪽에 뒤쪽 몸통 벽 상에 위치되는 바와 같이,몸의 정중선을 따라 실행 큰 혈관 폐쇄 집게와 비뇨 생식기 능선 아래 특종과 집게를 열고 들어 올려 비뇨 생식기 능선을 제거합니다. 생식선이 느슨하게 벽에 부착 될 수있는 바와 같이, 이러한 연결을 제거하지 않고 너무 빨리 끌어이나 생식선이 기관에 손상을 초래, 스트레칭 할 수있다 않도록주의하십시오. </li><li> 미디어에 조직을 적응하기 위해 접시에 cDMEM으로 비뇨 생식기 능선을 이동합니다. </li><li> 27 G 바늘을 사용하여 비뇨 생식기 능선의 나머지 부분에서 생식선 - mesonephros 복합체를 분리합니다. 최적의 분리를 허용하도록 압하에 의해 절단 한 조직을 정확하게 안내하도록 다른 하나를 사용하는 바늘을 사용한다. 날카로운 바늘이 조직에 충실 할 수 있습니다 플라스틱 파편을 생성하므로, 접시 바닥에 대한 톱질 동작을 사용하지 마십시오. 완전히 생식선에 부착 된 mesonephros을 유지해야합니다. </li></ol> 소분자 억제제 생식소 3. 배양 <ol><li> 두 20 μ 설정15 μL를 각각 L 피펫. 다른 피펫은 약물 치료 cDMEM으로 만 사용되는 반면, 생식선 및 제어 cDMEM의 첨가 전송을위한 청소, 소독 면도날을 사용하여 장벽 피펫 팁 하나 떨어져 약 1-2mm을 잘라. </li><li> 그들은 쉽게 차단 피펫 팁을 사용 할 수 있도록 피펫 팁으로 장축과 평행 생식선 일렬. 피펫 팁의 내부에 부착 생식선의주의하십시오. </li><li> 하나의 제어 방울로 측과 약물 함유 방울과 다른 레이블. 단 두 방울 35mm 접시 뚜껑에 들어갈 수 있습니다. 뚜껑에 라벨 꼬리 조직 함유 마이크로 원심 튜브에 라벨과 일치하는지 확인하십시오. </li><li> 소형 (35mm) 배양 접시의 뚜껑에 물방울에 하나의 생식선을 포함 cDMEM의 피펫 15 μL (바닥이 가습 배양 접시 챔버 내에 맞게 너무 키가 큰만큼, 단지 뚜껑을 사용). 접시의 양쪽에 두 개의 생식선 함유 방울을 놓고, 잘 분리 FR톰 서로. 생식선이 방울로 전송되었는지 확인하기 위해 현미경으로 확인합니다. </li><li> 컨트롤로 지정 방울에, 30 μl의 총 부피와 방울을 만들기 위해 (단계 1.5에서 만든) DMSO를 포함 cDMEM의 추가로 15 μl를 추가합니다. 약물에 문의하지 않습니다 만 &quot;컨트롤&quot;피​​펫을 사용합니다. </li><li> 다른 방울 (약 처리 샘플)에, 30 μl의 총 부피와 방울을 만들 TKI-II 함유 cDMEM의 15 μl를 추가합니다. 약물 처리 된 샘플에 대한 지정 만 피펫을 사용합니다. </li><li> 그들은 직경 약 15-18mm이다 및 생식선이 대략 중간에 위치 할 때까지 피펫을 사용하여, 확대 원형 패턴으로 방울을 확산. 그것의 측면에 거짓말과 생식선과 mesonephros 쉽게 구별 할 수 있도록 생식선의 방향. 두 개의 돌출부가 평평 누워 있도록 폐의 방향. <ol><li> 물방울 직경이 약간 다를 수 있지만, 생식선이 floatin되지 않도록G와는 표면 장력에 의해 장소에서 개최됩니다. 물방울이 서로 또는 덮개의 측면을 만지지 않도록합니다. 표면 장력없이 장기 따라서 장기 형태를 왜곡, 배양 동안에 성장 및 뚜껑 상에 평평하게된다. </li></ol></li><li> 신중 직립 큰 (100mm) 가습기 접시 물의 표면에 물방울을 함유 배양 접시에 뚜껑을 배치. 뚜껑의 하단 아래에 갇힌 기포가 없는지 확인하고는 물 표면에 평평하게 눕혀져된다. 뚜껑을 반전과 물이 물방울이있는 뚜껑의 상단에 접촉하지 않도록주의하지 마십시오. </li><li> 작은, 가습 실을 만들려면, 즉시 생식소 문화를 둘러싸는 큰 가습기 접시의 뚜껑 커버. 미디어 중 증발을 최소화하기 위해 가능한 한 빨리 작동한다. 작은 접시가 자유롭게 이동하는 그것과 큰 접시의 뚜껑 사이의 공간이 있는지 확인하십시오; 그렇지 않으면, 응축 실 및 b를 만들 수 있습니다조직에 잠금 공기 교환. </li><li> 두 개의 작은 뚜껑이 챔버에 배치되면, 바로 인큐베이터로 챔버를 놓습니다. 37 ℃에서 가습 된 CO2 인큐베이터에서 48 시간 동안 배양 액적 부화. </li></ol> 배아 성을 결정하기위한 제 중합 효소 연쇄 반응 <ol><li> 1.5 ML의 microcentrifuge 관의 바닥에 배아 꼬리를 추가합니다. </li><li> 각 튜브의 50 mM NaOH를 200 μl를 추가합니다. </li><li> 15 분 동안 또는 조직이 완전히 용해 될 때까지 95 ° C에서 발생. </li><li> 가볍게 간단히 50 1M 트리스 - 염산의 μL와 소용돌이를 추가합니다. </li><li> 0.5 ㎕의 25 μM 프라이머 용액 2.5 μL 10X의 Taq 완충액, 0.5 ㎕의 10 mM의 dNTPs를 (뉴클레오티드), 19.3 μL nuclease- : 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브에, 샘플의 총 수에 의해 각각 용적을 곱하여 새로운 PCR 마스터 믹스를 만들 무료 물, 0.2 μL DNA의 Taq 중합 효소. 잘 섞는다. </li><li> 23 추가PCR 마스터 믹스의 μL 소화 꼬리의 3 ㎕의 용 해물을 함유하는 PCR 튜브. </li><li> 톡 튜브는 튜브의 바닥에 샘플을 가지고 짧은 스핀을 수행을 혼합한다. </li><li> XY (짧은) PCR 프로그램 (표 1)를 실행합니다. </li><li> 1X TAE 버퍼에 2.5 % 아가로 오스 겔과 사다리 (5 배 염료) 샘플을로드합니다. </li><li> XX와 XY 밴드가 해결 될 때까지 아가로 오스 겔 전기 영동을 실행합니다. </li><li> 화상 UV 광 및 캡쳐 이미지와 겔. </li><li> Y 염색체 특이 밴드 대 특정 X-염색체 (X 염색체를 = 331 염기쌍 [BP]와 XY = 302 BP) 분석 (13) XY (남성) 샘플, (331)의 두 밴드와 302 BP있을 것이다 XX 반면 (여성) 샘플은 하나의 331 bp의 밴드로 나타납니다. </li></ol> 5. 전체 마운트 장기 면역 형광 1 일 : <ol><li> 차단 팁과 1,000 μL 피펫을 사용하여 문화의 생식선을 제거합니다. 원한다면, 그들은 수있다미디어 및 시약을 씻어 PBS의 접시에 배치. 0.5 ml의 microcentrifuge 관에서 PBS에 놓습니다. 작은 튜브 크기는 시약을 보존하고 쉽게 튜브에 시료를 추적 할 수 있도록한다. <ol><li> 잠재적 인 약물 오염을 방지하기 위해 별도의 튜브, 제어 및 처리 샘플뿐만 아니라, XX와 XY 샘플을 유지하고 피펫의 별도의 세트 문화에서 제거해야합니다. </li></ol></li><li> PBS로 두 번 생식선을 씻으십시오. 이 시점부터,이 프로토콜은 칼슘과 마그네슘이 부족 1X PBS를 사용할 수 있습니다. 를 세척하기 위해, 생식선이 (중력에 의해) 튜브의 바닥에 침몰하고 위의 액체를 제거 할 수 있습니다. 그들에게 너무 가까이 피펫 팅에 의해 생식선을 잃지 않도록주의하십시오. </li><li> 튜브에서 가능한 한 많은 PBS를 제거합니다. PBS는 0.1 % 트리톤 X-100을 포함하는 4 % 파라 포름 알데히드 250 μl를 추가하고, 로커에 4 ° C에서 O / N을 배양 할 수 있습니다. 대안 적으로,이 고정은 로커에 4 ℃에서 2 시간 동안 수행 될 수있다. 주의! Paraformaldehyde는 처리 할 때 매우 안전 프로토콜을 따르 독성 물질이다. </li></ol> 주 2 : <ol start="4"><li> 실온에서 250 μL의 PBTx 두 번 생식선을 씻어. </li><li> 로커에 실온에서 10 분 각 250 μL PBTx과 생식선 3 회 반복한다. </li><li> 로커에 실온에서 솔루션을 차단 250 μL의 생식선이 적어도 1 시간 차단합니다. </li><li> 솔루션을 차단에 희석 250 μL 차 항체의 로커에 4 ° C에서 생식선 O / N을 얼룩. </li></ol> 주 3 : <ol start="8"><li> 250 μL 세척 용액에 두 번 생식선을 씻어. </li><li> 로커에 실온에서 10 분마다 생식선 250 μL 세척 용액으로 3 회 반복한다. </li><li> 생식선에게 로커에 실온에서 차단 솔루션 250 μL에 1 시간을 차단합니다. </li><li> 광으로부터 형광 이차 항체를 보호하기 위해 알루미늄 호일로 microcentrifuge 관을 커버. </li><li> AR에 실온에서 생식선 2-4 시간을 품어ocker 대안 훽스트 33342.을 포함 차단 솔루션에 희석 250 μL 차 항체에, 로커에 4 ° C에서 이차 항체와의 Hoechst 33342 배양 O / N을 수행합니다. </li><li> 250 μL PBTx 두 번 생식선을 씻어. </li><li> 로커에 실온에서 10 분 각 250 μL PBTx의 생식선 3 회 반복한다. </li><li> 컷오프 피펫 팁을 사용하여, 최소한의 액체와 함께 생식선 슬라이드에 옮긴다. 피펫으로 물기를 제거하지만, 조직이 건조하지 않도록해야합니다. </li><li> 집게로 원하는 방식으로 생식선의 방향을, 빠르게 슬라이드의 생식선을 마운트 장착 미디어의 한 방울을 추가합니다. 설치 미디어 코트 완전히 모든 샘플 확인; 이 샘플은 건조시키는 않도록하는 것이 중요합니다. </li><li> 적절한 크기의 사용 된 커버 (수 1.5 스타일) 부드럽게 샘플을 포함합니다. 커버 슬립의 전체 표면을 접촉하는 설치 미디어의 확산을 보자. 필요하다면, 매우 가볍게되도록 커버 슬립의 모서리에 눌러더 큰 기포가 없습니다. </li><li> 설치 미디어의 증발을 줄이기 위해 가장자리 명확 매니큐어와 슬라이드를 밀봉합니다. 스토어는 4 ° C에서 어둠 속에서 슬라이드를 장착. </li></ol>

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Cell. 18, 175-189 (2010).</li><li>Brennan, J., Capel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One+tissue,+two+fates:+Molecular+genetic+events+that+underlie+testis+versus+ovary+development.">One tissue, two fates: Molecular genetic events that underlie testis versus ovary development.</a> Nat. Rev. Genet. 5, 509-521 (2004).</li><li>Martineau, J., Nordqvist, K., Tilmann, C., Lovell-Badge, R., Capel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Male-specific+cell+migration+into+the+developing+gonad.">Male-specific cell migration into the developing gonad.</a> Curr. Biol. 7, 958-968 (1997).</li><li>Yokonishi, T., Sato, T., Katagiri, K., Ogawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+spermatogenesis+using+an+organ+culture+technique.">In vitro spermatogenesis using an organ culture technique.</a> Methods Mol. Biol. 927, 479-488 (2013).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+production+of+functional+sperm+in+cultured+neonatal+mouse+testes.">In vitro production of functional sperm in cultured neonatal mouse testes.</a> Nature. 471, 504-507 (2011).</li><li>Gohbara, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+murine+spermatogenesis+in+an+organ+culture+system.">In vitro murine spermatogenesis in an organ culture system.</a> Biol. Reprod. 83, 261-267 (2010).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

이 연구는 태아의 발달을 연구하는 많은 응용 가능성을 갖는 생체 전체 기관 방울 방법을 보여줍니다. 이 기술로 인해 배아 및 배아 치사의 잠재적 어려움을 사용하여 생체 내에서 생물학적 검사하기 어려운 문제를 해결하기위한 접근 연구원 여러 기관에 사용하고, 허용 할 수있다. 이 배양 방법은 포유 동물 세포주와 같은 접근 체외 다른 위에 추가적인 이점이 전체 기관 그?...

인간의 생체에서 장기 재생은 매우 제한적이다 따라서, 조직 공학, 조직 및 호스트에 의해 기증 개별 세포로부터 장기 개발, 장기 교체 매력적인 잠재적 치료되고있다. 이 치료 전략이 성공하려면 그러나, 요인과 기관의 형태 형성에 관여하는 세포의 상호 작용은 철저하게 공부해야 잘 이해했다. 전통적인 접근 방식과 특정 장기의 개발을 연구 할 수 없기 때문에, 연구자들은 대체 전체 배아 또는 전체 기관 배양에 돌았 다. Kalaskar 등. 1은 체외 배양 방법은 기관 형성 연구에 대한 실현 가능한 대안 제시, 자궁 개발에 (배양 된 배아의 58 %에서) 그 생체 전체 배아 문화가 유사한 결과를 얻을 보여 주었다. 개별적인 기관 배양 시스템 등이 생체 DRO시약 또는 약물 항체의 첨가를 통해 특정한 신호 경로 또는 세포 상호 작용의 조작을 허용하면서 plet 배양 시스템은 전신 효과의 전체 기관 독립 분석을 허용한다. 전통적으로, 태아 기관 개발 연구는 모체 약물 전달 시약 이외에, 트랜스 제닉 마우스와 녹아웃 기술에 한정되어왔다. 그러나, 생체 내에서 이러한 기술과 치료에 관련된 기술적 인 문제가있다; 대부분의 문제는 종종 배아 치사를 초래 동시에 여러 장기에 영향을 미치는 영향을 중심으로 돌고. 태아의 발달을 조작하는 연구의 또 다른 관심사는 약리학 등의 시약은 태반 장벽을 통과 할 수있는 경우 (예, 약물의 산모 대사는 배아에 도달하기 전에) 및 자궁 내 배아 발달에 약물의 모성 효과입니다. 전체 기관 배양 기술은 기재된여기서 전체 태아 생식선이 생체 직립 액적 배양 배양 된 제 Maatouk 외. (2)에 의해 설명 된 프로토콜에서 적응시켰다. 태아 생식선을 배양 한 가지 중요한 이점은 소분자 억제제가 용이 단순 확산에 의해 전체 기관에 액세스 할 수 있다는 것이다. . DeFalco 등은 소분자 억제제와 결합이 생체 액적 배양 방법을 활용하는 것은 프로세스 및 생식선 3 개발 중에 발생하는 상호 작용을 시그널링 연구하기 위해 사용될 수 있음을 보여 주었다; 이러한 프로세스는 기술적 문제로 생체 내에서 검사하기 어려운 것 (예를 들어, 태반 또는 유전 또는 약리학 적 접근 방식을 사용하여 여러 기관에 영향을 미치는 치사를 통해 약물의 통과). 액적 배양뿐만 아니라 자궁 실험의 특정 측면을 개선하지만, 그것은 또한 시험 관내 및 EX VI 위에 개선이다VO 시스템도. 그들은, 다양한 세포 유형 부족 장기 구조의 형성을 허용하는 중요한 세포 외 기질 (ECM) 성분이 부족하고, 캐스케이드 신호에서 아티팩트를 나타낼 수 있기 때문에, 형태 형성을 연구하는 세포주의 이용은 매우 곤란하다. 조직 공학은 ECM 시뮬레이션 지지체를 작성을 크게 향상했다하더라도, 신호 형성기 중 각 세포 타입에 의해 요구되는 관련하여 기술의 부족은 도전 체외 기관 시스템을 구축 할 수있다. 다른 생체 시스템은 이전에, 필터 (6), 기타 발판 매트릭스 7,8 기관 형성을 연구하기 위해 설립, 또는 더 구체적 형태 형성, 한천 4 태아 기관의 라이브 영상에 매우 성공적이었다, 5 트랜스 웰되었다. 액적 배양 시스템의 장점은 O를 덜 시약을 이용할 수있는 기능을 제공함으로써, 형태 형성의 연구를 허용한다는 것이다ften 비싸고, 또한 성장 및 시그널링 기능 9 중요 장기 표면 장력을주는. 마우스에서, 초기 고환의 형태 형성 배아 (E) 사이에 일어난 일 E11.5 및 E13.5 스테이지; 이러한 단계는 특정 성 분화에 영향을 미치는 요인을 조사하기위한 최적의 시간 윈도우를 포함한다. 정소 형성시 발생하는 중요한 프로세스 중에서 고환 코드 구조의 생성 및 정소 특정 혈관 네트워크의 형성이다. 이 생체 전체 기관 액적 배양 시스템을 이용하여, 하나는 남성 관련 혈관 신생을 변경 및 소분자 억제제의 사용을 통해 정소의 형태 형성을 억제 할 수 있다는 것을 블록 혈관 내피 성장 인자 (VEGF)에 대한 수용체의 활성; VEGF-매개 혈관 재는 고환 개발 10-12 중요하다. 이 방법은 성공적으로 다른 장기에 적용 할 수 있으며, 특정 시간을 타겟팅 할개발의 창. 전체 마운트 장기 이미징은 중요한 구조의 시각화뿐만 아니라 다양한 억제제의 투여로 인한 구조 및 세포 변화 할 수 있습니다. 중요한 것은,이 시스템은 연구자가 생체 내 표적 유전자 전략 동안 모체 약물 또는 전신 투여 중단 잠재적 교란 효과를 무시할 수 있다는 점에서 유리하다. 따라서,이 전체 기관 체외 액적 배양 시스템은 크게 태아 발달 동안 특정 기관 내의 구체적 발생할 상호 작용 및 신호를 이해하는 능력을 향상시킬 수있다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus Microscope Slides</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover Glasses: Squares (22 mm x 22 mm, No. 1.5)</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-541B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sally Hansen Xtreme Wear Nail Polish, Invisible</td>
			<td>Sally Hansen</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-Strip 0.2 mL PCR Tubes &#38; Detached Flat Caps</td>
			<td>GeneMate</td>
			<td>T3218-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman L P1000L, P200L, P20L, P10L, P2L</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>FA10006M, FA10005M, FA10003M, FA10002M, FA10001M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>91150-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>91460-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Posi-Click 1.7 ml microcentrifuge tubes</td>
			<td>Denville</td>
			<td>C2170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Posi-Click 0.6 ml microcentrifuge tubes</td>
			<td>Denville</td>
			<td>C2176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#956;l SHARP Precision Barrier Tips</td>
			<td>Denville</td>
			<td>P1096FR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 &#956;l SHARP Precision Barrier Tips</td>
			<td>Denville</td>
			<td>P1121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#956;l SHARP Precision Barrier Tips</td>
			<td>Denville</td>
			<td>P1122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#956;l SHARP Precision Barrier Tips</td>
			<td>Denville</td>
			<td>P1126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml syringe with 27gauge needles</td>
			<td>BD PrecisionGlide</td>
			<td>309623</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 ml syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>305559</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 &#956;M PES syringe filter</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28145-501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grade 3 Qualitative Filter Paper Standard Grade, circle, 185 mm</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1003-185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primaria 35mm Easy Grip Style Cell Culture Dish</td>
			<td>Falcon/Corning</td>
			<td>353801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dishes, Sterile (100 mm x 15 mm)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>New Brunswick Galaxy 14 S CO2 Incubator</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>CO14S-120-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety Cabinet</td>
			<td>Nuare</td>
			<td>NU-425-400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-centrifuge&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-090-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioExpress GyroMixer Variable XL</td>
			<td>GeneMate</td>
			<td>R-3200-1XL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mastercycler Pro Thermal Cycler with control panel</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>950040015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMZ445 stereomicroscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MultiImage Light Cabinet with AlphaEase Software</td>
			<td>Alpha Innotech Corporation</td>
			<td>Discontinued</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute 200 proof Ethanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP2818-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP151-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate (Dibasic MW 142) Na2HPO4</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S374-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate (Monobasic MW 136) KH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5379-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S671-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride (KCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3911-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride (MgCl2)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2393-100g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride (CaCl2)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5670-100g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ambion Nuclease-Free Water</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>AM9938&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XY PCR Primer&#160;</td>
			<td>IDT</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial Acetic Acid</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A38-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediamine Tetraacetic Acid (EDTA)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP2482-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1% Ethidium bromide solution</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1302-10</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>GeneMate</td>
			<td>E-3120-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>367176-2.5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma Base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1503-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP Set, 100 mM Solutions</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Choice Taq polymerase with 10x Buffer</td>
			<td>Denville</td>
			<td>CB-4050-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>O4042-500</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluorMount-G</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Chloride (HCl)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A144212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA), powder, Fraction V, Heat shock isolation</td>
			<td>Bioexpress</td>
			<td>0332-100g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11965-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS), triple 100-nm filtered</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>03-600-511</td>
			<td>Heat-inactivate before using</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Use at 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO), Hybri-max, sterile-filtered</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VEGFR Tyrosine Kinase Inhibitor II - CAS 269390-69-4 - Calbiochem</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>676481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-Sox9 Antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB5535</td>
			<td>Use at dilution: 1:4,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat Anti-Mouse PECAM1 (CD31) Antibody</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>553370</td>
			<td>Use at dilution: 1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Cleaved Caspase-3 (Asp175) Antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9661S</td>
			<td>Use at dilution: 1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat E-cadherin / CDH1 Antibody (ECCD-2)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>13-1900</td>
			<td>Use at dilution: 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 3342, trihydrochloride, trihydrate</td>
			<td>Invitrogen (Molecular Probes)</td>
			<td>H1399</td>
			<td>Use at 2ug/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>712-165-153</td>
			<td>Use at dilution: 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>712-605-153</td>
			<td>Use at dilution: 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A31572</td>
			<td>Use at dilution: 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A21206</td>
			<td>Use at dilution: 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A21208</td>
			<td>Use at dilution: 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 conjugate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A31573</td>
			<td>Use at dilution: 1:500</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using ex vivo upright droplet cultures of whole fetal organs to study developmental processes during mouse organogenesis

자궁의 기관 형성을 조사하면 자궁 내에서 개발 배아에 의한 시약의 어려움에 태반 포유 동물에서 기술적으로 어려운 과정이다. 새로 개발 된 생체 똑바로 방울 문화 방법은 자궁 내에서 수행 연구에 매력적인 대안을 제공합니다. 생체 액적 배양 검사 및 다양한 차단 및 활성화 화합물의 사용을 통해 세포 상호 작용 및 다양한 신호 전달 경로를 조작하는 능력을 제공; 부가 적으로, 특정 기관의 개발에 다양한 약리 시약의 효과는 자궁 내 전신성 약물 투여의 부작용없이 조사 할 수있다. 시험 관내 시스템에서 다른 비교하여, 액적 배양 포유 동물 세포주에서 복제 될 수없는 삼차원 형태 형성 및 세포 - 세포 상호 작용을 연구하는 능력을 가능하게 할뿐만 아니라 (R)를 훨씬 적게 요구뿐만생체 전 다른 것보다 체외 프로토콜에 eagents. 본 논문은 방법의 효과를 입증하기 위해 전체 장기 면역 다음에 적절한 마우스 태아의 장기 해부 및 수직 방울 배양 기술을 보여줍니다. 생체 액적 배양법 유사한 생체 내에서 관찰되며, 생체 내 모델에서 배아 치 명성에 기인 달리 어려운 학습 과정을 연구하기 위해 이용 될 수 있는지에 대한 장기 구조의 형성을 허용한다. 모델 시스템과 같은 어플리케이션, 소분자 억제제는 고환 혈관의 형태 형성의 역할을 조사하기 위해 이용 될 것이다. 각 기관에 광범위하게 될 어떤 프로토콜 기관 특이 수정을 결정하기 위해 검토되어야하지만,이 생체 액적 배양법, 예컨대 폐 및 잠재적으로 다른 기타 태아 기관 시스템까지 확장된다. 이 기관 배양 물 시스템은 태아의 장기와 실험에 유연성을 제공하고, 결과 obtaineD 연구자들은 태아의 개발에 대한 통찰력을 얻을 도움이 될 것입니다이 기술을 사용.

생체 방울 문화는 하나, 같은 생식선으로 전체 기관을 조작하는 세포의 상호 작용과 역학을 공부하기. (1) E11.5의 생식선 방울 문화를 준비하는 방법을 단계별 방식으로 보여줍니다도 있습니다. 문화 프로토콜의 첫 번째 단계는 어머니 마우스 (그림 1A 및 1B)에서 배아 함유 자궁의 초기 제거를 포함한다. 어머니의 자궁을 제거 후, 자궁 벽 절단 및 배아 ?...

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Using Ex Vivo Upright Droplet Cultures of Whole Fetal Organs to Study Developmental Processes during Mouse Organogenesis

The&#160;ex vivo&#160;upright droplet culture is an alternative to current&#160;in vitro&#160;and&#160;in vivo&#160;experimental techniques. This protocol is easy to perform and requires smaller amounts of reagent, while permitting the ability to manipulate and study fetal vascularization, morphogenesis, and organogenesis.

사용<em&gt; 전의 VIVO</em&gt; 전체 태아 기관의 강직 한 방울 문화 마우스 기관 형성 기간 동안 발달 프로세스를 연구

Investigating organogenesis in utero is a technically challenging process in placental mammals due to inaccessibility of reagents to embryos that develop ...

using-ex-vivo-upright-droplet-cultures-whole-fetal-organs-to-study

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Using Ex Vivo Upright Droplet Cultures of Whole Fetal Organs to Study Developmental Processes during Mouse Organogenesis

12.4K 조회수.  Cincinnati Children's Hospital Medical Center. The ex vivo upright droplet culture is an alternative to current in vitro and in vivo experimental techniques. This protocol is easy to perform and requires smaller amounts of reagent, while permitting the ability to manipulate and study fetal vascularization, morphogenesis, and organogenesis.

비디오: Using Ex Vivo Upright Droplet Cultures of Whole Fetal Organs to Study Developmental Processes during Mouse Organogenesis

Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche

The pharyngeal mesoderm of developing embryos contributes to broad regions of head and heart musculature. We have developed a novel method to study head and heart progenitor cell development with pharyngeal arches (also known as branchial arches) ex vivo. Using this method, we have recently described that the second pharyngeal arch contains self-renewing heart progenitors and serves as a microenvironment for expansion of the progenitors during mouse heart development. The progenitor cells remain undifferentiated and expansive inside the arch, but quickly become functional cardiomyocytes as they migrate out of the arch. We also reported that first pharyngeal arch contains muscle progenitors giving rise to myotubes after leaving the arch. Here, we demonstrate the procedure for the dissection and ex vivo culture of first and second pharyngeal arches from developing mouse embryos. The method enables one to study head and heart progenitor/muscle development, including cardiomyocyte and myotube formation in detail ex vivo.

Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche

Here, we present a protocol to culture pharyngeal arches to study the biology of heart and muscle progenitor cells and their microenvironment.

인두 아치 전의 VIVO 문화는 심장과 근육 전구 세포와 그 틈새를 연구

The pharyngeal mesoderm of developing embryos contributes to broad regions of head and heart musculature. We have developed a novel method to study head ...

연구

발생학

Using Primary Neurosphere Cultures to Study Primary Cilia

The primary cilium is fundamentally important for the proliferation of neural stem/progenitor cells and for neuronal differentiation during embryonic, postnatal, and adult life. In addition, most differentiated neurons possess primary cilia that house signaling receptors, such as G-protein-coupled receptors, and signaling molecules, such as adenylyl cyclases. The primary cilium determines the activity of multiple developmental pathways, including the sonic hedgehog pathway during embryonic neuronal development, and also functions in promoting compartmentalized subcellular signaling during adult neuronal function. Unsurprisingly, defects in primary cilium biogenesis and function have been linked to developmental anomalies of the brain, central obesity, and learning and memory deficits. Thus, it is imperative to study primary cilium biogenesis and ciliary trafficking in the context of neural stem/progenitor cells and differentiated neurons. However, culturing methods for primary neurons require considerable expertise and are not amenable to freeze-thaw cycles. In this protocol, we discuss culturing methods for mixed populations of neural stem/progenitor cells using primary neurospheres. The neurosphere-based culturing methods provide the combined benefits of studying primary neural stem/progenitor cells: amenability to multiple passages and freeze-thaw cycles, differentiation potential into neurons/glia, and transfectability. Importantly, we determined that neurosphere-derived neural stem/progenitor cells and differentiated neurons are ciliated in culture and localize signaling molecules relevant to ciliary function in these compartments. Utilizing these cultures, we further describe methods to study ciliogenesis and ciliary trafficking in neural stem/progenitor cells and differentiated neurons. These neurosphere-based methods allow us to study cilia-regulated cellular pathways, including G-protein-coupled receptor and sonic hedgehog signaling, in the context of neural stem/progenitor cells and differentiated neurons.

The primary cilium is fundamentally important in neural progenitor cell proliferation, neuronal differentiation, and adult neuronal function. Here, we describe a method to study ciliogenesis and the trafficking of signaling proteins to cilia in neural stem/progenitor cells and differentiated neurons using primary neurosphere cultures.

차 섬모를 연구에 차 Neurosphere 문화를 사용하여

The primary cilium is fundamentally important for the proliferation of neural stem/progenitor cells and for neuronal differentiation during embryonic, ...

Whole-mount Clearing and Staining of Arabidopsis Flower Organs and Siliques

Due to its formidable tools for molecular genetic studies, Arabidopsis thaliana is one of the most prominent model species in plant biology and, especially, in plant reproductive biology. However, plant morphological, anatomical, and ultrastructural analyses traditionally involve time-consuming embedding and sectioning procedures for bright field, scanning, and electron microscopy. Recent progress in confocal fluorescence microscopy, state-of-the-art 3-D computer-aided microscopic analyses, and the continuous refinement of molecular techniques to be used on minimally processed whole-mount specimens, has led to an increased demand for developing efficient and minimal sample processing techniques. In this protocol, we describe techniques for properly dissecting Arabidopsis flowers and siliques, basic clearing techniques, and some staining procedures for whole-mount observations of reproductive structures.

Whole-mount Clearing and Staining of Arabidopsis Flower Organs and Siliques

In this protocol, we describe techniques for the proper dissection of Arabidopsis flowers and siliques, some basic clearing techniques, and selected staining procedures for whole-mount observations of reproductive structures.

전체-마운트 고 애기 꽃 기관 및 Siliques의 얼룩

Due to its formidable tools for molecular genetic studies, Arabidopsis thaliana is one of the most prominent model species in plant biology and, ...

Fetal Mouse Cardiovascular Imaging Using a High-frequency Ultrasound (30/45MHZ) System

Congenital heart defects (CHDs) are the most common cause of childhood morbidity and early mortality. Prenatal detection&#160;of the underlying molecular mechanisms of CHDs is&#160;crucial for inventing new preventive and therapeutic strategies. Mutant mouse models are powerful tools to discover new&#160;mechanisms&#160;and environmental stress modifiers that drive cardiac development and their potential&#160;alteration in CHDs. However, efforts to establish the causality of these putative contributors have been limited to histological&#160;and molecular studies&#160;in non-survival animal experiments, in which&#160;monitoring the key physiological and hemodynamic parameters is&#160;often absent. Live imaging technology has become an essential tool to establish the&#160;etiology of CHDs. In particular,&#160;ultrasound imaging can be used prenatally without surgically exposing the fetuses,&#160;allowing maintaining&#160;their baseline physiology while monitoring the impact of environmental stress&#160;on the hemodynamic and structural aspects of cardiac chamber development. Herein, we use the High-Frequency Ultrasound (30/45)&#160;system to examine the cardiovascular system in fetal mice at E18.5 in utero at the baseline and in response to prenatal hypoxia exposure. We demonstrate the feasibility of the system to measure cardiac chamber size, morphology, ventricular function, fetal heart rate, and umbilical artery flow indices, and their alterations in fetal mice exposed to systemic chronic hypoxia in utero in real time.

Fetal Mouse Cardiovascular Imaging Using a High-frequency Ultrasound 30/45MHZ System

High-frequency ultrasound imaging of the fetal mouse has improved imaging resolution and can provide precise non-invasive characterization of cardiac development and structural defects. The protocol outlined herein is designed to perform real-time fetal mice echocardiography in vivo.

태아 마우스 심장 혈관 이미징 높은 주파수 초음파 (30/45 m h Z) 시스템을 사용 하 여

Congenital heart defects (CHDs) are the most common cause of childhood morbidity and early mortality. Prenatal detection&#160;of the underlying molecular ...

Three-dimensional Organotypic Cultures of Vestibular and Auditory Sensory Organs

The sensory organs of the inner ear are challenging to study in mammals due to their inaccessibility to experimental manipulation and optical observation. Moreover, although existing culture techniques allow biochemical perturbations, these methods do not provide a means to study the effects of mechanical force and tissue stiffness during development of the inner ear sensory organs. Here we describe a method for three-dimensional organotypic culture of the intact murine utricle and cochlea that overcomes these limitations. The technique for adjustment of a three-dimensional matrix stiffness described here permits manipulation of the elastic force opposing tissue growth. This method can therefore be used to study the role of mechanical forces during inner ear development. Additionally, the cultures permit virus-mediated gene delivery, which can be used for gain- and loss-of-function experiments. This culture method preserves innate hair cells and supporting cells and serves as a potentially superior alternative to the traditional two-dimensional culture of vestibular and auditory sensory organs.

Three-dimensional organotypic cultures of the murine utricle and cochlea in optically clear collagen I gels preserve innate tissue morphology, allow for mechanical stimulation through adjustment of matrix stiffness, and permit virus-mediated gene delivery.

Vestibular 및 청각 감각 기관의 3 차원 Organotypic 문화

The sensory organs of the inner ear are challenging to study in mammals due to their inaccessibility to experimental manipulation and optical observation. ...

An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity

Spermatogenesis is the development of spermatogonia into mature spermatozoa in the seminiferous tubules of the testis. This process is supported by Sertoli cell junctions at the blood-testis barrier (BTB), which is the tightest tissue barrier in the mammalian body and segregates the seminiferous epithelium into two compartments, a basal and an adluminal. The BTB creates a unique microenvironment for germ cells in meiosis I/II and for the development of postmeiotic spermatids into spermatozoa via spermiogenesis. Here, we describe a reliable assay to monitor BTB integrity of mouse testis in vivo. An intact BTB blocks the diffusion of FITC-conjugated inulin from the basal to the apical compartment of the seminiferous tubules. This technique is suitable for studying gene candidates, viruses, or environmental toxicants that may affect BTB function or integrity, with an easy procedure and a minimal requirement of surgical skills compared to alternative methods.

An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity

Here, we present a protocol to assess the blood-testis barrier integrity by injecting inulin-FITC into testes. This is an efficient in vivo method to study blood-testis barrier integrity that can be compromised by genetic and environmental elements.

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Spermatogenesis is the development of spermatogonia into mature spermatozoa in the seminiferous tubules of the testis. This process is supported by ...

Analysis of Cardiac Chamber Development During Mouse Embryogenesis Using Whole Mount Epifluorescence

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection of mouse embryos and visualization of embryonic mouse ventricular chambers during heart development using ventricular specific fluorescent reporter knock-in mice (MLC-2v-tdTomato mice). Heart development involves a linear heart tube formation, the heart tube looping, and four chamber septation. These complex processes are highly conserved in all vertebrates. The mouse embryonic heart has been widely used for heart developmental studies. However, due to their extremely small size, dissecting mouse embryonic hearts is technically challenging. In addition, visualization of cardiac chamber formation often needs in situ hybridization, beta-galactosidase staining using LacZ reporter mice, or immunostaining of sectioned embryonic hearts. Here, we describe how to dissect mouse embryonic hearts and directly visualize ventricular chamber formation of MLC-2v-tdTomato mice using whole mount epifluorescent microscopy. With this method, it is possible to directly examine heart tube formation and looping, and four chamber formation without further experimental manipulation of mouse embryos. Although the MLC-2v-tdTomato reporter knock-in mouse line is used in this protocol as an example, this protocol can be applied to other heart-specific fluorescent reporter transgenic mouse lines.

We present the protocols to examine mouse heart development using whole mount epifluorescent microscopy on mouse embryos dissected from ventricular specific MLC-2v-tdTomato reporter knock-in mice. This method allows us to directly visualize each stage of the ventricular formation during mouse heart development without labor-intensive histochemical methods.

전체 산 Epifluorescence를 사용 하 여 마우스 Embryogenesis 동안 심장 챔버의 분석

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection of mouse embryos and visualization of embryonic mouse ventricular chambers during ...

Human Ex vivo Wound Model and Whole-Mount Staining Approach to Accurately Evaluate Skin Repair

Chronic non-healing wounds, which primarily affect the elderly and diabetic, are a significant area of clinical unmet need. Unfortunately, current chronic wound treatments are inadequate, while available pre-clinical models poorly predict the clinical efficacy of new therapies. Here we describe a high throughput, pre-clinical model to assess multiple aspects of the human skin repair response. Partial thickness wounds were created in human ex vivo skin and cultured across a healing time course. Skin wound biopsies were collected in fixative for the whole-mount staining procedure. Fixed samples were blocked and incubated in primary antibody, with detection achieved via fluorescently conjugated secondary antibody. Wounds were counterstained and imaged via confocal microscopy before calculating percentage wound closure (re-epithelialization) in each biopsy. Applying this protocol, we reveal that 2 mm excisional wounds created in healthy donor skin are fully re-epithelialized by day 4-5 post-wounding. On the contrary, closure rates of diabetic skin wounds are significantly reduced, accompanied by perturbed barrier reformation. Combining human skin wounding with a novel whole-mount staining approach allows a rapid and reproducible method to quantify ex vivo wound repair. Collectively, this protocol provides a valuable human platform to evaluate the effectiveness of potential wound therapies, transforming pre-clinical testing and validation.

Here we demonstrate an optimized technique for assessing wound repair using ex vivo human skin combined with a whole-mount staining approach. This methodology provides a pre-clinical platform for the evaluation of potential wound therapies.

인간 Ex 생체 내 상처 모델 및 피부 수리를 정확하게 평가하기 위한 전산 염색 접근법

Chronic non-healing wounds, which primarily affect the elderly and diabetic, are a significant area of clinical unmet need. Unfortunately, current chronic ...

Ex Utero Culture of Mouse Embryos from Pregastrulation to Advanced Organogenesis

Postimplantation mammalian embryo culture methods have been generally inefficient and limited to brief periods after dissection out of the uterus. Platforms have been recently developed for highly robust and prolonged ex utero culture of mouse embryos from egg-cylinder stages until advanced organogenesis. These platforms enable appropriate and faithful development of pregastrulating embryos (E5.5) until the hind limb formation stage (E11). Late gastrulating embryos (E7.5) are grown in rotating bottles in these settings, while extended culture from pregastrulation stages (E5.5 or E6.5) requires a combination of static and rotating bottle cultures. In addition, sensitive regulation of O2 and CO2 concentration, gas pressure, glucose levels, and the use of a specific ex utero culture medium are critical for proper embryo development. Here, a detailed step-by-step protocol for extended ex utero mouse embryo culture is provided. The ability to grow normal mouse embryos ex utero from gastrulation to organogenesis represents a valuable tool for characterizing the effect of different experimental perturbations during embryonic development.

Ex Utero Culture of Mouse Embryos from Pregastrulation to Advanced Organogenesis

An enhanced platform for whole-embryo culture allows continuous and robust ex utero development of postimplantation mouse embryos for up to six days, from pregastrulation stages until advanced organogenesis. In this protocol, we detail the standard procedure for successful embryo culture using static plates and rotating bottle systems.

엑스 우테로 사전 배후에서 고급 유기발생에 이르는 마우스 배아의 배양

Postimplantation mammalian embryo culture methods have been generally inefficient and limited to brief periods after dissection out of the uterus. ...

Isolation of Whole Cell Protein Lysates from Mouse Facial Processes and Cultured Palatal Mesenchyme Cells for Phosphoprotein Analysis

Mammalian craniofacial development is a complex morphological process during which multiple cell populations coordinate to generate the frontonasal skeleton. These morphological changes are initiated and sustained through diverse signaling interactions, which often include protein phosphorylation by kinases. Here, two examples of physiologically-relevant contexts in which to study phosphorylation of proteins during mammalian craniofacial development are provided: mouse facial processes, in particular E11.5 maxillary processes, and cultured mouse embryonic palatal mesenchyme cells derived from E13.5 secondary palatal shelves. To overcome the common barrier of dephosphorylation during protein isolation, adaptations and modifications to standard laboratory methods that allow for isolation of phosphoproteins are discussed. Additionally, best practices are provided for proper analysis and quantification of phosphoproteins following western blotting of whole cell protein lysates. These techniques, particularly in combination with pharmacological inhibitors and/or murine genetic models, can be used to gain greater insight into the dynamics and roles of various phosphoproteins active during craniofacial development.

The protocol presents a method for isolating whole cell protein lysates from dissected mouse embryo facial processes or cultured mouse embryonic palatal mesenchyme cells and performing subsequent western blotting to assess phosphorylated protein levels.

마우스 안면 과정으로부터 전체 세포 단백질 용해물을 분리하고 포스포단백질 분석을 위해 배양된 팔라탈 중간엽 세포

Mammalian craniofacial development is a complex morphological process during which multiple cell populations coordinate to generate the frontonasal ...