The authors were supported by: a CancerFree KIDS Research Grant, a March of Dimes Basil O&#8217;Connor Starter Scholar Award (#5-FY14-32), a Cincinnati Children&#8217;s Hospital Medical Center (CCHMC) Trustee Grant Award; a CCHMC Research Innovation and Pilot Funding Award; and CCHMC developmental funds. Authors also acknowledge the Capel laboratory for the initial optimization of this technique.

Alle Mäuse, die in diesen Studien verwendet wurden, waren CD-1-Mäuse von Charles River Laboratories erhalten. Vorherige Kulturexperimenten auch andere Stämme, wie C57BL / 6J (Daten nicht gezeigt) durchgeführt, jedoch jeder Stamm verwendet werden. Pregnant erwachsenen Frauen waren etwa 2-3 Monate alt und wurden durch CO 2 Inhalation durch Genickbruch folgte und bilaterale Thorakotomie vor Embryoentnahme euthanasiert. Die Mäuse wurden in Übereinstimmung mit NIH-Richtlinien untergebracht und experimentelle Protokolle wurden von der Institutional Animal Care und Verwenden Ausschuss der Cincinnati Kinder-Hospital Medical Center bestätigt. 1. Herstellung des Instruments, Kultur, Medien und Gerichte <ol><li> Bereiten Sie eine 70% Ethanollösung. Autoklaven entionisiertem Wasser (für die Herstellung befeuchteten Kammern und für die Herstellung / Verdünnung Lösungen). Sterilisieren Dissektion Werkzeugen (Zangen, Scheren und 27 G-Nadel Spritzen) durch Spritzen nach unten mit 70% Ethanol. </li><li> Bereiten10X Phosphat gepufferter Salzlösung (PBS) mit Calcium und Magnesium (80 g NaCl, 2 g KCl, 14,4 g Na 2 HPO 4, 2,4 g KH 2 PO 4, 6,75 ml 1 M CaCl 2, 3,75 ml 1 M MgCl 2 ). Stir in 1 L sterile autoklaviertem Wasser zu lösen und dann mit Filterpapier filtern. Verdünnen Sie das 10-fache mit Wasser auf 1 × PBS zu machen. </li><li> Wärme inaktivieren fötalem Rinderserum (FBS) bei 55 ° C für 30 min und Filter sterilisieren mit einem 0,22 &amp; mgr; m Spritzenfilter filtriert. </li><li> Bereiten Sie 38 ml 1X komplettem Kulturmedium (genannt kompletten DMEM, cDMEM), bestehend aus Dulbeccos modifiziertem Eagle Medium (DMEM), 10% gefiltert hitzeinaktiviertem FBS und 1/100 Verdünnung von Penicillin-Streptomycin Lager. Dies sollte in der Regel frisch verwendet werden, kann jedoch bei 4 ° C für 1 Monat gelagert werden. </li><li> Rekonstituieren Sie den VEGFR Tyrosinkinase-Inhibitor II (TKI II) in DMSO für eine Stammkonzentration von 5 mg / ml, und verdünnte Aktie mit cDMEM um eine Arbeitslösung zu machen. Die endgültige conZentrierung für diese Untersuchung ist 1,875 &amp; mgr; g / ml in cDMEM. Gemäß den Empfehlungen der Gesellschaft sind Stammlösungen für bis zu 6 Monate bei -20 ° C stabil. Wie für Arbeitslösungen, machen frisch und verwenden Sie am selben Tag. Anmerkung: Die Konzentration dieses Wirkstoffs in der Arbeitslösung sollte das Zweifache höher als die gewünschte Endkonzentration (da sie zweifach in dem Tröpfchen zu verdünnen). Zur gleichen Zeit, bereiten Sie das gleiche Volumen cDMEM das gleiche Volumen an DMSO für die &quot;Kontrolle&quot; Behandlung enthält. </li><li> Bereiten Sie die tail Aufschlussreagenzien (50 mM NaOH, 1 M Tris-HCl [pH 8,0]), die getrennt in destilliertem Wasser. </li><li> Machen Sie eine 25 uM Lager der XY-PCR-Primer (XY Vorwärts 5&#39;-TGA AGC TTT TGG CTT TGA G-3 &#39;und XY umge 5&#39;-CCG CTG CCA AAT TCT TTG G-3&#39;) zusammen in Nuklease-freies Wasser. </li><li> Bereiten 50X TAE-Puffer (242 g Trizma Basis, 57,1 ml Essigsäure, 100 ml 0,5 M EDTA, pH 8,5, und Wasser bis zu 1 l final Volumen). Bereiten 1X TAE Laufpuffer (20 ml 50X TAE verdünnt mit Wasser auf 1 L Gesamtvolumen). </li><li> Um ein 2,5% Agarose-Lösung (0,625 g Agarose, 0,5 ml 50X TAE-Puffer, 24,5 ml Wasser), Wärme Agarose-Lösung in der Mikrowelle zum Kochen zu schaffen, dann abkühlen lassen, bis etwa 55 bis 65 ° C (in der Lage zu berühren). Nach dem Abkühlen, fügen Sie 2 ul 1% Ethidiumbromidlösung, und gießen Gel. VORSICHT! Ethidiumbromid ist mutagen und teratogen; benutzen Sie bitte Nitril-Handschuhen und Sicherheitsprotokoll bei der Handhabung. Alternativ können andere möglicherweise weniger toxisch Gel Trennmittel oder Farbstoffe verwendet werden. </li><li> Vorbereitung Blocking Solution (PBS mit 0,1% Triton X-100, 10% fötales Rinderserum [FBS] und 3% Rinderserumalbumin [BSA]) für die Immunfluoreszenz. </li><li> Vorbereitung Waschlösung (PBS mit 0,1% Triton X-100, 1% FBS, 3% BSA) für Immunfluoreszenz. </li><li> Vorbereitung PBTx (PBS mit 0,1% Triton X-100) für die Immunfluoreszenz. </li><li> Bereiten Sie die Inkubationskammern für culture. Füllen großen (Durchmesser 100 mm) Petrischalen mit 35 ml autoklaviertem Wasser. Ort in der Nähe, wo Dissektion und Kulturen durchgeführt. </li></ol> 2. Isolierung von fetalen Hoden aus Mus musculus <ol><li> Jeden Morgen Überprüfen Sie die weibliche Maus für vaginale Steckern. Uhr am Tag, an dem die Vaginalpfropf erkannt wird gilt als E0.5. Euthanize der schwangeren weiblichen Maus am E11.5, im Einklang mit genehmigten Tier Protokolle. </li><li> Sprühen Sie die Mausunterleib mit 70% Ethanol. </li><li> Öffnen Sie die Bauchhaut und Bauchfell mit einem V-förmigen Einschnitt mit einer feinen Schere und ziehen Sie Klappe des Gewebes zu inneren Organen aus. </li><li> Auffinden der Eierstöcke an beiden Enden des Uterushorns. Mit einer Schere, schneiden Sie am Eierstock und das Bindegewebe um die Gebärmutter, die die Embryonen aus dem Körper der Mutter zu trennen. </li><li> Öffnen Sie die Uteruswand durch leichtes Schneiden der Seite gegenüber der Plazenten, Freilegung der Dottersäcke. Achten Sie darauf, puncture Dottersack zu beschädigen oder zu verlieren Embryonen zu vermeiden. </li><li> Schneiden Sie in der Nähe der Plazenten, um den Embryo enthaltenden Dottersäcke zu entfernen und legen Sie sie in eine Schale mit PBS mit Calcium und Magnesium. Die Anwesenheit von Calcium- und Magnesiumionen wird dazu beitragen, Zelladhäsionsmoleküle, um Gewebe-Architektur erhalten und zu verhindern, dass das Gewebe aus Festhalten an den Dissektion Werkzeuge. </li><li> Mit einer Pinzette, entfernen Sie den Dottersack und Amnion aus dem Embryo durch vorsichtiges Durchstechen der Dottersack, ein Loch in dem der Embryo kann gleiten erstellen. Sobald der Embryo außerhalb der Dottersack, die Nabelschnur. </li><li> Von diesem Punkt an, mit einem Mikroskop in einem sterilen Gewebekultur Haube. Entfernen Sie den Kopf des Embryos und entsorgen durch Kneifen mit einer Pinzette auf beiden Seiten des Halses. </li><li> Entfernen Sie den Schwanz aufnehmen und in neue Mikrozentrifugenröhrchen für die XY-PCR-Analyse zum Geschlecht des Embryos zu bestimmen. Hinweis: Obwohl es optimal ist Kultur Gonaden so bald wie möglich nach der Ernte ist es auch poslich, Schwanz-DNA zu entfernen und führen XX / XY Genotypisierung vor Kultur, so dass das Geschlecht jedes Embryos bekannt ist und nur das gewünschte Geschlecht muss kultiviert werden. Während die Genotypisierung getan wird, können Embryonen getrennt gehalten werden (so dass sie können aufgespürt werden) bei 4 ° C oder auf Eis, bis sie zur Kultur. Ein Nachteil ist, dass diese Zeit draußen in utero oder Kulturbedingungen kann möglicherweise während der Kultur beeinflussen Lebensfähigkeit für Kultur oder folgende Entwicklung. </li><li> Sichern Sie den Embryo in Rückenlage gegen den Boden der Kulturschale durch Pinning den Achseln der Embryo mit einer Pinzette (in der Regel die Zange in der schwachen Hand gehalten). Pflegen Sie diese Zange in Ort, um den Embryo während der gesamten Dissektion Prozess noch halten. </li><li> Mit anderen Pinzette, entfernen Sie Haut, die Bauch und entfernen Sie vorsichtig Leber, Darm und anderen Organen zu entlarven zurückKörperWand. </li><li> Als die Gonaden werden auf der hinteren Körperwand auf beiden Seiten der dorsalen Aorta befinden,ein großes Blutgefäß entlang der Mittellinie des Körpers läuft, Schaufel unter dem Urogenitalleiste mit geschlossenen Pinzette und entfernen Sie die Urogenitalleiste durch Öffnen der Pinzette und anheben. Da die Keimdrüsen werden lose an der Wand befestigt werden, darauf achten, nicht zu schnell, ohne dass diese Verbindungen hochziehen oder die Gonaden können strecken, was zu Schäden an den Organen. </li><li> Bewegen Sie den Urogenitalleiste in cDMEM in einer Schale, um Gewebe zu Medien akklimatisieren. </li><li> Trennen Sie die Gonaden-Mesonephros-Komplex aus dem Rest der Urogenitalleiste mit 27 G Nadeln. Verwenden Sie eine Nadel durch Drücken abgeholzt, und mit der anderen, um das Gewebe richtig zu führen, um eine optimale Trennung zu ermöglichen. Vermeiden Sie das Sägen Bewegung gegen die Schale unten, so scharf, Nadeln Scherben aus Kunststoff, die mit dem Gewebe haften kann. Achten Sie auf die Mesonephros vollständig auf die Gonaden angebracht halten. </li></ol> 3. Kultivierung der Gonade mit einem niedermolekularen Inhibitor <ol><li> Stellen Sie zwei 20 μl Pipetten zu je 15 ul. Schneiden Sie etwa 1-2 mm an einer der Sperrpipettenspitzen mit einem sauberen, sterilisiert Rasierklinge für die Übertragung der Keimdrüsen und der Zugabe von Steuer cDMEM, während die andere Pipette werden ausschließlich für Arzneimittel behandelten cDMEM verwendet werden. </li><li> Line up Gonaden mit ihren langen Achse parallel zur Pipettenspitze so dass sie leicht mit dem Cut-off-Spitze pipettiert werden. Seien Sie vorsichtig, der Gonaden Festhalten an der Innenseite der Pipettenspitze. </li><li> Kennzeichnen einen Seite als Steuertröpfchens und der andere als der wirkstoffhaltigen Tröpfchen. Nur zwei Tröpfchen auf einem 35 mm Schalendeckel passen. Stellen Sie sicher, dass die Etiketten auf Deckel passen Sie die Etiketten auf Schwanzgewebe haltigen Mikrozentrifugenröhrchen. </li><li> Pipette 15 ul cDMEM die ein einzelnes Gonade in einem Tröpfchen auf dem Deckel einer kleinen (35 mm) Petrischale (verwenden nur die Deckel, wie die Böden sind zu groß, um in einem befeuchteten Petrischale Kammer passen). Legen Sie zwei separate gonad haltige Tröpfchen auf beiden Seiten der Schale, gut getrennte from einander. Check unter dem Mikroskop, um sicherzustellen, dass die Keimdrüsen an die Tröpfchen übertragen. </li><li> Auf den als Steuer bezeichnet Tröpfchen, fügen Sie eine zusätzliche 15 ul cDMEM enthält DMSO (in Schritt 1.5 gemacht), um ein Tröpfchen mit einer 30 &amp; mgr; l Gesamtvolumen. Verwenden Sie nur die &quot;Kontrolle&quot; Pipette, die nicht in Kontakt mit den Drogen. </li><li> Auf die andere Tröpfchen (Arzneimittel behandelten Probe), fügen Sie 15 ul TKI-II-haltige cDMEM, um ein Tröpfchen mit einer 30 &amp; mgr; l Gesamtvolumen. Verwenden Sie nur das für Arzneimittel behandelten Proben bezeichnet Pipette. </li><li> Mit der Pipette, verteilt die Tröpfchen in einem expandierenden kreisförmigen Muster, bis sie etwa 15 bis 18 mm im Durchmesser und die Gonaden wird etwa in der Mitte befindet. Richten Sie die Gonaden, so dass es auf seiner Seite liegt und die Gonaden und Mesonephros sind leicht zu unterscheiden. Richten Sie die Lunge, so dass die zwei Lappen lag flach. <ol><li> Obwohl Tropfendurchmesser können leicht variieren, sicherzustellen, dass Gonaden nicht floating und werden durch Oberflächenspannung gehalten. Stellen Sie sicher, dass Tröpfchen sich nicht gegenseitig oder die Seite des Deckels berühren. Ohne die Oberflächenspannung, werden die Organe auf den Deckel während der Kultur zu wachsen und zu glätten, so verzerren Organmorphologie. </li></ol></li><li> Vorsichtig die Kulturschalendeckel enthält, der Tröpfchen aufrecht auf der Oberfläche des Wassers in der großen (100 mm) Befeuchter Schale. Sicherzustellen, dass keine Luftblasen unter dem Boden des Deckels eingeklemmt, und dass es auf der Oberfläche des Wassers liegen flach. Kehren Sie nicht die Deckel und achten Sie darauf, lassen Sie kein Wasser berühren Sie die Oberseite des Deckels, wo die Tropfen entfernt. </li><li> Um einen kleinen, feuchten Kammer zu schaffen, sofort mit dem Deckel des größeren Befeuchter Teller abdecken, um die Gonaden Kulturen einzuschließen. Handeln, so schnell wie möglich, die Verdunstung von Medien zu minimieren. Stellen Sie sicher, dass die kleinere Schüssel hat Raum zwischen ihm und dem Deckel der größeren Schüssel frei bewegen; Andernfalls kann es zu Kondensation einer Dichtung und b zu machenSchloss Luftaustausch an das Gewebe. </li><li> Sobald zwei kleine Deckel werden in die Kammer gebracht, sofort platzieren die Kammer in den Inkubator. Die Tröpfchen Kulturen für 48 Stunden in einem befeuchteten CO 2 -Inkubator bei 37 ° C. </li></ol> 4. Polymerase-Kettenreaktion zur Bestimmung des Geschlechts des Embryos <ol><li> Fügen Sie die embryonale Schwänze zu Boden eines 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen. </li><li> Hinzufügen zu jedem Röhrchen wurden 200 ul 50 mM NaOH. </li><li> Stellen bei 95 ° C für 15 Minuten oder bis die Gewebe vollständig gelöst ist. </li><li> In 50 ul 1 M Tris-HCl und Wirbel leicht und kurz. </li><li> In einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen, einen frischen PCR-Mastermix durch Multiplizieren jedes Volumen durch die Gesamtzahl der Proben: 0,5 ul 25 uM Primer-Lösung, 2,5 ul 10x Taq-Puffer, 0,5 ul 10 mM dNTPs (Nukleotide), 19,3 ul nuclease- freies Wasser, 0,2 &amp; mgr; l DNA-Taq-Polymerase. Gut mischen. </li><li> In 23ul PCR-Master-Mix in Röhrchen gegeben, 3 ul Lysat verdaut tails der PCR. </li><li> Flick Rohre, um sie zu mischen, dann einen kurzen Spin, um die Proben auf den Boden des Röhrchens zu bringen. </li><li> Führen XY (Short) PCR-Programm (Tabelle 1). </li><li> Laden Sie die Proben (mit 5-fach-Farbstoff) und Leiter in einem 2,5% igen Agarosegel in 1 × TAE-Puffer. </li><li> Führen Sie die Agarose-Gelelektrophorese, bis XX und XY Bands aufgelöst werden kann. </li><li> Bild das Gel mit UV-Licht und Bilderfassung. </li><li> Analyse der X-Chromosom-spezifischen vs Y-Chromosom-spezifischen Banden (X Chromosom = 331 Basenpaaren [bp] und XY = 302 bp) 13; XY (männlich) Proben werden zwei Banden von 331 und 302 bp aufweisen, während XX (weiblich) Proben wird als eine einzelne 331 bp-Bande erscheinen. </li></ol> 5. Ganze Berge Orgel Immunfluoreszenz Tag 1: <ol><li> Entfernen Sie die Gonaden aus der Kultur mit einem 1000 ul Pipette mit einem Cut-off Spitze. Falls gewünscht, kann sie in derin eine Schüssel mit PBS zu waschen Medien und Reagenzien gelegt. Legen Sie in PBS in einem 0,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Der kleinere Schlauchgröße wird Reagenzien zu sparen und machen es einfacher, den Überblick über Proben in der Röhre zu halten. <ol><li> Achten Sie darauf, Kontrolle und behandelten Proben sowie XX und XY Proben zu halten, in getrennten Röhren und entfernen Sie sie aus der Kultur mit getrennten Gruppen von Pipetten, um potenzielle Wirkstoff Kontamination zu vermeiden. </li></ol></li><li> Zweimal mit PBS waschen Sie die Gonaden. Von diesem Punkt an, kann dieses Protokoll 1X PBS verwenden ohne Calcium und Magnesium. Um sie zu waschen, damit die Keimdrüsen, auf den Boden des Rohres (durch die Schwerkraft) sinken und dann die Flüssigkeit über. Seien Sie vorsichtig, nicht zu verlieren Gonaden durch Pipettieren zu nah an ihnen. </li><li> Zu entfernen, so viel wie möglich von PBS Rohres. Fügen Sie 250 ul 4% Paraformaldehyd in PBS, das 0,1% Triton X-100, und lassen inkubieren O / N bei 4 ° C auf einer Wippe. Alternativ kann diese Fixierung für 2 h bei 4 ° C auf einem Schüttler durchgeführt werden. VORSICHT! Parafor-Formaldehyd ist eine giftige Substanz, so folgen Sie Sicherheitsprotokoll bei der Handhabung. </li></ol> Tag 2: <ol start="4"><li> Zweimal Spülen Sie die Gonaden in 250 ul PBTx bei RT. </li><li> 3 Mal Waschen Sie die Gonaden mit 250 ul PBTx für jede 10 min bei RT auf einer Wippe. </li><li> Blockieren die Gonaden mindestens 1 Stunde in 250 ul Blockierungslösung bei RT auf einer Wippe. </li><li> Färben die Gonaden O / N bei 4 ° C auf einer Wippe in 250 ul primären Antikörper in Blockierungslösung verdünnt. </li></ol> Tag 3: <ol start="8"><li> Zweimal Spülen Sie die Gonaden in 250 ul Waschlösung. </li><li> 3-mal mit 250 ul Waschlösung je 10 min bei RT auf einem Schüttler waschen den Gonaden. </li><li> Sperrung der Gonaden 1 h in 250 ul Blocking Solution bei RT auf einer Wippe. </li><li> Decken Sie die Mikrozentrifugenröhrchen mit Aluminiumfolie, um fluoreszierende Sekundärantikörper vor Licht zu schützen. </li><li> Inkubieren Sie die Gonaden 2-4 h bei RT auf arocker in 250 ul sekundären Antikörper in Blockierungslösung enthält Hoechst 33342. Alternativ verdünnt, führen sekundäre Antikörper und Hoechst 33342 Inkubation O / N bei 4 ° C auf Wippe. </li><li> Zweimal Spülen Sie die Gonaden in 250 ul PBTx. </li><li> 3 Mal Waschen der Gonaden in 250 ul PBTx für jede 10 min bei RT auf einer Wippe. </li><li> Unter Verwendung eines Cut-off-Pipettenspitze, übertragen Gonaden auf einen Objektträger mit minimaler Flüssigkeit. Entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit mit Pipette, aber stellen Sie sicher, dass Gewebe trocknet nicht aus. </li><li> Richten Sie die Gonaden mit einer Pinzette in gewünschter Weise, und schnell einen Tropfen Eindeckmedium auf die Gonaden auf dem Objektträger zu montieren. Sicherstellen, dass die Befestigungsmittel Mäntel alle Proben komplett; ist es wichtig zu verhindern, dass Proben austrocknen. </li><li> Verwenden Deckgläser (Nummer 1.5-Stil) von geeigneter Größe, um sanft bedecken Proben. Lassen Sie die Montage Medien Ausbreitung auf die gesamte Oberfläche des Deckglases zu kontaktieren. Falls erforderlich, sehr leicht auf den Ecken des Deckglases, so dass drückenes gibt keine großen Luftblasen. </li><li> Verschließen Sie die Dias mit klarem Nagellack an den Rändern um die Verdampfung der Befestigungsmittel zu reduzieren. Shop gerahmte Dias im Dunkeln bei 4 ° C. </li></ol>

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Biol. 927, 479-488 (2013).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+production+of+functional+sperm+in+cultured+neonatal+mouse+testes.">In vitro production of functional sperm in cultured neonatal mouse testes.</a> Nature. 471, 504-507 (2011).</li><li>Gohbara, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+murine+spermatogenesis+in+an+organ+culture+system.">In vitro murine spermatogenesis in an organ culture system.</a> Biol. Reprod. 83, 261-267 (2010).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Diese Studie zeigt eine ex vivo ganze Organ Tröpfchenmethode, die viele mögliche Anwendungen für die Untersuchung der fetalen Entwicklung hat. Diese Technik kann für mehrere Organe der Forscher verwendet werden und erlaubt es, biologischer Fragestellungen, die schwierig zu prüfen unter Verwendung von in vivo-Vorgehensweisen, werden wegen Unzugänglichkeit von Embryonen und Potential embryonaler Letalität adressieren. Diese Kultur-Methode hat zusätzliche Vorteile gegenüber anderen I...

Organregeneration in vivo beim Menschen ist sehr begrenzt; daher, Tissue Engineering, die Entwicklung von Geweben und Organen aus einzelnen Zellen durch eine Vielzahl gespendet, wird immer eine attraktive potenzielle Therapie für Organersatz. Doch für diese therapeutische Strategie, um erfolgreich zu sein, Faktoren und zellulären Interaktionen in Morphogenese der Orgel beteiligt sind, müssen gründlich untersucht werden, und gut verstanden. Aufgrund der Unfähigkeit zur Entwicklung spezifischer Organe mit herkömmlichen Ansätzen zu untersuchen, haben die Forscher alternative gesamten Embryo oder ganze Organkulturen gedreht. Kalaskar et al. 1 haben, in utero Entwicklung gezeigt, dass ex vivo ganze Embryokultur liefert vergleichbare Ergebnisse (in 58% der kultivierten Embryonen), was darauf hindeutet, dass die Ex-vivo-Kulturverfahren sind eine praktikable Alternative zur Organstudien. Eine individualisierte Organkultursystem, wie dieses ex vivo droplet Kultursystem ermöglicht eine ganze Organ Analyse unabhängig von systemischen Wirkungen, während eine Betätigung eines spezifischen Signalweg oder zellulären Wechselwirkungen durch Zugabe pharmakologische Reagenzien oder Antikörpern. Traditionell wurde die Untersuchung der fetalen Organentwicklung, transgene und Knockout-Maus Technologien beschränkt, die neben pharmakologische Reagenzien maternal geliefert. Allerdings gibt es technische Probleme im Zusammenhang mit diesen Techniken und Behandlungen in vivo; esten betrifft kreisen um die Effekte der Beeinflussung verschiedener Organe gleichzeitig, was oft in der embryonalen Letalität. Eine weitere Sorge der Studien manipulieren fetale Entwicklung pharmakologisch ist der mütterliche Einfluss von Drogen auf die embryonale Entwicklung in utero (zB mütterlichen Stoffwechsel des Medikaments, bevor sie den Embryo erreicht), und wenn eine solche Reagenzien können durch die plazentagängig ist. Die ganze Organkultur-Technik beschrieben,Hier wurde aus einem Protokoll zuerst durch Maatouk et al. 2, bei dem ganze fetalen Gonaden in ex vivo aufrecht Tröpfchenkulturen inkubiert angepasst. Ein wesentlicher Vorteil des Kultivierens fetalen Gonaden ist, dass niedermolekulare Inhibitoren können leicht Zugriff auf das ganze Organ durch einfache Diffusion. . DeFalco et al haben gezeigt, dass die Nutzung dieser ex vivo Tröpfchenkulturverfahren in Verbindung mit niedermolekularen Inhibitoren können verwendet werden, um zu studieren Signalprozessen und Interaktionen während Gonadenreifung 3 auftretende werden; Diese Verfahren würden aufgrund technischer Herausforderungen schwierig, in vivo zu untersuchen (zB Durchgang von Medikamenten durch die Plazenta oder Letalität, die mehrere Organe mit genetischen oder pharmakologischen Ansätzen). Die Tropfenkultur ist nicht nur eine Verbesserung in bestimmten Aspekten auf die in utero Experimente, aber es ist auch eine Verbesserung gegenüber in vitro und ex vivo Systemen. Die Verwendung von Zelllinien zur Morphogenese zu studieren, ist äußerst schwierig, da sie nicht über die verschiedenen Zelltypen, nicht über eine kritische extrazellulären Matrix (ECM) Komponenten, die die Bildung von Organarchitektur zu ermöglichen, und kann Artefakte in Signalkaskaden aufweisen. Obwohl Tissue Engineering hat signifikante Verbesserungen bei der Schaffung von Gerüsten Simulation ECM gemacht, der Mangel an Wissen in Bezug auf die Signale von jedem Zelltyp während der Organogenese erforderlich macht es schwierig, ein Organsystem in vitro zu bauen. Andere ex vivo-Systeme wurden bereits eingerichtet worden, um die Organogenese zu studieren, oder genauer gesagt die Morphogenese und sehr erfolgreich für die Bildgebung von fötalen Organen in Agar 4 gewesen, Transwells 5, Filter 6 und anderen Gerüst Matrizen 7,8. Der Vorteil des Tröpfchens Kultursystems ist, dass es die Untersuchung der Morphogenese durch Bereitstellen der Fähigkeit, weniger Reagenzien, die o sind, zurückgegriffenften teuer, sondern auch was die Orgel Oberflächenspannung, die wichtig für das Wachstum und Signalisierungsfunktionen 9 ist. Bei der Maus findet Anfangs Hoden Morphogenese zwischen embryonalen (E) inszeniert E11.5 und E13.5; diese Stufen umfassen die optimale Zeitfenster für die Prüfung Faktoren, die geschlechtsspezifische Differenzierung beeinflussen. Unter den kritischen Prozessen, die während testis Bildung auftreten, sind die Erzeugung von Testis Kabel Architektur und die Bildung einer Hoden-spezifische vaskuläre Netzwerk. Verwendung dieses ex vivo ganze Organ Tröpfchenkultursystem ist in der Lage, eine männlich-spezifische Vaskularisierung verändern und hemmen testis Morphogenese durch die Verwendung eines niedermolekularen Inhibitor blockiert die Aktivität der Rezeptoren für vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF); VEGF-vermittelte vaskuläre Remodeling ist entscheidend für die Hodenentwicklung 10-12. Diese Technik kann erfolgreich auf andere Organe angewendet werden und kann bestimmten ZeitzielFenstern der Entwicklung. Ganzkörper-Halterung Organ Bildgebung ermöglicht die Visualisierung von lebenswichtigen Strukturen sowie strukturelle und zelluläre Veränderungen nach der Verabreichung verschiedener Inhibitoren resultieren. Wichtig ist, dass dieses System den Vorteil, dass der Forscher können potentielle verwirrende Wirkungen von Arzneimittelverabreichung mütterlichen oder systemischen Störungen beim in vivo Zielgen Strategien umgehen. Somit kann diese ganzen Organs ex vivo Tröpfchenkultursystem die Fähigkeit, die Wechselwirkung und die Signalisierung, die spezifisch in bestimmte Organe während der fetalen Entwicklung auftreten Verständnis deutlich zu verbessern.

<table><tbody><tr><td>Superfrost Plus Microscope Slides</td><td>Fisherbrand</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Cover Glasses: Squares (22 mm x 22 mm, No. 1.5)</td><td>Fisherbrand</td><td>12-541B</td><td></td></tr><tr><td>Sally Hansen Xtreme Wear Nail Polish, Invisible</td><td>Sally Hansen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>8-Strip 0.2 ml PCR Tubes &amp;amp; Detached Flat Caps</td><td>GeneMate</td><td>T3218-1</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman L P1,000L, P200L, P20L, P10L, P2L</td><td>Gilson</td><td>FA10006M, FA10005M, FA10003M, FA10002M, FA10001M</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Forceps</td><td>FST</td><td>91150-20</td><td></td></tr><tr><td>Fine Scissors</td><td>FST</td><td>91460-11</td><td></td></tr><tr><td>Posi-Click 1.7 ml microcentrifuge tubes</td><td>Denville</td><td>C2170</td><td></td></tr><tr><td>Posi-Click 0.6 ml microcentrifuge tubes</td><td>Denville</td><td>C2176</td><td></td></tr><tr><td>10 &amp;mu;l SHARP Precision Barrier Tips</td><td>Denville</td><td>P1096FR</td><td></td></tr><tr><td>20 &amp;mu;l SHARP Precision Barrier Tips</td><td>Denville</td><td>P1121</td><td></td></tr><tr><td>200 &amp;mu;l SHARP Precision Barrier Tips</td><td>Denville</td><td>P1122</td><td></td></tr><tr><td>1,000 &amp;mu;l SHARP Precision Barrier Tips</td><td>Denville</td><td>P1126</td><td></td></tr><tr><td>1 ml syringe with 27 gauge needles</td><td>BD PrecisionGlide</td><td>309623</td><td></td></tr><tr><td>10 ml syringe</td><td>BD</td><td>305559</td><td></td></tr><tr><td>0.2 &amp;mu;M PES syringe filter</td><td>VWR</td><td>28145-501</td><td></td></tr><tr><td>Grade 3 Qualitative Filter Paper Standard Grade, circle, 185 mm</td><td>Whatman</td><td>1003-185</td><td></td></tr><tr><td>Primaria 35 mm Easy Grip Style Cell Culture Dish</td><td>Falcon/Corning</td><td>353801</td><td></td></tr><tr><td>Petri Dishes, Sterile (100 mm x 15 mm)</td><td>VWR</td><td>25384-088</td><td></td></tr><tr><td>New Brunswick Galaxy 14 S CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; Incubator</td><td>Eppendorf</td><td>CO14S-120-0000</td><td></td></tr><tr><td>Biosafety Cabinet</td><td>Nuare</td><td>NU-425-400</td><td></td></tr><tr><td>Mini-centrifuge&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-090-100</td><td></td></tr><tr><td>BioExpress GyroMixer Variable XL</td><td>GeneMate</td><td>R-3200-1XL</td><td></td></tr><tr><td>Mastercycler Pro Thermal Cycler with control panel</td><td>Eppendorf</td><td>950040015</td><td></td></tr><tr><td>SMZ445 stereomicroscope</td><td>Nikon</td><td>SMZ445</td><td></td></tr><tr><td>MultiImage Light Cabinet with AlphaEase Software</td><td>Alpha Innotech Corporation</td><td>Discontinued</td><td></td></tr><tr><td>Absolute 200 proof Ethanol</td><td>Fisher</td><td>BP2818-500</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher</td><td>BP151-100</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Phosphate (Dibasic MW 142) Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher</td><td>S374-1</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Phosphate (Monobasic MW 136) KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5379-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Chloride (NaCl)</td><td>Fisher</td><td>S671-3</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Chloride (KCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium Chloride (MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma</td><td>M2393-100g</td><td></td></tr><tr><td>Calcium Chloride (CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma</td><td>C5670-100g</td><td></td></tr><tr><td>Ambion Nuclease-Free Water</td><td>Life Technologies</td><td>AM9938&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>XY PCR Primer&amp;nbsp;</td><td>IDT</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Glacial Acetic Acid</td><td>Fisher</td><td>A38-500</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediamine Tetraacetic Acid (EDTA)</td><td>Fisher</td><td>BP2482-1</td><td></td></tr><tr><td>1% Ethidium bromide solution</td><td>Fisher</td><td>BP1302-10</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>GeneMate</td><td>E-3120-500</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Hydroxide (NaOH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>367176-2.5KG</td><td></td></tr><tr><td>Trizma Base</td><td>Sigma</td><td>T1503-1KG</td><td></td></tr><tr><td>dNTP Set, 100 mM Solutions</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0182</td><td></td></tr><tr><td>DNA Choice Taq polymerase with 10x Buffer</td><td>Denville</td><td>CB-4050-3</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Fisher</td><td>O4042-500</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>FluorMount-G</td><td>Southern Biotech</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td>Hydrogen Chloride (HCl)</td><td>Fisher</td><td>A144212</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin (BSA), powder, Fraction V, Heat shock isolation</td><td>Bioexpress</td><td>0332-100g</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle Medium (DMEM)&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS), triple 100 nm filtered</td><td>Fisher</td><td>03-600-511</td><td>Heat-inactivate before using</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml)</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td>Use at 1:100</td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide (DMSO), Hybri-max, sterile-filtered</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>VEGFR Tyrosine Kinase Inhibitor II - CAS 269390-69-4 - Calbiochem</td><td>EMD Millipore</td><td>676481</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit Anti-Sox9 Antibody</td><td>Millipore</td><td>AB5535</td><td>Use at dilution: 1:4,000</td></tr><tr><td>Rat Anti-Mouse PECAM1 (CD31) Antibody</td><td>BD Pharmingen</td><td>553370</td><td>Use at dilution: 1:250</td></tr><tr><td>Rabbit Cleaved Caspase-3 (Asp175) Antibody</td><td>Cell Signaling</td><td>9661S</td><td>Use at dilution: 1:250</td></tr><tr><td>Rat E-cadherin / CDH1 Antibody (ECCD-2)</td><td>Life Technologies</td><td>13-1900</td><td>Use at dilution: 1:500</td></tr><tr><td>Hoechst 3342, trihydrochloride, trihydrate</td><td>Invitrogen (Molecular Probes)</td><td>H1399</td><td>Use at 2 ug/ml</td></tr><tr><td>Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG (H+L)</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>712-165-153</td><td>Use at dilution: 1:500</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG (H+L)</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>712-605-153</td><td>Use at dilution: 1:500</td></tr><tr><td>Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate</td><td>Life Technologies</td><td>A31572</td><td>Use at dilution: 1:500</td></tr><tr><td>Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate</td><td>Life Technologies</td><td>A21206</td><td>Use at dilution: 1:500</td></tr><tr><td>Donkey anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate</td><td>Life Technologies</td><td>A21208</td><td>Use at dilution: 1:500</td></tr><tr><td>Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 conjugate</td><td>Life Technologies</td><td>A31573</td><td>Use at dilution: 1:500</td></tr></tbody></table>

using ex vivo upright droplet cultures of whole fetal organs to study developmental processes during mouse organogenesis

Untersuchung der Organogenese in utero ist eine technisch anspruchsvolle Prozess in Plazentatiere aufgrund der Unzugänglichkeit der Reagenzien an Embryonen, die in der Gebärmutter entwickeln. Ein neu entwickeltes ex vivo aufrecht Tröpfchenkulturverfahren bietet eine attraktive Alternative zum Studium in utero durchgeführt. Die ex vivo Tröpfchen Kultur bietet die Möglichkeit, zu prüfen, und zelluläre Wechselwirkungen und diverse Signalwege durch Verwendung verschiedener Blockierungs- und aktivierende Verbindungen zu manipulieren; Zusätzlich können die Wirkungen der verschiedenen pharmakologischen Reagenzien auf die Entwicklung von spezifischen Organen ohne unerwünschte Nebenwirkungen der systemischen Arzneimittelabgabe in utero sucht werden. Im Vergleich zu anderen in vitro-Systemen, die Tropfenkultur ermöglicht nicht nur die Fähigkeit, dreidimensionale Morphogenese und Zell-Zell-Interaktionen zu studieren, die in Säugerzelllinien wiedergegeben werden kann, sondern auch deutlich weniger reagents als andere ex vivo und in vitro-Protokolle. Dieses Papier zeigt richtige Maus fetalen Organ Dissektion und aufrecht Tröpfchenkultur-Techniken, gefolgt von ganzen Organs Immunfluoreszenz, um die Wirksamkeit des Verfahrens zu demonstrieren. Die ex vivo Tröpfchenkulturverfahren ermöglicht die Bildung von Organarchitektur vergleichbar zu dem, was in vivo beobachtet und kann genutzt werden, um auf andere Weise schwierig zu Studienprozesse durch embryonale Letalität in vivo-Modellen untersucht werden. Als Modell-Anwendungssystem wird ein niedermolekularer Inhibitor verwendet werden, um die Rolle der Vaskularisation in testikulären Morphogenese sondieren. Diese ex vivo Tröpfchenkulturverfahren ist erweiterbar auf andere fetale Organsystemen wie Lungen und möglicherweise andere, obwohl jedes Organ müssen ausgiebig untersucht werden, um alle organspezifische Modifikationen des Protokolls zu bestimmen. Diese Organkultursystem bietet Flexibilität bei Experimenten mit fetalen Organen und führt obtained mit dieser Technik hilft Forschern Einblicke in die fetale Entwicklung.

Die ex vivo Tropfenkultur ermöglicht eine ganze Organe, wie zB die Gonaden zu manipulieren, um zelluläre Wechselwirkungen und Dynamik zu studieren. 1 zeigt, in einer schrittweisen Art und Weise, wie man eine E11.5 gonadalen Tropfenkultur herzustellen. Die ersten Schritte in dem Kulturprotokoll umfassen die anfängliche Entfernung des Embryos enthaltenden Uterus der Mutter Maus (1A und 1B). Nach Entfernung der Gebärmutter der Mutter wird die Gebärmutterwand geschnitten und d...

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Using Ex Vivo Upright Droplet Cultures of Whole Fetal Organs to Study Developmental Processes during Mouse Organogenesis

The&#160;ex vivo&#160;upright droplet culture is an alternative to current&#160;in vitro&#160;and&#160;in vivo&#160;experimental techniques. This protocol is easy to perform and requires smaller amounts of reagent, while permitting the ability to manipulate and study fetal vascularization, morphogenesis, and organogenesis.

Verwendung<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Upright Droplet Kulturen von Whole Fetal Orgeln zu Entwicklungsprozessen während der Maus Organogenese Studieren

Investigating organogenesis in utero is a technically challenging process in placental mammals due to inaccessibility of reagents to embryos that develop ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Using Ex Vivo Upright Droplet Cultures of Whole Fetal Organs to Study Developmental Processes during Mouse Organogenesis

12.4K Aufrufe.  Cincinnati Children's Hospital Medical Center. The ex vivo upright droplet culture is an alternative to current in vitro and in vivo experimental techniques. This protocol is easy to perform and requires smaller amounts of reagent, while permitting the ability to manipulate and study fetal vascularization, morphogenesis, and organogenesis.

Serie: Using Ex Vivo Upright Droplet Cultures of Whole Fetal Organs to Study Developmental Processes during Mouse Organogenesis

Organ Culture and Whole Mount Immunofluorescence Staining of Mouse Wolffian Ducts

Tubal morphogenesis is a fundamental requirement for the development of most mammalian organs, including the male reproductive system. The epididymis, an integral part of the male reproductive tract, is responsible for sperm storage, maturation, and transport. The adult epididymis is a highly coiled tube that develops from a simple and straight embryonic precursor known as Wolffian duct (WD). Proper coiling of the epididymis is essential for male fertility, as sperm in the testis are unable to fertilize an oocyte. However, the mechanism responsible for epididymal development and coiling remains unclear, partially due to the lack of whole organ culture and imaging methods. In this study, we describe an in vitro culture system and whole mount immunofluorescence protocol to better visualize the process of WD coiling and development, which may also be applied to study other tubular organs.

We present a method for isolation and culture of the mouse Wolffian duct (WD). We also demonstrate a detailed procedure for whole mount immunostaining of cultured/freshly isolated WDs with fluorescently tagged antibodies. Together, these techniques enable the study of WD development, coiling, and differentiation.

Orgel, Kultur und Ganze Berge Immunfluoreszenzanfärbung von Maus Wolffschen Gänge

Tubal morphogenesis is a fundamental requirement for the development of most mammalian organs, including the male reproductive system. The epididymis, an ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Three-Dimensional Imaging of Organoids to Study Primary Ciliogenesis During ex vivo Organogenesis

Organoids are stem cell-derived three-dimensional structures that reproduce ex vivo the complex architecture and physiology of organs. Thus, organoids represent useful models to study the mechanisms that control stem cell self-renewal and differentiation in mammals, including primary ciliogenesis and ciliary signaling. Primary ciliogenesis is the dynamic process of assembling the primary cilium, a key cell signaling center that controls stem cell self-renewal and/or differentiation in various tissues. Here we present a comprehensive protocol for the immunofluorescence staining of cell lineage and primary cilia markers, in whole-mount mouse mammary organoids, for light sheet microscopy. We describe the microscopy imaging method and an image processing technique for the quantitative analysis of primary cilium assembly and length in organoids. This protocol enables a precise analysis of primary cilia in complex three-dimensional structures at the single cell level. This method is applicable for immunofluorescence staining and imaging of primary cilia and ciliary signaling in mammary organoids derived from normal and genetically modified stem cells, from healthy and pathological tissues, to study the biology of the primary cilium in health and disease.

Three-Dimensional Imaging of Organoids to Study Primary Ciliogenesis During ex vivo Organogenesis

Stem cell-derived organoids facilitate the analysis of molecular and cellular processes that regulate stem cell self-renewal and differentiation during organogenesis in mammalian tissues. Here we present a protocol for the analysis of the biology of the primary cilium in mouse mammary organoids.

Organoids are stem cell-derived three-dimensional structures that reproduce ex vivo the complex architecture and physiology of organs. Thus, organoids ...

Genetik

Mouse Fetal Liver Culture System to Dissect Target Gene Functions at the Early and Late Stages of Terminal Erythropoiesis

Erythropoiesis involves a dynamic process that begins with committed erythroid burst forming units (BFU-Es) followed by rapidly dividing erythroid colony forming units (CFU-Es). After CFU-Es, cells are morphologically recognizable and generally termed terminal erythroblasts. One of the challenges for the study of terminal erythropoiesis is the lack of experimental approaches to dissect gene functions in a chronological manner. In this protocol, we describe a unique strategy to determine gene functions in the early and late stages of terminal erythropoiesis. In this system, mouse fetal liver TER119 (mature erythroid cell marker) negative erythroblasts were purified and transduced with exogenous expression of cDNAs or small hairpin RNAs (shRNAs) for the genes of interest. The cells were subsequently cultured in medium containing growth factors other than erythropoietin (Epo) to maintain their progenitor stage for 12 hr while allowing the exogenous cDNAs or shRNAs to express. The cells were changed to Epo medium after 12 hr to induce cell differentiation and proliferation while the exogenous genetic materials were already expressed. This protocol facilitates analysis of gene functions in the early stage of terminal erythropoiesis. To study late stage terminal erythropoiesis, cells were immediately cultured in Epo medium after transduction. In this way, the cells were already differentiated to the late stage of terminal erythropoiesis when the transduced genetic materials were expressed. We recommend a general application of this strategy that would help understand detailed gene functions in different stages of terminal erythropoiesis.

We present an in vitro mouse fetal liver erythroblast culture system that dissects the early and late stages of terminal erythropoiesis. This system facilitates functional analysis of specific genes in different developmental stages.

Maus fötalen Leberkultursystem zur Ziel Gen-Funktionen in der frühen und späten Stadien der Klemme Erythropoese Dissect

Erythropoiesis involves a dynamic process that begins with committed erythroid burst forming units (BFU-Es) followed by rapidly dividing erythroid colony ...

Immunologie und Infektion

Recapitulating Suckling-to-Weaning Transition In Vitro using Fetal Intestinal Organoids

At the end of the suckling period, many mammalian species undergo major changes in the intestinal epithelium that are associated with the capability to digest solid food. This process is termed suckling-to-weaning transition and results in the replacement of neonatal epithelium with adult epithelium which goes hand in hand with metabolic and morphological adjustments. These complex developmental changes are the result of a genetic program that is intrinsic to the intestinal epithelial cells but can, to some extent, be modulated by extrinsic factors. Prolonged culture of mouse primary intestinal epithelial cells from late fetal period, recapitulates suckling-to-weaning transition in vitro. Here, we describe a detailed protocol for mouse fetal intestinal organoid culture best suited to model this process in vitro. We describe several useful assays designed to monitor the change of intestinal functions associated with suckling-to-weaning transition over time. Additionally, we include an example of an extrinsic factor that is capable to affect suckling-to-weaning transition in vivo, as a representation of modulating the timing of suckling-to-weaning transition in vitro. This in vitro approach can be used to study molecular mechanisms of the suckling-to-weaning transition as well as modulators of this process. Importantly, with respect to animal ethics in research, replacing in vivo models by this in vitro model contributes to refinement of animal experiments and possibly to a reduction in the use of animals to study gut maturation processes.

This protocol describes how to mimic suckling-to-weaning transition in vitro using mouse late fetal intestinal organoids cultured for 30 days.

Rekapitulation saugen-zu-Weaning Transition In Vitro mit fetalen Intestinal Organoiden

At the end of the suckling period, many mammalian species undergo major changes in the intestinal epithelium that are associated with the capability to ...

Optimization of Renal Organoid and Organotypic Culture for Vascularization, Extended Development, and Improved Microscopy Imaging

Embryonic kidney organotypic cultures, and especially pluripotent stem cell-derived kidney organoids, are excellent tools for following developmental processes and modelling kidney disease. However, the models are limited by a lack of vascularization and functionality. To address this, an improved protocol for the method of xenografting cells and tissues to the chorioallantoic membrane (CAM) of an avian embryo to gain vascularization and restoration of blood flow was developed. The grafts are overlaid with custom-made minireservoirs that fix the samples to the CAM and supply them with culture medium that protects the grafts from drying. The improved culture method allows xenografts to grow for up to 9 days. The manuscript also describes how to provide optimal conditions for long-term confocal imaging of renal organoids and organotypic cultures using the previously published Fixed Z-Direction (FiZD) method. This method gently compresses an embryonic organ or organoid between a glass coverslip and membrane in a large amount of medium and provides excellent conditions for imaging for up to 12 days. Together, these methods allow vascularization and blood flow to renal organoids and organotypic kidney cultures with improved confocal imaging. The methods described here are highly beneficial for studying fundamental and applied functions of kidneys ex vivo. Both methods are applicable to various types of tissues and organoids.

This work describes two methods for studying organ development, an improved xenotransplantation setup on chorioallantoic membrane (CAM) from avian embryos that allows for vascularization of cultured embryonic organs and organoids and a novel fixed z-direction organ culture method with modified experimental conditions that allows for high-resolution time-lapse confocal imaging.

Optimierung der Renalorganoid- und Organotypischen Kultur für Vaskularisation, erweiterte Entwicklung und verbesserte Mikroskopie-Bildgebung

Embryonic kidney organotypic cultures, and especially pluripotent stem cell-derived kidney organoids, are excellent tools for following developmental ...

Human Placental and Decidual Organ Cultures to Study Infections at the Maternal-fetal Interface

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is imperative to design experiments using human cells and tissues. An advantage of organ culture is maintenance of three-dimensional (3D) structural organization and extracellular matrix. The goal of the method described here is successful establishment of ex vivo human gestational tissue organ cultures and their healthy culture maintenance for 72-96 hr. The protocol details the immediate processing of research-consented, placental and decidual specimens fresh from the operating suite. These are abundant specimens that would otherwise be discarded. Detailed instructions on the sterile collection of these samples, including morphologic details on how to select appropriate tissues to establish 3D organ cultures, is provided. Placental villous and decidual tissues are microdissected into 2-3 mm3 pieces and placed separately on matrix-lined transwell filters and cultured for several days. Villous and decidual organ cultures are well suited for the study of human host-pathogen interaction. As compared to other model organisms, these human cultures are particularly advantageous to examine mechanism of infection for pathogens that demonstrate variable patterns of host specificity. As an example, we demonstrate infection of placental and decidual organ cultures with the clinically relevant, facultative intracellular bacterial pathogen Listeria monocytogenes.

A simple method to establish primary human placental (villous) and decidual organ cultures is described. Villous and decidual organ cultures are invaluable tools for studying pathogenesis at the human maternal-fetal interface. Infection with the facultative intracellular bacterium Listeria monocytogenes is demonstrated.

Menschliche Plazenta und Deziduale Organkulturen Infektionen zu studieren an der Maternal-fetale Schnittstelle

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is ...

Ex Utero Culture of Mouse Embryos from Pregastrulation to Advanced Organogenesis

Postimplantation mammalian embryo culture methods have been generally inefficient and limited to brief periods after dissection out of the uterus. Platforms have been recently developed for highly robust and prolonged ex utero culture of mouse embryos from egg-cylinder stages until advanced organogenesis. These platforms enable appropriate and faithful development of pregastrulating embryos (E5.5) until the hind limb formation stage (E11). Late gastrulating embryos (E7.5) are grown in rotating bottles in these settings, while extended culture from pregastrulation stages (E5.5 or E6.5) requires a combination of static and rotating bottle cultures. In addition, sensitive regulation of O2 and CO2 concentration, gas pressure, glucose levels, and the use of a specific ex utero culture medium are critical for proper embryo development. Here, a detailed step-by-step protocol for extended ex utero mouse embryo culture is provided. The ability to grow normal mouse embryos ex utero from gastrulation to organogenesis represents a valuable tool for characterizing the effect of different experimental perturbations during embryonic development.

Ex Utero Culture of Mouse Embryos from Pregastrulation to Advanced Organogenesis

An enhanced platform for whole-embryo culture allows continuous and robust ex utero development of postimplantation mouse embryos for up to six days, from pregastrulation stages until advanced organogenesis. In this protocol, we detail the standard procedure for successful embryo culture using static plates and rotating bottle systems.

Ex Utero Kultur von Mausembryonen von der Prägastrulation bis zur fortgeschrittenen Organogenese

Postimplantation mammalian embryo culture methods have been generally inefficient and limited to brief periods after dissection out of the uterus. ...

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

The pancreas controls vital functions of our body, including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar levels1. Although in the past decade many studies have contributed to a solid foundation for understanding pancreatic organogenesis, important gaps persist in our knowledge of early pancreas formation2. A complete understanding of these early events will provide insight into the development of this organ, but also into incurable diseases that target the pancreas, such as diabetes or pancreatic cancer. Finally, this information will generate a blueprint for developing cell-replacement therapies in the context of diabetes.
 During embryogenesis, the pancreas originates from distinct embryonic outgrowths of the dorsal and ventral foregut endoderm at embryonic day (E) 9.5 in the mouse embryo3,4. Both outgrowths evaginate into the surrounding mesenchyme as solid epithelial buds, which undergo proliferation, branching and differentiation to generate a fully mature organ2,5,6. Recent evidences have suggested that growth and differentiation of pancreatic cell lineages, including the insulin-producing &beta;-cells, depends on proper tissue-architecture, epithelial remodeling and cell positioning within the branching pancreatic epithelium7,8. However, how branching morphogenesis occurs and is coordinated with proliferation and differentiation in the pancreas is largely unknown. This is in part due to the fact that current knowledge about these developmental processes has relied almost exclusively on analysis of fixed specimens, while morphogenetic events are highly dynamic.
 Here, we report a method for dissecting and culturing mouse embryonic pancreatic buds ex vivo on glass bottom dishes, which allow direct visualization of the developing pancreas (Figure 1). This culture system is ideally devised for confocal laser scanning microscopy and, in particular, live-cell imaging. Pancreatic explants can be prepared not only from wild-type mouse embryos, but also from genetically engineered mouse strains (e.g. transgenic or knockout), allowing real-time studies of mutant phenotypes. Moreover, this ex vivo culture system is valuable to study the effects of chemical compounds on pancreatic development, enabling to obtain quantitative data about proliferation and growth, elongation, branching, tubulogenesis and differentiation. In conclusion, the development of an ex vivo pancreatic explant culture method combined with high-resolution imaging provides a strong platform for observing morphogenetic and differentiation events as they occur within the developing mouse embryo.

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

Here, we describe a method for isolation, culture and manipulation of mouse embryonic pancreas. This represents an excellent ex vivo system for studying various aspects of pancreatic development, including morphogenesis, differentiation and growth. Pancreatic bud explants can be cultured for several days and used in a range of different applications, including whole-mount immunofluorescence and live imaging.

Ein System für<em&gt; Ex vivo</em&gt; Kultivierung von embryonalen Pankreas

The pancreas controls vital functions of our body,  including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar  levels1. Although in the ...

Biologie

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Cultures of Embryonic Mouse Brains for Live-Imaging of Migrating GABAergic Interneurons

GABAergic interneurons (INs) are critical components of neuronal networks that drive cognition and behavior. INs destined to populate the cortex migrate tangentially from their place of origin in the ventral telencephalon (including from the medial and caudal ganglionic eminences (MGE, CGE)) to the dorsal cortical plate in response to a variety of intrinsic and extrinsic cues. Different methodologies have been developed over the years to genetically manipulate specific pathways and investigate how they regulate the dynamic cytoskeletal changes required for proper IN migration. In utero electroporation has been extensively used to study the effect of gene repression or overexpression in specific IN subtypes while assessing the impact on morphology and final position. However, while this approach is readily used to modify radially migrating pyramidal cells, it is more technically challenging when targeting INs. In utero electroporation generates a low yield given the decreased survival rates of pups when electroporation is conducted before e14.5, as is customary when studying MGE-derived INs. In an alternative approach, MGE explants provide easy access to the MGE and facilitate the imaging of genetically modified INs. However, in these explants, INs migrate into an artificial matrix, devoid of endogenous guidance cues and thalamic inputs. This prompted us to optimize a method where INs can migrate in a more naturalistic environment, while circumventing the technical challenges of in utero approaches. In this paper, we describe the combination of ex utero electroporation of embryonic mouse brains followed by organotypic slice cultures to readily track, image and reconstruct genetically modified INs migrating along their natural paths in response to endogenous cues. This approach allows for both the quantification of the dynamic aspects of IN migration with time-lapse confocal imaging, as well as the detailed analysis of various morphological parameters using neuronal reconstructions on fixed immunolabeled tissue.

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Cultures of Embryonic Mouse Brains for Live-Imaging of Migrating GABAergic Interneurons

Here, we provide a low-cost and reliable method to generate electroporated brain organotypic slice cultures from mouse embryos suitable for confocal microscopy and live-imaging techniques.

Ex Utero Elektroporation und organotypischen Slice Kulturen der embryonalen Mäusegehirnen für Live-Aufnahmen von Migration Gabaergen Interneuronen

GABAergic interneurons (INs) are critical components of neuronal networks that drive cognition and behavior. INs destined to populate the cortex migrate ...

Neurowissenschaften

Mouse Embryonic Development in a Serum-free Whole Embryo Culture System

Mid-gestation stage mouse embryos were cultured utilizing a serum-free culture medium prepared from commercially available stem cell media supplements in an oxygenated rolling bottle culture system. Mouse embryos at E10.5 were carefully isolated from the uterus with intact yolk sac and in a process involving precise surgical maneuver the embryos were gently exteriorized from the yolk sac while maintaining the vascular continuity of the embryo with the yolk sac. Compared to embryos prepared with intact yolk sac or with the yolk sac removed, these embryos exhibited superior survival rate and developmental progression when cultured under similar conditions. We show that these mouse embryos, when cultured in a defined medium in an atmosphere of 95% O2 / 5% CO2 in a rolling bottle culture apparatus at 37 &#176;&#8203;C for 16-40 hr, exhibit morphological growth and development comparable to the embryos developing in utero. We believe this method will be useful for investigators needing to utilize whole embryo culture to study signaling interactions important in embryonic organogenesis.

Serum utilized in embryo cultures contains unknown components that can affect the outcome of experiments especially in studies involving signaling interactions. Here we utilized a serum-free oxygenated culture system and show that mid-gestation mouse embryos cultured for 16-40 hr&#160;exhibit morphological development comparable to embryos developing in utero.

Maus embryonalen Entwicklung in einem Serum-freien Whole Embryo Culture-System

Mid-gestation stage mouse embryos were cultured utilizing a serum-free culture medium prepared from commercially available stem cell media supplements in ...

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Orgel, Kultur und Ganze Berge Immunfluoreszenzanfärbung von Maus Wolffschen Gänge

Three-Dimensional Imaging of Organoids to Study Primary Ciliogenesis During ex vivo Organogenesis

Maus fötalen Leberkultursystem zur Ziel Gen-Funktionen in der frühen und späten Stadien der Klemme Erythropoese Dissect

Rekapitulation saugen-zu-Weaning Transition In Vitro mit fetalen Intestinal Organoiden

Optimierung der Renalorganoid- und Organotypischen Kultur für Vaskularisation, erweiterte Entwicklung und verbesserte Mikroskopie-Bildgebung

Menschliche Plazenta und Deziduale Organkulturen Infektionen zu studieren an der Maternal-fetale Schnittstelle

Ex Utero Kultur von Mausembryonen von der Prägastrulation bis zur fortgeschrittenen Organogenese

Ein System für

Ex Utero Elektroporation und organotypischen Slice Kulturen der embryonalen Mäusegehirnen für Live-Aufnahmen von Migration Gabaergen Interneuronen

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