La recherche dans le laboratoire Spagnoli. est financé par l&#39;Association Helmholtz, FP7-GRI-2008-ENDOPANC subvention et ERC-2009-Starting Grant hépatopancréatique.

Le protocole décrit ici a été adapté à la technique décrite à l&#39;origine de Percival et Slack 9 et optimisé pour la microscopie confocale. 1. Revêtement de plats Glass Bottom Culture Les étapes suivantes doivent être effectuées dans des conditions stériles dans une hotte à flux laminaire. <ol><li> Explants pancréatiques sont cultivées dans des boîtes de Pétri de 35 mm à 20 mm de diamètre en verre micropuits bas (par exemple MatTek Corporation). Utilisez un plat à fond de verre par la culture de l&#39;explant et pendant toute la durée de la culture. A la veille de la dissection et l&#39;isolement des bourgeons pancréatiques, enduire les micropuits à fond de verre avec la fibronectine. </li><li> Diluer la fibronectine dans une culture cellulaire stérile de qualité de l&#39;eau à une pg 50 / ml final et ajouter un volume minimal de celle-ci (~ 150 ul) dans le micropuits 20-mm des plaques MatTek couvrant toute la surface du verre (figure 1E). Placez les platsdans un réfrigérateur 4 ° C pendant une nuit d&#39;incubation. </li><li> Le jour de la dissection, aspirer la fibronectine, rincer le micropuits de culture de cellules de qualité de l&#39;eau et ajouter un volume minimum de 150 pi de BME (Basal Medium Eagle) un milieu supplémenté avec Pen / Strep (1%), Glutamine (1% ) et 50 pg / ml de gentamicine [Moyen Dissection]. Laissez les plats revêtus dans la hotte à flux laminaire jusqu&#39;au moment de la plaque des explants. </li></ol> Si ce n&#39;est pas tous les plats revêtus de fibronectine sont utilisés, ils peuvent être stockés pendant 1 semaine à 4 ° C. Ne laissez pas les plats sécher, de les remplir de milieu de dissection et les placer dans le réfrigérateur. En plus de la fibronectine, du pancréas explants ont bien été cultivées sur des substrats divers, tels que la laminine 9, 10,11 ou matrigel membranes microporeuses 12. En raison de ses effets sur la ramification, nous utilisons la fibronectine 9 comme substrat. 2. Dissection de DBud pancréatique ORSAL partir de E11.5 - E12.5 embryons de souris <ol><li> Timed-souris femelles enceintes à jour embryonnaire (E) 11,5 ou 12,5 sont sacrifiés et les embryons sont recueillis à l&#39;aide d&#39;instruments de dissection préalablement nettoyés avec de l&#39;éthanol à 70%. Placez l&#39;utérus disséqués dans 10 cm des plaques contenant du PBS glacé complété avec 50 ug / ml de gentamicine. </li><li> Sous un stéréomicroscope avec éclairage par le dessus, séparé de l&#39;utérus en segments individuels à l&#39;aide d&#39;embryons de petits ciseaux ou des pinces Dumont, doucement décoller le muscle de l&#39;utérus et de supprimer les embryons individuels, qui sont entourés par la caduque. Utilisez les techniques standards de dissection d&#39;embryons de 13 à exposer les embryons et retirez le sac vitellin et l&#39;amnios. Par la suite, retirer la partie supérieure du corps de l&#39;embryon (au-dessus du foie) et la région de la queue. Cela permettra à l&#39;exposition des organes internes (figure 1B). Transférer le corps médian des embryons dans 10 cm des plaques contenant glacée milieu de dissection BME. </li><li> Maintenantutiliser uniquement transillumination ci-dessous pour visualiser et à disséquer le bourgeon pancréatique dorsal sous la loupe binoculaire. Doucement, ouvrez le milieu du corps de l&#39;embryon en faisant une incision latérale avec une pince. Localisez l&#39;estomac et la rate. Le bourgeon pancréatique dorsal est fixée latéralement à la zone postérieure de l&#39;estomac (figure 1C). En utilisant des pinces Dumont, disséquer loin le bourgeon pancréatique dorsal des structures adjacentes, comme l&#39;estomac et la rate, mais en laissant une certaine mésenchyme autour de l&#39;épithélium (figure 1D). En utilisant une pipette Pasteur en verre, transférer l&#39;œuf isolé dans un plat de 35 mm de Pétri contenant du milieu de dissection froide BME supplémenté avec 10% sérum de veau foetal [Milieu de culture]. Répétez ces étapes jusqu&#39;à ce que tous les pancréas sont isolés. Si pancréas de différents génotypes sont isolés, ne les mélangez à l&#39;aide Nunc 4-puits. </li></ol> 3. Placage et de la culture des explants pancréatiques Finale platetion des explants est effectué dans la chambre de culture de tissus et / ou à proximité immédiate de l&#39;incubateur de culture tissulaire pour minimiser le mouvement physique des cultures. <ol><li> Dans des conditions stériles dans une hotte à flux laminaire remplacer le milieu de dissection BME dans les plats MatTek fibronectine enduits avec ~ 150 pl de milieu de culture BME préchauffé à 37 ° C. </li><li> Avec précaution, le transfert des explants de pancréas dans des boîtes recouvertes de MatTek (un explant par boîte) pour culture à long terme en utilisant une pipette Pasteur en verre. Pour assurer la diffusion au cours de la culture, le mésenchyme environnant les explants peuvent être légèrement déchiré, si nécessaire, avec une aiguille fine. </li><li> Doucement, placer les cultures dans un incubateur de culture tissulaire (37 ° C, 5% CO 2) pendant quelques heures pour laisser les explants joindre aux micropuits à fond de verre. Une fois qu&#39;ils sont attachés, remplir les plats MatTek avec 1,5 ml à 2 ml de milieu de culture BME pré-chauffé à 37 ° C. Le jour de la dissection est désigné comme jour 0. </li><li> Hommeipulation des cultures d&#39;explants pancréatiques est réalisée dans des conditions stériles dans une hotte à flux laminaire. Le milieu de culture BME est changé tous les jours, à moins que les exigences expérimentales dicter le calendrier différent (par exemple, l&#39;incubation des explants avec des agents chimiques). Les explants peuvent être cultivés dans cet état pendant 5 jours à une semaine. </li></ol> 4. Ensemble de montage Protocole de coloration par immunofluorescence pour des explants pancréatiques Toutes les étapes du protocole de fixation (immunofluorescence à l&#39;imagerie) sont réalisées dans le même plat MatTek, ce qui donne de meilleures images d&#39;un plat en plastique à fond. Après fixation, les cultures d&#39;explants pancréatiques n&#39;ont pas besoin d&#39;être conservés dans des conditions stériles. <ol><li> Aspirer milieu de culture BME et laver l&#39;explant une fois avec 2 ml de PBS 1X. </li><li> Pour la fixation explant remplacer PBS avec 2 ml glacée paraformaldéhyde 4% (PFA) et placer le plat sur la glace pendant 20 min. Swirl la plaque délicatement de temps entemps, mais il faut éviter les plates-formes à bascule, comme l&#39;explant pourrait se détacher. </li><li> Retirer et laver PFA trois explants fois avec 2 ml de PBS 1X pendant 10 min chacun à température ambiante (RT). </li><li> Bloc avec 2 ml de solution de blocage (PBS 1X + 0,1% de Triton-X + 3% de sérum d&#39;âne) pendant au moins 30 min à température ambiante. </li><li> Diluer l&#39;anticorps primaire dans la solution de blocage et ajouter ~ 150 pl de la dilution directement dans la cupule 20-mm des plaques de recouvrement de la surface MatTek explant ensemble pour une incubation pendant une nuit à 4 ° C. Afin de minimiser les mouvements physiques, ajouter anticorps primaire aux explants directement dans la chambre froide (4 ° C). Pour éviter l&#39;évaporation, avant d&#39;ajouter l&#39;anticorps, placer les plaques MatTek dans une chambre humide. </li><li> Le lendemain, retirer la solution d&#39;anticorps et laver trois fois avec 2 ml de PBS 1X + 0,1% de Tween-20 (PBT) pendant 30 min à température ambiante chacun. </li><li> Diluer l&#39;anticorps secondaire dans une solution de blocage [selon les recommandations du fabricant, nous utilisons âne Alexa Fluor colorants lutte secondairecorps à 1:750 dilution] et ajouter ~ 150 ul de la dilution directement dans la cupule de 20 mm des plaques de MatTek, couvrant toute la surface des explants, pendant 1-2 heures d&#39;incubation à température ambiante dans l&#39;obscurité. Pour contre-coloration nucléaire, notamment Hoechst avec une dilution d&#39;anticorps secondaire. Pour éviter l&#39;évaporation, avant d&#39;ajouter l&#39;anticorps, placer les plaques MatTek dans une chambre humide. </li><li> Laver trois fois avec 2 ml de PBS 1X + 0,1% de Tween-20 (PBT) pendant 30 min à température ambiante chacun. </li><li> Avant le montage, laver une fois avec du PBS 1X pour éliminer Tween-20. Montez en ajoutant une goutte de milieu de montage aqueux (avec anti-décoloration) dans la cupule de 20 mm des plaques de MatTek. Doucement, couvrir l&#39;explant avec une lamelle de verre. Évitez les bulles d&#39;air. </li><li> Les explants sur des plaques de MatTek peut être consulté en microscopie à contraste de phase standard ou microscopie confocale, en fonction des objectifs de l&#39;expérience. Pour l&#39;analyse de microscopie confocale, nous utilisons un Zeiss LSM 700 réglage inversé. Mettre en place des lasers appropriés pour les fluorophores noused. Sélectionnez un objectif qui sera l&#39;image de la zone désirée de l&#39;explant du pancréas. Un 10X objectif à immersion dans l&#39;eau est apte à maintenir l&#39;expiant entier dans le champ de vision. A 40x eau ou à l&#39;huile d&#39;immersion conviennent de se concentrer sur des régions spécifiques du pancréas explant avec une meilleure résolution. Les explants peuvent être optiquement sectionnée puis l&#39;acquisition de Z-piles reconstruit en 3D, en utilisant un logiciel approprié. </li></ol> 5. Protocole d&#39;imagerie des cellules vivantes des explants pancréatiques <ol><li> Configuration de l&#39;environnement de chambre: utiliser une enceinte de protection et une petite chambre d&#39;incubation [avec la température et le CO 2 de contrôle] qui se trouve sur la platine du microscope. Culture approprié du pancréas embryonnaire nécessite une température stable de 37 ° C et sous atmosphère contrôlée de CO 2 5% humidifiée. Chambres convenables sont disponibles auprès de plusieurs fournisseurs (Par exemple, Zeiss, Nikon, Olympus). Monter la boîte de chauffage et allumez-le unu moins 1 h avant l&#39;imagerie commence à permettre à l&#39;équipement de se réchauffer et équilibrer teneur en CO 2 à 5%. </li><li> Pour imagerie time-lapse de cultures d&#39;explants pancréatiques, nous utilisons un Zeiss LSM 700 microscope inversé. Pour les lasers et la sélection objective voir point 4.10. </li><li> Laissez l&#39;explant pancréas fixer ainsi le plat à fond de verre avant de commencer l&#39;imagerie en temps réel. [Nous exécutent habituellement imagerie en temps réel à partir du jour 1]. Dans une hotte à flux laminaire, aspirer et remplacer le milieu par du milieu BME explant culture fraîche de commencer avec des conditions optimales de nutriments. </li><li> Doucement transférer les explants à la salle de microscope et placer le plat MatTek dans la chambre d&#39;incubation dans le porte-échantillon du microscope confocal. </li><li> Préparer l&#39;objectif (par exemple, ajouter de l&#39;huile ou de l&#39;eau-support selon le choix de l&#39;objectif à immersion) et se concentrer sur la région d&#39;intérêt dans l&#39;expiant. Fermer la chambre de l&#39;environnement correctement. Pour éviter toute évaporation pendant time-lapseacquisition avec de l&#39;eau d&#39;immersion objectifs, à la place de l&#39;eau, il est recommandé d&#39;utiliser les fluides visqueux d&#39;immersion qui sont disponibles dans le commerce (par exemple Zeiss Immersol W). </li><li> Mettre en place intensité du laser, les paramètres d&#39;acquisition Z-stack et l&#39;intervalle de temps (voir aussi discussion pour le dépannage). Commencez l&#39;expérience. </li><li> Après l&#39;imagerie, l&#39;exportation Z piles et tous les points dans le temps et de les analyser à l&#39;aide du logiciel approprié (par exemple ImageJ, Volocity, Imaris, Huygens). </li></ol> 6. Les résultats représentatifs Bourgeons pancréatiques dorsal (avec le mésenchyme environnant) ont été disséqués à partir d&#39;embryons de souris E11.5 et E12.5 entre et plaqué directement sur ​​la vaisselle en verre à fond la culture (figure 1). Les vaisseaux sanguins sont présents dans le mésenchyme environnant l&#39;épithélium et peuvent être visualisées par immunocoloration pour le marqueur endothélial Pecam 12 (données non présentées). Après deux jours de culture, du pancréas und explantserwent une croissance importante et ont commencé à s&#39;organiser en structures ramifiées épithéliales, dont les noyaux étaient positifs pour le facteur de transcription du pancréas, Pdx1 (Figure 2A-C). La moyenne z-épaisseur des explants de pancréas au jour 3 de la culture est de 60-80 um. La surface et le volume des explants peuvent être mesurés en utilisant des logiciels appropriés (p. ex Huygens). Les analyses morphologiques et immunofluorescence ont montré que les explants pancréatiques cultivés en utilisant ce protocole récapitulé dans la différenciation in vivo du pancréas précoce et événements morphogénétiques 5,10,11,14 (figure 2). Explants pancréatiques au jour 4 de la culture a subi typique &quot;tip et le tronc&quot; ségrégation de l&#39;épithélium 8, affichant CPA1 + cellules progénitrices à l&#39;extrémité des branches épithéliales (figure 2C) et + insuline différenciées et de glucagon + cellules organisées en grappes à l&#39;intérieur du tronc (figure 2D ). En outre, la pancréatitec épithélium dans les cultures ex vivo ont montré l&#39;organisation du cytosquelette et de la polarité cellulaire appropriée, avec une localisation apicale de la F-actine (figure 2E, en vert) et b1-integrin au niveau des membranes basales (figure 2E, en rouge). Pour étudier la ramification du pancréas en temps réel, des explants pancréatiques embryonnaires ont été isolées à partir de la double couleur souche rapporteuse de la souris fluorescente membrane-Tomato/membrane-Green 15 (mT / mG; souche de souris est disponible au Laboratoire Jackson) (figure 3). Toujours trames d&#39;une vidéo time-lapse de explants pancréatiques mT / mG en culture sont présentés dans la figure 3. La localisation de la protéine fluorescente mT à des structures membranaires décrit la morphologie des cellules et permet la résolution de fines processus cellulaires, permettant de suivre le remodelage et la migration cellulaire au cours du temps. Après un 12-hr time-lapse expérience du signal de fluorescence mT reste viable et deteCTABLE, même si son intensité est réduite, probablement en raison de photovieillissement (figure 3). Solutions techniques pour éviter ou réduire le photovieillissement et de phototoxicité sont discutés dans la section Discussion. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3979/3979fig1.jpg" /> Figure 1. Représentation schématique de la dissection des bourgeons pancréas dorsal à partir de E12.5 embryon de souris. (A) l&#39;image de fond clair E12.5 embryon de souris. La partie supérieure du corps de l&#39;embryon (au-dessus du foie) et la région de queue sont éliminés afin d&#39;isoler le milieu du corps (B). Les incisions sont représentés par des pointillés rouges. (C) les résultats de dissection supplémentaire de l&#39;exposition de l&#39;estomac et du duodénum région (indiqué par la zone en pointillés). Le bourgeon pancréatique dorsal (voir cercle rouge en pointillés) est à la base de l&#39;estomac et à côté de l&#39;ébauche de la rate. Le bourgeon pancréatique dorsal disséqué (D) est transféré à la pipette Pasteur dans les micropuits d&#39;un fond plat en verre contenant un milieu de culture BME (E, F). Abréviations: STO (estomac), sp (rate), dp (bourgeon pancréatique dorsal), duo (duodénum). Barres d&#39;échelle, 1000 um (A, C). <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/3979/3979fig2.jpg" /> Figure 2. Tout montage analyse confocale par immunofluorescence des cultures d&#39;explants pancréatiques. (A) des images en fond clair d&#39;explants de pancréas le jour 1 et le jour 2 de la culture ex vivo. Rouge ligne pointillée indique l&#39;initiation de la ramification de l&#39;épithélium. (B) la reconstruction 3D de l&#39;ensemble du montage immunocoloration pour Pdx1 sur la culture du pancréas jour 3. Explants pancréatiques a montré tubules de cellules PDX1 + subissant une vaste ramification de 48 h de culture. (C) Tout montage immunomarquage du pancréas explant jour 3 avec des anticorps contre le marqueur membrane basolatérale E-cadhérine (ECAD), marqueur progéniteur pointe, Carboxypeptidase 1 (CPA1) et phospho-Histone H3 (pHH3). La plupart des cellules mitotiques actif pHH3 + colocalisent aux extrémités périphériques avec CPA1 cellules +. L pointilléeines indiquent la pointe des branches. (D) Le total montage immunomarquage pour les marqueurs de lignage endocrine, de l&#39;insuline (Ins) et le glucagon (gluca) au jour 3. Les flèches jaunes indiquent des grappes de Ins + et + gluca cellules. Encart (D &#39;), supérieur de grossissement de l&#39;une grappe de cellules endocrines. (E) Le total montage immunomarquage d&#39;explant pancréas jour 3 pour Pdx1, β1 des intégrines (β1int) et F-actine (Fait). Les cellules mésenchymateuses (astérisques) sont intercalées entre Pdx1-positives cellules épithéliales. Images présentées dans C, D et E sont simples sections optiques confocaux de Z-série. Barres d&#39;échelle, 100 um (A, B); 50 pm (CE). <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/3979/3979fig3.jpg" /> Figure 3. Représentant imagerie des cellules vivantes ex vivo d&#39;explants cultivés du pancréas. (AD) trames d&#39;une vidéo time-lapse d&#39;un explant de pancréas d&#39;un embryon mT / mG souris transgénique. Temps d&#39;imagerie est indiquée en heures: minutes. L&#39;explant a été imagé à partir Day 1. Z-stack imagesont été acquises avec un objectif à immersion d&#39;huile 40X toutes les 12 min pour un total de 15 heures. Les lignes pointillées indiquent la pointe des branches et des frontières entre l&#39;épithélium et le mésenchyme. La barre d&#39;échelle, 50 um.

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	<li>Slack, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+biology+of+the+pancreas.">Developmental biology of the pancreas.</a> Development. 121, 1569-1580 (1995).</li><li>Pan, F., Wright, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreas+organogenesis:+from+bud+to+plexus+to+gland.">Pancreas organogenesis: from bud to plexus to gland.</a> Dev. Dyn. 240, 530-565 (2011).</li><li>Puri, S., Hebrok, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+Plasticity+within+the+Pancreas-+Lessons+Learned+from+Development.">Cellular Plasticity within the Pancreas- Lessons Learned from Development.</a> Developmental Cell. 18, 342-356 (2010).</li><li>Spagnoli, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+endoderm+to+pancreas:+a+multistep+journey.">From endoderm to pancreas: a multistep journey.</a> Cell. Mol. Life Sci. 64, 2378-2390 (2007).</li><li>Hick, A. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+primitive+duct+formation+in+the+pancreas+and+submandibular+glands:+a+role+for+SDF-1.">Mechanism of primitive duct formation in the pancreas and submandibular glands: a role for SDF-1.</a> BMC Dev. Biol. 9, 1-17 (2009).</li><li>Villasenor, A., Chong, D., Henkemeyer, M., Cleaver, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+dynamics+of+pancreatic+branching+morphogenesis.">Epithelial dynamics of pancreatic branching morphogenesis.</a> Development. 137, 4295-4305 (2010).</li><li>Kesavan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cdc42-Mediated+Tubulogenesis+Controls+Cell+Specification.">Cdc42-Mediated Tubulogenesis Controls Cell Specification.</a> Cell. 139, 791-801 (2009).</li><li>Zhou, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Multipotent+Progenitor+Domain+Guides+Pancreatic+Organogenesis.">A Multipotent Progenitor Domain Guides Pancreatic Organogenesis.</a> Developmental Cell. 13, 103-114 (2007).</li><li>Percival, A., Slack, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+pancreatic+development+using+a+cell+lineage+label.">Analysis of pancreatic development using a cell lineage label.</a> Exp. Cell Res. 247, 123-132 (1999).</li><li>Miralles, F., Czernichow, P., Ozaki, K., Itoh, N., Scharfmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+through+fibroblast+growth+factor+receptor+2b+plays+a+key+role+in+the+development+of+the+exocrine+pancreas.">Signaling through fibroblast growth factor receptor 2b plays a key role in the development of the exocrine pancreas.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 6267-6272 (1999).</li><li>Puri, S., Hebrok, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+embryonic+pancreas+development+using+real-time+imaging.">Dynamics of embryonic pancreas development using real-time imaging.</a> Dev. Biol. 306, 82-93 (2007).</li><li>Magenheim, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+vessels+restrain+pancreas+branching,+differentiation+and+growth.">Blood vessels restrain pancreas branching, differentiation and growth.</a> Development. 138, 4743-4752 (2011).</li><li>Nagy, A., Gertsenstein, M., Vintersten, K., Behringer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual. , (2003).</li><li>Horb, L. D., Slack, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+cell+division+in+branching+morphogenesis+and+differentiation+of+the+embryonic+pancreas.">Role of cell division in branching morphogenesis and differentiation of the embryonic pancreas.</a> Int. J. Dev. Biol. 44, 791-796 (2000).</li><li>Muzumdar, M., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+global+double-fluorescent+Cre+reporter+mouse.">A global double-fluorescent Cre reporter mouse.</a> Genesis. 45, 593-605 (2007).</li></ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Une fois le sort du pancréas est spécifié, les cellules progénitrices pancréatiques subissent une prolifération extensive, la différenciation et la morphogenèse, à terme, constituer un organe mature et fonctionnelle 2,4. À l&#39;heure actuelle, comment les branches se déroule dans le pancréas et la façon dont elle est reliée à la prolifération et la différenciation des progéniteurs est largement inconnue. Des cultures d&#39;explants pancréatiques représentent un système idéal pour éluci...

<table border="1"><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> Anticorps: Carboxypeptidase E-cadhérine F-actine Le glucagon Insuline β1-intégrine Pdx1 Pdx1 Phospho-Histone H3 </td><td> AbD Serotec Invitrogen Molecular Probes Immunostar Millipore Millipore Abcam Hybridome banque Signalisation cellulaire </td><td> 1810-0006 13-1900 A-12373 20076 4011-01 MAB1997 ab47267 F109-D12 9706 </td><td></td></tr><tr><td> Basal Medium Eagle (BME) </td><td> Sigma </td><td> B1522-500ML </td><td> Conservés dans des conditions stériles </td></tr><tr><td> Eau de qualité culture cellulaire </td><td> AAP </td><td> S15-012 </td&gt; <td> Conservés dans des conditions stériles </td></tr><tr><td> Boîtes de culture (à fond de verre), 35 mm </td><td> MatTek Corporation </td><td> P35G 0-20-C- </td><td></td></tr><tr><td> Sérum d&#39;Ane </td><td> Chemicon </td><td> S30-100 ml </td><td></td></tr><tr><td> Sérum de veau foetal Or </td><td> AAP </td><td> A15-151 </td><td> Conservés dans des conditions stériles </td></tr><tr><td> La fibronectine </td><td> Invitrogen </td><td> 330100-8 </td><td> Stock sol. 1 mg / ml dans de l&#39;eau de qualité culture cellulaire </td></tr><tr><td> Gentamicine </td><td> Invitrogen </td><td> 15750-037 </td><td> Conservés dans des conditions stériles </td></tr><tr><td> Glutamine </td><td> Invitrogen </td><td> 25030-024 </td><td> Conservés dans des conditions stériles </td></tr><tr><td> 4-ainsi multipuits </td><td> Nunc </td><td> 176740 </td><td></td></tr><tr><td> Microscopes: Microscope confocal inversé (LSM 700) Stéréomicroscope (Discovery V12) </td><td> Zeiss Zeiss </td><td></td><td> Objectifs: C-Apochromat 10X / 0,45 W M27 (travail. dist 1,8 mm;. Profondeur d&#39;imagerie ~ 100 mm), C-Apochromat 40X / 1,2 W Corr M27 (travail. dist 0,28 mm;. ~ Imagerie profondeur 50 um) Transillumination d&#39;en bas et à fibres optiques d&#39;éclairage par le dessus </td></tr><tr><td> Paraformaldéhyde </td><td> Roth </td><td> 0335.3 </td><td> Solution mère 20% </td></tr><tr><td> Pipette Pasteur (verre), 150 mm </td><td> VWR </td><td> HECH567 / 1 </td><td></td></tr><tr><td> Pénicilline / Streptomycine </td><td> AAP </td><td> P11-010 </td><td> Conservé dans c stérileonditions </td></tr><tr><td> Des boîtes de Pétri de 60 mm </td><td> Greiner Bio-One </td><td> 628102 </td><td></td></tr><tr><td> Des boîtes de Pétri de 35 mm </td><td> Greiner Bio-One </td><td> 627161 </td><td></td></tr><tr><td> 1X PBS, pH 7,4 </td><td> AAP </td><td> H15-002 </td><td> Conservés dans des conditions stériles </td></tr><tr><td> Printemps Ciseaux lame de 8 mm courbé </td><td> Outils Fine Science </td><td> 15023-10 </td><td></td></tr><tr><td> Triton-X100 </td><td> Roth </td><td> 3051.3 </td><td></td></tr><tr><td> Horloger foreceps Dumont # 5 </td><td> Roth </td><td> K342.1 </td><td></td></tr></table>

a system for ex vivo culturing of embryonic pancreas

Le pancréas contrôle les fonctions vitales de notre corps, y compris la production d&#39;enzymes digestives et la régulation de la glycémie 1. Bien que dans la dernière décennie de nombreuses études ont contribué à une base solide pour la compréhension de l&#39;organogenèse du pancréas, des lacunes importantes subsistent dans notre connaissance de la formation du pancréas au début 2. Une compréhension complète de ces événements précoces donnent un aperçu de l&#39;évolution de cet organe, mais aussi sur les maladies incurables qui ciblent le pancréas, comme le diabète ou le cancer du pancréas. Enfin, cette information sera générer un modèle pour l&#39;élaboration de cellules en remplacement des traitements dans le cadre du diabète. Au cours de l&#39;embryogenèse, le pancréas provient de différentes excroissances embryonnaires de l&#39;endoderme intestin antérieur dorsal et ventral à jour embryonnaire (E) 9,5 3,4 chez l&#39;embryon de souris. Les deux excroissances evaginate dans le mésenchyme environnant solide épithéliumbourgeons l, qui subissent la prolifération, la différenciation et de branchement pour générer un organe pleinement matures 2,5,6. Des preuves récentes ont suggéré que la croissance et la différenciation des lignées de cellules pancréatiques, y compris les productrices d&#39;insuline des cellules β, dépend de la bonne tissulaire architecture, remodelage épithélial et le positionnement cellulaire dans l&#39;épithélium pancréatique de branchement 7,8. Cependant, comment morphogenèse de ramification se produit et est coordonné avec la prolifération et la différenciation dans le pancréas est largement inconnue. Ceci est en partie dû au fait que les connaissances actuelles sur ces processus de développement reposait presque exclusivement sur l&#39;analyse des échantillons fixés, alors que les événements morphogénétiques sont très dynamiques. Ici, nous présentons une méthode pour disséquer et de la souris en culture du pancréas embryonnaire ex vivo sur des bourgeons plats à fond de verre, ce qui permet la visualisation directe du pancréas en développement (figure 1). Ce culteure système est idéalement conçu pour la microscopie confocale à balayage laser et, en particulier, imagerie des cellules vivantes. Explants pancréatiques peuvent être préparés non seulement à partir d&#39;embryons de souris de type sauvage, mais aussi à partir de souches de souris génétiquement modifiées (transgéniques ou knock-out par exemple), ce qui permet en temps réel des études de phénotypes mutants. En outre, ce système culture ex vivo est précieux pour étudier les effets des composés chimiques sur le développement du pancréas, ce qui permet d&#39;obtenir des données quantitatives sur la prolifération et la croissance, l&#39;allongement, la ramification, tubulogenèse et la différenciation. En conclusion, le développement d&#39;une méthode in vivo du pancréas culture ex explant combiné avec l&#39;imagerie haute résolution fournit une base solide pour l&#39;observation d&#39;événements morphogénétiques et de différenciation tels qu&#39;ils se présentent dans l&#39;embryon de souris en développement.

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A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

Ici, nous décrivons une méthode pour l&#39;isolement, la culture et la manipulation du pancréas embryonnaire de la souris. Cela représente une excellente<em&gt; Ex vivo</em&gt; Système pour l&#39;étude des divers aspects du développement du pancréas, y compris la morphogenèse, la différenciation et la croissance. Explants de bourgeons pancréatiques peuvent être cultivées pendant plusieurs jours et utilisé dans une variété d&#39;applications différentes, y compris l&#39;ensemble de montage immunofluorescence et imagerie en temps réel.

Un système d&#39;<em&gt; Ex vivo</emLa culture&gt; de pancréas embryonnaire

The pancreas controls vital functions of our body,  including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar  levels1. Although in the ...

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A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

13.6K vues.  Max-Delbrück-Center for Molecular Medicine. Ici, nous décrivons une méthode pour l'isolement, la culture et la manipulation du pancréas embryonnaire de la souris. Cela représente une excellente Ex vivo Système pour l'étude des divers aspects du développement du pancréas, y compris la morphogenèse, la différenciation et la croissance. Explants de bourgeons pancréatiques peuvent être cultivées pendant plusieurs jours et utilisé dans une variété d'applications différentes, y...

Vidéo: A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  the formation and patterning of brain, neural tube, somite and heart primordia. Applications of chick embryo culture include electroporation of DNA or RNA constructs in order to analyze gene function, grafts of growth factor coated beads such as FGFs and BMPs , as well as whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry. This video demonstrates the different steps in chick embryo culture; First, the embryo is explanted in saline. Then, the embryo is centered on a glass ring. The membranes surrounding the embryo are lifted along the walls of the ring. The ring is then placed in a culture dish containing a pool of albumine. The culture dish is sealed and placed in a humid chamber, where the embryo is cultured for up to 24 hrs. Finally, the embryo is removed from the ring, fixed and processed for further applications. A troubleshooting guide is also presented.

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

This video demonstrates New culture, a method by which chick embryos are cultured outside the egg for up to 24 hr. This method enables one to study early development (primitive streak to 14 som.), a period corresponding to E7-9 in mouse. Applications of this technique include electroporation, in situ hybridization and immunohistochemistry.

Méthode pour la culture d&#39;embryons de poulet Early ex vivo (Nouvelle Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

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Biologie

An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications

Understanding the relationships between genetic and microenvironmental factors that drive normal and malformed embryonic development is fundamental for discovering new therapeutic strategies. Advancements in imaging technology have enabled quantitative investigation of the organization and maturing of the body plan, but later stage embryonic morphogenesis is less clear. Chicken embryos are an attractive vertebrate animal model system for this application because of its ease of culture and surgical manipulation. Early embryos can be cultured for a short time on filter paper rings, which enables complete optical access for cell patterning and fate studies1,2. Studying advanced developmental processes such as cardiac morphogenesis are traditionally performed through a window of the eggshell3-5, but this technique limits optical access due to window size. We previously developed a simple method to culture whole embryos ex-ovo on hexagonal weigh boats for up to 10 days, which enabled high resolution imaging via ultrasonography6,7. These cultures were difficult to transport, limiting the types of imaging tools available for live experiments. We here present an improved shell-less culture system with a cost-effective, portable environmental chamber. Eggs were cracked onto a hammock created by a polyurethane membrane (cling wrap) affixed circumferentially to a plastic cup partially filled with sterile water. The dimensions of the circumference and depth of the hammock were both critical to maintain surface tension, while the mechanics of the hammock and water beneath helped dampen vibrations induced by transportation. A small footprint circulating water bath was also developed to enable continuous temperature control during experimentation. We demonstrate the ability to culture embryos in this way for at least 14 days without morphogenic defect or delay and employ this system in several microsurgical and imaging applications.

An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications

In this article, we present a simple methodology to enable long-term ex-ovo avian embryo culture. This technique is ideal for longitudinal experimentation requiring complete optical accessibility and/or sterile transportation in avian embryos.

Une Ex-ovo- Poulet embryonnaire du système de culture approprié pour les applications d&#39;imagerie et de microchirurgie

Understanding the relationships between genetic and microenvironmental factors that drive normal and malformed embryonic development is fundamental for ...

A System for Culturing Iris Pigment Epithelial Cells to Study Lens Regeneration in Newt

Salamanders like newt and axolotl possess the ability to regenerate many of its lost body parts such as limbs, the tail with spinal cord, eye, brain, heart, the jaw 1. Specifically, newts are unique for its lens regeneration capability. Upon lens removal, IPE cells of the dorsal iris transdifferentiate to lens cells and eventually form a new lens in about a month 2,3. This property of regeneration is never exhibited by the ventral iris cells. The regeneration potential of the iris cells can be studied by making transplants of the in vitro cultured IPE cells. For the culture, the dorsal and ventral iris cells are first isolated from the eye and cultured separately for a time period of 2 weeks (Figure 1). These cultured cells are reaggregated and implanted back to the newt eye. Past studies have shown that the dorsal reaggregate maintains its lens forming capacity whereas the ventral aggregate does not form a lens, recapitulating, thus the in vivo process (Figure 2) 4,5. This system of determining regeneration potential of dorsal and ventral iris cells is very useful in studying the role of genes and proteins involved in lens regeneration.

In newt, the lens regenerates always from the dorsal iris by transdifferentiation of the iris pigmented epithelial cells (IPEs). Here we describe a procedure to culture dorsal and ventral newt IPE cells and their implantation to the newt eye. The implanted cells are then studied by tissue sectioning and immunohistochemistry.

Un système de culture de cellules épithéliales de l&#39;iris Pigment étudier la régénération Lens Newt

Salamanders like newt and axolotl possess the ability to regenerate many of its lost body parts such as limbs, the tail with spinal cord, eye, brain, ...

A 3D System for Culturing Human Articular Chondrocytes in Synovial Fluid

Cartilage destruction is a central pathological feature of osteoarthritis, a leading cause of disability in the US. Cartilage in the adult does not regenerate very efficiently in vivo; and as a result, osteoarthritis leads to irreversible cartilage loss and is accompanied by chronic pain and immobility 1,2. Cartilage tissue engineering offers promising potential to regenerate and restore tissue function. This technology typically involves seeding chondrocytes into natural or synthetic scaffolds and culturing the resulting 3D construct in a balanced medium over a period of time with a goal of engineering a biochemically and biomechanically mature tissue that can be transplanted into a defect site in vivo 3-6. Achieving an optimal condition for chondrocyte growth and matrix deposition is essential for the success of cartilage tissue engineering. 
 In the native joint cavity, cartilage at the articular surface of the bone is bathed in synovial fluid. This clear and viscous fluid provides nutrients to the avascular articular cartilage and contains growth factors, cytokines and enzymes that are important for chondrocyte metabolism 7,8. Furthermore, synovial fluid facilitates low-friction movement between cartilaginous surfaces mainly through secreting two key components, hyaluronan and lubricin 9 10. In contrast, tissue engineered cartilage is most often cultured in artificial media. While these media are likely able to provide more defined conditions for studying chondrocyte metabolism, synovial fluid most accurately reflects the natural environment of which articular chondrocytes reside in.
 Indeed, synovial fluid has the advantage of being easy to obtain and store, and can often be regularly replenished by the body. Several groups have supplemented the culture medium with synovial fluid in growing human, bovine, rabbit and dog chondrocytes, but mostly used only low levels of synovial fluid (below 20&#37;) 11-25. While chicken, horse and human chondrocytes have been cultured in the medium with higher percentage of synovial fluid, these culture systems were two-dimensional 26-28. Here we present our method of culturing human articular chondrocytes in a 3D system with a high percentage of synovial fluid (up to 100&#37;) over a period of 21 days. In doing so, we overcame a major hurdle presented by the high viscosity of the synovial fluid. This system provides the possibility of studying human chondrocytes in synovial fluid in a 3D setting, which can be further combined with two other important factors (oxygen tension and mechanical loading) 29,30 that constitute the natural environment for cartilage to mimic the natural milieu for cartilage growth. Furthermore, This system may also be used for assaying synovial fluid activity on chondrocytes and provide a platform for developing cartilage regeneration technologies and therapeutic options for arthritis.

A 3D system of culturing human articular chondrocytes in high levels of synovial fluid is described. Synovial fluid reflects the most natural microenvironment for articular cartilage, and can be easily obtained and stored. This system thus can be used for studying cartilage regeneration and for screening therapeutics for treating arthritis.

Un système 3D pour les chondrocytes articulaires humains Culture dans le liquide synovial

Cartilage destruction is a central pathological feature of osteoarthritis, a leading cause of disability in the US. Cartilage in the adult does not ...

Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells

In general, human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs)1 can be cultured under variable conditions. However, it is not easy to establish an effective system for culturing these cells. Since the culture conditions can influence gene expression that confers pluripotency in hESCs and hiPSCs, the optimization and standardization of the culture method is crucial.
The establishment of hESC lines was first described by using MEFs as feeder cells and fetal bovine serum (FBS)-containing culture medium2. Next, FBS was replaced with knockout serum replacement (KSR) and FGF2, which enhances proliferation of hESCs3. Finally, feeder-free culture systems enable culturing cells on Matrigel-coated plates in KSR-containing conditioned medium (medium conditioned by MEFs)4. Subsequently, hESCs culture conditions have moved towards feeder-free culture in chemically defined conditions5-7. Moreover, to avoid the potential contamination by pathogens and animal proteins culture methods using xeno-free components have been established8.
To obtain improved conditions mouse feeder cells have been replaced with human cell lines (e.g. fetal muscle and skin cells9, adult skin cells10, foreskin fibroblasts11-12, amniotic mesenchymal cells13). However, the efficiency of maintaining undifferentiated hESCs using human foreskin fibroblast-derived feeder layers is not as high as that from mouse feeder cells due to the lower level of secretion of Activin A14. Obviously, there is an evident difference in growth factor production by mouse and human feeder cells.
Analyses of the transcriptomes of mouse and human feeder cells revealed significant differences between supportive and non-supportive cells. Exogenous FGF2 is crucial for maintaining self-renewal of hESCs and hiPSCs, and has been identified as a key factor regulating the expression of Tgf&beta;1, Activin A and Gremlin (a BMP antagonist) in feeder cells. Activin A has been shown to induce the expression of OCT4, SOX2, and NANOG in hESCs15-16.
For long-term culture, hESCs and hiPSCs can be grown on mitotically inactivated MEFs or under feeder-free conditions in MEF-CM (MEF-Conditioned Medium) on Matrigel-coated plates to maintain their undifferentiated state. Success of both culture conditions fully depends on the quality of the feeder cells, since they directly affect the growth of hESCs.
Here, we present an optimized method for the isolation and culture of mouse embryonic fibroblasts (MEFs), preparation of conditioned medium (CM) and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) to assess the levels of Activin A within the media.

The quality of mouse embryonic fibroblasts (MEFs) is dictated by the right strain of mouse such as CF-1. Pluripotency-supportive MEFs and conditioned media (CM) obtained from these should contain optimal concentrations of Activin A, Gremlin and Tgf&beta;1 needed for the Activin/Nodal and FGF pathways to co-operatively maintain self-renewal and pluripotency.

Préparation des cellules de souris embryonnaires fibroblastiques conviennent pour la culture embryonnaires humaines et cellules souches pluripotentes induites

In general, human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs)1 can be cultured under variable conditions. However, it ...

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

Developmental studies in the mouse are hampered by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to isolate and culture individual organs of interest are essential to provide a method of both visualizing changes in development and allowing novel treatment strategies. To promote the long-term culture of the embryonic heart at late stages of gestation, we developed a protocol in which the excised heart is cultured in a semi-solid, dilute Matrigel. This substrate provides enough support to maintain the three-dimensional structure but is flexible enough to allow continued contraction. In brief, hearts are excised from the embryo and placed in a mixture of cold Matrigel diluted 1:1 with growth medium. After the diluted Matrigel solidifies, growth medium is added to the culture dish. Hearts excised as late as embryonic day 16.5 were viable for four days post-dissection. Analysis of the coronary plexus shows that this method does not disrupt coronary vascular development. Thus, we present a novel method for long-term culture of embryonic hearts.

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

Developmental studies in the mouse are hampered by the inaccessibility of the embryo during gestation. To promote the long-term culture of the embryonic heart at late stages of gestation, we developed a protocol in which the excised heart is cultured in a semi-solid, dilute Matrigel.

A Novel<em&gt; Ex vivo</em&gt; Méthode de la culture pour le embryonnaire Souris Coeur

Developmental studies in the mouse are hampered  by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to  isolate and culture individual ...

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

C. elegans is a powerful model system, in which genetic and molecular techniques are easily applicable. Until recently though, techniques that require direct access to cells and isolation of specific cell types, could not be applied in C. elegans. This limitation was due to the fact that tissues are confined within a pressurized cuticle which is not easily digested by treatment with enzymes and/or detergents. Based on early pioneer work by Laird Bloom, Christensen and colleagues 1 developed a robust method for culturing C. elegans embryonic cells in large scale. Eggs are isolated from gravid adults by treatment with bleach/NaOH and subsequently treated with chitinase to remove the eggshells. Embryonic cells are then dissociated by manual pipetting and plated onto substrate-covered glass in serum-enriched media. Within 24 hr of isolation cells begin to differentiate by changing morphology and by expressing cell specific markers. C. elegans cells cultured using this method survive for up 2 weeks in vitro and have been used for electrophysiological, immunochemical, and imaging analyses as well as they have been sorted and used for microarray profiling.

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

We describe here a revised protocol for large-scale culture of embryonic C. elegans cells. Embryonic C. elegans cells cultured in vitro using this method, appear to differentiate and recapitulate the expression of genes in a cell specific manner. Techniques that require direct access to the cells or isolation of specific cell types from the other tissues can be applied on C. elegans cultured cells.

Un procédé de culture embryonnaire<em&gt; C. elegans</em&gt; Cellules

C. elegans is a powerful model system, in which genetic and molecular techniques are easily applicable. Until recently though, techniques that require ...

Ex vivo Culture of Mouse Embryonic Skin and Live-imaging of Melanoblast Migration

Melanoblasts are the neural crest derived precursors of melanocytes; the cells responsible for producing the pigment in skin and hair. Melanoblasts migrate through the epidermis of the embryo where they subsequently colonize the developing hair follicles1,2. Neural crest cell migration is extensively studied in vitro but in vivo methods are still not well developed, especially in mammalian systems. One alternative is to use ex vivo organotypic culture3-6. Culture of mouse embryonic skin requires the maintenance of an air-liquid interface (ALI) across the surface of the tissue3,6. High resolution live-imaging of mouse embryonic skin has been hampered by the lack of a good method that not only maintains this ALI but also allows the culture to be inverted and therefore compatible with short working distance objective lenses and most confocal microscopes. This article describes recent improvements to a method that uses a gas permeable membrane to overcome these problems and allow high-resolution confocal imaging of embryonic skin in ex vivo culture6. By using a melanoblast specific Cre-recombinase expressing mouse line combined with the R26YFPR reporter line we are able to fluorescently label the melanoblast population within these skin cultures. The technique allows live-imaging of melanoblasts and observation of their behavior and interactions with the tissue in which they develop. Representative results are included to demonstrate the capability to live-image 6&#160;cultures in parallel.

Ex vivo Culture of Mouse Embryonic Skin and Live-imaging of Melanoblast Migration

We describe the dissection and ex vivo culture of mouse embryonic skin. The culture system maintains an air-liquid interface across the tissue surface and allows imaging on an inverted microscope. Melanoblasts, a component of the developing skin, are fluorescently labeled allowing their behavior to be observed using confocal microscopy.

Ex vivo Culture de la peau de souris embryonnaires et Live-imagerie de la migration mélanoblaste

Melanoblasts are the neural crest derived precursors of melanocytes; the cells responsible for producing the pigment in skin and hair. Melanoblasts ...

An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development

The thyroid is a bilobated endocrine gland localized at the base of the neck, producing the thyroid hormones T3, T4, and calcitonin. T3 and T4 are produced by differentiated thyrocytes, organized in closed spheres called follicles, while calcitonin is synthesized by C-cells, interspersed in between the follicles and a dense network of blood capillaries. Although adult thyroid architecture and functions have been extensively described and studied, the formation of the &#8220;angio-follicular&#8221; units, the distribution of C-cells in the parenchyma and the paracrine communications between epithelial and endothelial cells is far from being understood.
This method describes the sequential steps of mouse embryonic thyroid anlagen dissection and its culture on semiporous filters or on microscopy plastic slides. Within a period of four days, this culture system faithfully recapitulates in vivo thyroid development. Indeed, (i) bilobation of the organ occurs (for e12.5 explants), (ii) thyrocytes precursors organize into follicles and polarize, (iii) thyrocytes and C-cells differentiate, and (iv) endothelial cells present in the microdissected tissue proliferate, migrate into the thyroid lobes, and closely associate with the epithelial cells, as they do in vivo.
Thyroid tissues can be obtained from wild type, knockout or fluorescent transgenic embryos. Moreover, explants culture can be manipulated by addition of inhibitors, blocking antibodies, growth factors, or even cells or conditioned medium. Ex vivo development can be analyzed in real-time, or at any time of the culture by immunostaining and RT-qPCR.
In conclusion, thyroid explant culture combined with downstream whole-mount or on sections imaging and gene expression profiling provides a powerful system for manipulating and studying morphogenetic and differentiation events of thyroid organogenesis.

An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development

This protocol describes dissection of mouse embryonic thyroid anlagen and the culture of explants on semiporous filters or on microscopy plastic slides. This system is ideal to study morphogenetic or differentiation events occurring during thyroid development of wild type or knockout embryos, and is amenable to gain- and loss-of-function experiments.

Un<em&gt; Ex vivo</em&gt; Système de culture à étudier la thyroïde développement

The thyroid is a bilobated endocrine gland localized at the base of the neck, producing the thyroid hormones T3, T4, and calcitonin. T3 and T4 are ...

In Vitro Pancreas Organogenesis from Dispersed Mouse Embryonic Progenitors

The pancreas is an essential organ that regulates glucose homeostasis and secretes digestive enzymes. Research on pancreas embryogenesis has led to the development of protocols to produce pancreatic cells from stem cells 1. The whole embryonic organ can be cultured at multiple stages of development 2-4. These culture methods have been useful to test drugs and to image developmental processes. However the expansion of the organ is very limited and morphogenesis is not faithfully recapitulated since the organ flattens. 
We propose three-dimensional (3D) culture conditions that enable the efficient expansion of dissociated mouse embryonic pancreatic progenitors. By manipulating the composition of the culture medium it is possible to generate either hollow spheres, mainly composed of pancreatic progenitors expanding in their initial state, or, complex organoids which progress to more mature expanding progenitors and differentiate into endocrine, acinar and ductal cells and which spontaneously self-organize to resemble the embryonic pancreas. 
We show here that the in vitro process recapitulates many aspects of natural pancreas development. This culture system is suitable to investigate how cells cooperate to form an organ by reducing its initial complexity to few progenitors. It is a model that reproduces the 3D architecture of the pancreas and that is therefore useful to study morphogenesis, including polarization of epithelial structures and branching. It is also appropriate to assess the response to mechanical cues of the niche such as stiffness and the effects on cell&#180;s tensegrity.

In Vitro Pancreas Organogenesis from Dispersed Mouse Embryonic Progenitors

The three-dimensional culture method described in this protocol recapitulates pancreas development from dispersed embryonic mouse pancreas progenitors, including their substantial expansion, differentiation and morphogenesis into a branched organ. This method is amenable to imaging, functional interference and manipulation of the niche.

In Vitro pancréas organogenèse du dispersées progéniteurs embryonnaires de souris

The pancreas is an essential organ that regulates glucose homeostasis and secretes digestive enzymes. Research on pancreas embryogenesis has led to the ...