We would like to thank Dr. Hiroshi Miyazaki, Dr. Scott Henderson, Dr. Todd Kitten, Dr. Justin Hutcherson, Dr. Catherine Jauregui, and Collin R. Berry. This work was supported by NIH NIDCR grants R01DE016124, R01DE018039, and R01DE023304 to J.P. Lewis.
Microscopy was performed at the VCU Department of Anatomy and Neurobiology Microscopy Facility, supported, in part, with funding from NIH-NINDS Center core grant (5P30NS047463).

Les protocoles suivants décrivent des procédés de mise en culture et l&#39;étude de l&#39;invasion par les espèces anaérobies, P. gingivalis; Toutefois, ces protocoles peuvent être utilisés pour un certain nombre d&#39;agents pathogènes anaérobies. Bien HUVECs sont utilisés, ce protocole peut être utilisé pour d&#39;autres cellules eucaryotes fois immunitaires et non immunitaires. 1. anaérobie Chambre utilisation et d&#39;entretien Remarque: P. gingivalis est un anaérobie sensibles à des niveaux normaux d&#39;oxygène rencontrées dans l&#39;air ambiant. Un environnement anaérobie contrôlé est essentiel pour la culture de P. gingivalis. <ol><li> Ici, maintenir une atmosphère artificielle désigné comme gaz anaérobie mixte (80% de N 2, 10% de H2, 10% CO 2) dans une chambre anaérobie de vinyle (figure 1A). Utiliser un sas (figure 1B) pour transférer des objets dans l&#39;environnement du laboratoire de la chambre anaérobie. Le sas fonctionne manuellement, twpurge de la glace avec du gaz N 2 avant d&#39;introduire le gaz anaérobie mixte. </li><li> Utilisation d&#39;une colonne d&#39;élimination de sulfure d&#39;hydrogène (Figure 1C) pour l&#39;enlèvement d&#39;entretien de l&#39;hydrogène sulfuré indésirable. Placer un déshumidificateur dans la chambre pour éliminer H 2 O créé par le catalyseur et d&#39;éviter les aérosols qui facilitent la propagation de la contamination. Remarque: Le sulfure d&#39;hydrogène est un sous-produit métabolique naturel de nombreuses bactéries anaérobies et son accumulation est toxique pour les bactéries et peut entraîner des dommages à l&#39;électronique et de diminuer la durée de vie d&#39;un catalyseur. </li><li> Utiliser une boîte de ventilateur pour faire circuler l&#39;atmosphère de la chambre à travers un catalyseur au palladium, ce qui élimine l&#39;oxygène en présence d&#39;hydrogène (figure 1D). Remarque: Une atmosphérique (HEPA) faire recirculer l&#39;air élimine les contaminants d&#39;une taille de 0,22 pm ou plus. </li><li> Culture bactéries anaérobies dans un incubateur à 37 ° qui se trouve à l&#39;intérieur de l&#39;anaérobiechambre. Utilisez des techniques aseptiques standards lorsque vous travaillez à l&#39;intérieur de la chambre anaérobie. </li></ol><img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/53408/53408fig1.jpg" /> Figure 1. chambre anaérobie de vinyle et ses composants. (A) une chambre anaérobie de vinyle scellé complètement à partir de l&#39;oxygène atmosphérique fournit espace de travail pour deux personnes à la fois (en 32 x 78 in). Il contient un incubateur réglé à 37 ° C (milieu du dos). (B) un sas est utilisé pour le transfert des objets dans l&#39;environnement de laboratoire à la chambre anaérobie. Sur la photo, un sas automatique commandé par un contrôleur qui peut être programmé pour exécuter automatiquement les procédures de vide et de purge nécessaires pour créer un environnement anaérobie. (C) Un sulfure d&#39;hydrogène colonne d&#39;élimination fournit haute capacité élimination sans entretien des indésirables du sulfure d&#39;hydrogène. (D) Deux boîtes de ventilateur de catalyseur sontplacé dans toute la chambre anaérobie pour faire circuler l&#39;atmosphère de la chambre à travers un catalyseur au palladium, ce qui, en présence d&#39;hydrogène, élimine l&#39;oxygène. La chambre anaérobie est mis en place selon les instructions du fabricant. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53408/53408fig1large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> 2. Préparation des bactéries anaérobies Remarque: P. gingivalis est aérotolérants et peut être stocké dans des conditions aérobies, mais il ne sera pas croître en présence d&#39;oxygène à des niveaux plus élevés de 6% 17,18. Une chambre anaérobie est nécessaire pour la bonne culture de P. gingivalis et d&#39;autres espèces anaérobies (figure 1). Une bonne formation et d&#39;éducation sur l&#39;utilisation de la chambre anaérobie est nécessaire avant de travailler avec microanaerobes 19. <ol><li> Equilibrer tous les milieux liquides et des plaques à condit anaérobieions pendant au moins 12 heures avant l&#39;expérimentation pour éliminer l&#39;oxygène résiduel. </li><li> Transfert P. gingivalis de -80 ° C congélateur chambre anaérobie, laisser décongeler. </li><li> Streak P. gingivalis sur des plaques de gélose au sang de soja trypticase (TSA II avec du sang de mouton à 5%). Enveloppez plaques en parafilm et conserver à 37 ° C dans un incubateur anaérobie pendant 4-7 jours. </li><li> Inoculer P. gingivalis dans 3 perfusion cardiaque ml du cerveau (BHI) complétées par hémine et ménadione, un milieu liquide non-sélectifs enrichis pour l&#39;isolement et la culture de micro-organismes anaérobies et fastidieux, en utilisant des boucles stériles. Remarque: Pour le stockage à long terme, mélanger les cultures bactériennes préparés BHI avec le glycérol ou DMSO (10-20% concentration finale) et placer dans un congélateur à -80 ° C. </li><li> Préparer une culture de départ de P. gingivalis en faisant une dilution 1:10 et permet aux bactéries de croître jusqu&#39;à la phase mid-log. </li></ol> Note: La densité optique du bacsuspension TÉRIAU est déterminé et la concentration pour chaque souche bactérienne à examiner est ajustée. Pour P. gingivalis une suspension à DO 660 de 0,7 correspond à la phase mi-log et ~ 7 x 10 8 cellules / ml. Les conditions de croissance décrites dans le protocole ci-dessus sont spécifiques de P. gingivalis et peuvent avoir besoin d&#39;être adapté pour d&#39;autres souches bactériennes. 3. cellules endothéliales Culture Remarque: Achat regroupé HUVECs primaires et de la culture en milieu de base contenant des facteurs de croissance endothéliaux vasculaires (VEGF) à 37 ° C dans 5% de CO 2 selon les instructions du fabricant. <ol><li> HUVECs de semences en flacons T-75 à 2,5 x 10 5 cellules / flacon dans 15 ml médias VEGF. Remarque: Vérifiez la viabilité par une dilution 1: 1 avec 4,0% de bleu trypan. Les cellules avec une membrane compromis conservera bleu trypan, les cellules saines avec des membranes intactes apparaîtront blanches lorsqu&#39;elles sont visualisées sous un microscope optique binoculaire. ConT 100 cellules, en sorte que plus de 80% des cellules sont viables 20. </li><li> Remplacez le support tous les 2 jours avec les médias préchauffé VEGF fraîche jusqu&#39;à ce que les cellules atteignent ~ 80% de confluence. </li><li> Laver les cellules une fois avec PBS préchauffé. Libérer les cellules de la fiole T75 par incubation avec 2 ml de trypsine-EDTA (0,25%) pendant 5 min, suivie de neutralisation par une solution de 2 ml de trypsine. </li><li> Recueillir HUVEC en suspension dans un tube conique de 50 ml. Laver toutes les cellules supplémentaires à partir de flacons T-75 avec du PBS et 50 ml de transférer des tubes coniques. </li><li> Centrifuger les cellules à 200 g pendant 10 min. </li><li> Retirer le surnageant, suspendre culot cellulaire dans 10 ml de médias de VEGF préchauffé. </li><li> Déterminer la concentration cellulaire en utilisant un hémocytomètre ou similaire dispositif de comptage cellulaire. </li><li> Calcul du montant de la suspension cellulaire à ajouter à soit plaque de 6 puits (400 000 / puits) ou une plaque de 12 puits avec des lamelles (50 000 / puits). HUVECs sera prêt pour l&#39;expérimentation le lendemain. </li></ol> 4. Essai de survie Invasion / Interaction(Placage) Remarque: Lorsque vous effectuez ce test, préparer deux plaques de cellules endothéliales ensemencées à 400.000 cellules / puits 6 puits. Une plaque sera utilisée pour évaluer bactéries fixées à internalisés et par des cellules hôtes. L&#39;autre plaque représentera pour les bactéries intracellulaires. La plaque de 6 puits permet en triple de deux échantillons à être effectuées en une seule expérience. Pour un aperçu de ce protocole s&#39;il vous plaît se référer à l&#39;analyse de la survie organigramme (Figure 2). <ol><li> Préparer des bactéries anaérobies comme décrit ci-dessus (voir la section 1) jusqu&#39;à ce qu&#39;ils atteignent la croissance mi-log (OD 660 0,5-0,7). </li><li> Bactéries centrifuger à 5000 g pendant 10 min. Remarque: Si la centrifugeuse est en dehors de la chambre anaérobie, porter échantillons bactériens dans un tube de 15 ml hermétiquement fermés, enveloppez le bouchon avec du parafilm pour éviter les fuites d&#39;oxygène. </li><li> Placez granulés P. gingivalis retour dans la chambre, éliminer le surnageant. Laver avec du PBS, les bactéries de granulés de nouveau avant remise en suspension dans VEGF-moidia. Préparer des suspensions pour toutes les souches bactériennes à tester à une DO 660 de 0,7 qui correspond à la phase mi-log (environ 7 x 10 8 cellules / ml). Les bactéries sont maintenant prêts pour l&#39;infection. </li><li> Transfert des plaques à 6 puits contenant des cellules HUVEC à partir de tissu en culture incubateur. Chambre anaérobie Retirez le support et laver trois fois avec PBS anaérobie. Ajouter 2 ml de milieu de VEGF anaérobie dans chaque puits et placer les plaques à 37 ° C dans l&#39;incubateur anaérobie pendant 20 minutes pour équilibrer la température de l&#39;infection. Remarque: les bactéries de plaque sur des plaques d&#39;agar de sang pour assurer ceux utilisés pour l&#39;infection sont homogènes et non contaminés lors de l&#39;infection. </li><li> Infecter les cellules hôtes avec des bactéries à une multiplicité d&#39;infection (MOI: bactéries hôtes) de 100: 1. Remarque: le nombre de cellules HUVEC est déterminé en effectuant un test d&#39;exclusion trypan sur un seul bien avant l&#39;infection. Le nombre de cellules bactériennes est déterminé par la densité optique (par exemple, de 0,5 OD = 5 x 10 8 cellules / ml). Bacterial concentration est ajustée à bon MOI basée sur la concentration HUVECs 21. </li><li> Placer plaques de 6 puits avec des cellules HUVEC infectées en incubateur anaérobie et les bactéries permettent d&#39;interagir avec les cellules hôtes pendant 30 min. </li><li> Préparation de saponine dans du BHI (1,0% p / v) à l&#39;intérieur de la chambre anaérobie et filtrer à travers un filtre de 0,2 um. </li><li> La survie de deux bactéries fixées et intériorisées. <ol><li> Retirer les plaques de l&#39;incubateur, les médias aspirer, laver trois fois avec PBS anaérobie et ajouter 2 ml filtrés 1,0% de saponine (préparé comme décrit dans l&#39;étape 4.8). Incuber pendant 15 min pour permettre la lyse de la cellule hôte. </li><li> Racler fond de chaque puits avec un grattoir à cellules. Recueillir le mélange de cellules de chaque puits et faire une dilution de 1: 1 dans du BHI. </li><li> Passez à réaliser des dilutions de l&#39;échantillon. Selon les espèces bactériennes et de la concentration, de régler des dilutions en série. Commencez avec 1: 100 ou 1: 1000 dilutions. </li><li> Plaque 200 ul de la dilution souhaitée sur des plaques de gélose au sang. Wrap til plaques en parafilm et placer dans l&#39;incubateur anaérobie à 37 ° C. </li><li> Après sept jours d&#39;incubation à 37 ° C, retirer les plaques et à compter unités formant colonie (UFC) en utilisant une boîte à lumière de compter manuellement colonies. Remarque: UFC sont énumérés. Pour de plus grandes quantités de UFC, les images peuvent être prises et des logiciels peuvent être utilisés pour faciliter le dénombrement des UFC. </li></ol></li><li> La survie des bactéries internalisées. <ol><li> Retirer les plaques de l&#39;incubateur. Laver trois fois avec du PBS et anaérobie ajouter 2 ml de milieux de VEGF avec additionné d&#39;antibiotiques (300 pg / ml de gentamicine et de 400 ug / ml de métronidazole). </li><li> Incuber pendant 1 heure. Veillez à tester les antibiotiques de sorte qu&#39;ils sont 100% efficace pour tuer la souche bactérienne désirée et assurez-vous qu&#39;ils ne pénètrent pas dans les cellules hôtes 22,23. </li><li> Aspirer le milieu, ajouter 2 mL de 1,0% filtrée saponine. Incuber pendant 15 min pour permettre la lyse de la cellule hôte. </li><li> Racler le fond de chaque well avec racleur de cellules. Recueillir le mélange de cellules de chaque puits et faire dilution 1: 1 dans du BHI. </li><li> Préparer des dilutions en série de l&#39;échantillon (1: 100, 1: 1000). </li><li> Plaque 200 ul de la dilution souhaitée sur des plaques de gélose au sang. Enveloppez plaques en parafilm et placer dans un incubateur anaérobie. </li><li> Après sept jours d&#39;incubation à 37 ° C enlever les plaques et à compter UFC. </li></ol></li></ol><img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/53408/53408fig2.jpg" /> Figure 2. Représentation schématique d&#39;un protocole utilisé pour la survie des bactéries anaérobies avec des cellules eucaryotes. Les deux tests pour une survie bactérienne totale et la survie des bactéries intériorisées peuvent être effectuées en même temps. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53408/53408fig2large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> 5. L&#39;internalisation des bactéries dans This HostLLS (microscopie à fluorescence) Remarque: P. gingivalis est marqué avec la 2 &#39;, 7&#39;-bis- (2-carboxyéthyl) -5- (et-6) -carboxyfluorescéine, acétoxyméthyl ester (BCECF-AM). BCECF-AM est un colorant de membrane perméable non fluorescent; BCECF sa conversion en fluorescéine sous l&#39;action des esterases intracellulaires de peut indiquer la viabilité cellulaire. P. gingivalis est marqué avec le colorant BCECF-AM et ensuite utilisé pour infecter des cellules eucaryotes. Après l&#39;infection, les cellules sont fixées et marquées au DAPI et TRITC-phalloïdine. La tache de DAPI utilisé pour colorer le noyau de la cellule eucaryote sera également étiqueter noyau de la cellule bactérienne, qui fournit une contre-mesure pour identifier les bactéries non viables qui ne peuvent pas métaboliquement cleave BCECF-AM. Les cellules hôtes sont mises en évidence par la phalloïdine-TRITC, un colorant rouge de l&#39;actine. <ol><li> Lamelles autoclave. Ajouter stérilement lamelles à plaques à 12 puits avant de semer les cellules endothéliales à 5 x 10 4 cellules / puits. (Journée Préparé avant l&#39;expérience) </li><li&gt; Ai préparés sur des cellules endotheliales de 18 mm (# 1.5) d&#39;épaisseur Lamelles circulaires dans des plaques à 12 puits comme décrit ci-dessus. </li><li> Préparer bactéries anaérobies cultivées jusqu&#39;à la phase mid-log (OD 660 = 0,5-0,7) comme décrit dans l&#39;article 1. </li><li> Laver les bactéries anaérobies 2x avec du PBS par centrifugation à 5000 xg et de mise en suspension le culot dans du PBS à 5-7 x 10 8 cellules / ml. </li><li> Ajouter 20 ul de 0,2 mM de BCECF-AM à 2 ml de suspension bactérienne (5-7 x 10 8 cellules / ml) jusqu&#39;à une concentration finale de BCECF-AM de 2 uM. </li><li> Incuber à 37 ° C pendant 30 min dans l&#39;obscurité. </li><li> Des plaques de transfert avec les cellules endothéliales ensemencées sur 18 mm (# 1.5) d&#39;épaisseur des lamelles circulaires de culture de tissu dans la chambre incubateur anaérobie. Laver avec du PBS et l&#39;échange avec les médias de VEGF anaérobie. Remarque: Vérifiez que HUVECs sont en bonne santé sous un microscope optique. HUVEC devrait être ~ 80% de confluence, la morphologie devrait être comparable à des fabricants. </li><li> Centrifuger étiqueté à bactéries5000 xg pendant 10 min pour éliminer le colorant résiduel BCECF-AM. Mettre en suspension dans 2 ml de milieu de VEGF anaérobie. </li><li> Infecter les cellules hôtes avec des bactéries marquées à MOI de 100: 1 (bactéries: accueil). </li><li> Incuber à chambre anaérobie à 37 ° C pendant 30 min. </li><li> Après que les cellules de lavage de l&#39;infection avec PBS trois fois et fixer fraîchement préparée 4,0% de paraformaldehyde pendant 10 min. Remarque: Après que les cellules de fixation, l&#39;expérience peut être menée à l&#39;extérieur de la chambre anaérobie. </li><li> Laver avec lamelles de PBS à trois reprises. </li><li> Ajouter 1 ml de 0,2% de Triton X-100 pendant 10 min. </li><li> Laver avec lamelles de PBS à trois reprises. </li><li> Ajouter 50 ul de TRITC phalloïdine (50 ug / ml) à lamelles pendant 45 minutes. </li><li> Lavez lamelles de trois fois, retirer de la plaque de 12 puits et les placer sur une diapositive avec soft-jeu milieu de montage contenant DAPI. Sceller les côtés avec du vernis à ongles. Remarque: Les lames peuvent être stockées pendant quelques mois dans l&#39;obscurité. Évitez exposition à la lumière pour éviter photo-blanchiment. </li><li> Voir les diapositivesen utilisant un microscope confocal. <ol><li> Ici, utilisez un système 34 de canal spectrale (détecteur de réseau 32-canal et deux détecteurs de PMT de côté, plus un détecteur de lumière transmise) configuré autour d&#39;un AxioObserver (inversé) stand avec un étage XY motorisé. Le système dispose de cinq lasers: diode bleue (405 nm), multi-ligne Argon (458, 488, 514 nm), diode verte (561 nm), rouge HeNe (633 nm) et un laser pulsé 440 nm. Équipé d&#39;un système d&#39;imagerie de vie de fluorescence avec 2 détecteurs de GaAsP hybrides (pour FRET-FLIM). </li><li> Détecter la fluorescence à partir de DAPI et TRITC dans une chaîne à l&#39;aide d&#39;un filtre bi-bande avec des longueurs d&#39;onde d&#39;excitation de 340-380 nm et 540-560 nm, et un filtre d&#39;émission de 435-485 nm et 570-590 nm, respectivement. Détecter la fluorescence de BCECF-AM en utilisant un filtre avec une excitation longueur d&#39;onde de 440-500 nm et un filtre d&#39;émission de 510 à 590 nm. Remarque: Les commandes de BCECF-AM doivent être effectuées sur chaque souche bactérienne à l&#39;étude pour assurer l&#39;étiquetage approprié des bactéries viables. Première valider que nonviabLe bactéries sont DAPI-positif et BCECF négatif. Deuxièmement, veiller à ce que des bactéries vivantes peuvent métaboliser BCECF-AM dans la fluorescéine BCECF. Peut-être besoin d&#39;être testés pour l&#39;étiquetage optimale des concentrations variables de bactéries ou BCECF-AM colorant. </li></ol></li></ol>

Authors have nothing to disclose.

Tous les procédés ci-dessus peuvent être utilisées pour concevoir des dosages spécifiques pour évaluer l&#39;interaction entre les bactéries anaérobies avec des cellules eucaryotes. Cependant, il ya plusieurs considérations à effectuer avec succès les expériences. D&#39;abord, les souches microbiennes à être utilisés dans une étude. Il est essentiel dans la comparaison des deux souches à la fois le test de survie, ainsi que par une analyse par microscopie qu&#39;ils sont à ...

Les bactéries anaérobies colonisent presque toutes les surfaces du corps humain. Bien prédominant dans la flore intestinale des voies génito-urinaires et où les concentrations d&#39;oxygène sont faibles, ils existent également à des niveaux élevés sur la peau, de la bouche, du nez et de la gorge 1. Les bactéries anaérobies sont une cause fréquente d&#39;infections endogènes et sont fréquemment isolés à partir de sites malades. Toutefois, en raison de leur nature fastidieuse, anaérobies peuvent être difficiles à isoler et à la culture. Les études portant sur les bactéries anaérobies doivent être effectuées dans des conditions restreintes. Techniques anaérobie-culture moderne permettent aux chercheurs d&#39;imiter les paramètres anaérobies nécessaires à l&#39;étude de nombreuses souches de laboratoire anaérobie ou même des isolats cliniques 2,3. Des bactéries anaérobies pathogènes ont développé une relation dynamique et co-évolution avec les cellules de l&#39;hôte dans lequel ils résident. La plupart des bactéries anaérobies sont sensibles à la destruction par la réponse immunitaire de l&#39;hôte avant d&#39;atteindre infectiniveaux UO. Cependant, certaines bactéries pathogènes ont développé des mécanismes pour échapper à ou dénaturer la réponse immunitaire de l&#39;hôte. Ils atteindre cet objectif par le biais de mécanismes tels que l&#39;évasion de la reconnaissance immunitaire, neutralisation des médiateurs immunitaires, l&#39;altération de l&#39;immunité à médiation cellulaire, l&#39;invasion des cellules hôtes, et la modification de la signalisation 4 immunitaire. Porphyromonas gingivalis, un anaérobie à Gram négatif impliquées à la fois orale et maladies, extra- est un exemple d&#39;un agent pathogène bactérien très adapté capable de provoquer des changements pathogènes chez l&#39;hôte 7.5. Des poches de la plaque de biofilm courus dans de profondes crevasses formées entre les dents et le tissu muqueux gingival peuvent abriter des bactéries anaérobies qui sont protégés de l&#39;oxygène atmosphérique 8. Ces poches parodontales servir de niche de divers agents pathogènes anaérobies, telles que P. 9 gingivalis. P. gingivalis est un agent pathogène de la distorsion qui est capable de remodelering la communauté microbienne buccale de manière à promouvoir le développement et la progression des maladies parodontales 10. Elle produit un grand nombre de facteurs de virulence qui sont actifs contre un large spectre de protéines de l&#39;hôte et fournit des mécanismes pour l&#39;évasion de 11 défenses de l&#39;hôte. Il est également capable d&#39;envahir épithéliales, endothéliales, fibroblastes et les cellules du ligament parodontal in vitro et in vivo de 12 à 14 15. En envahissant efficacement les cellules de l&#39;hôte, P. gingivalis peut échapper à l&#39;immunité de l&#39;hôte. Invasion efficace de cellules hôtes non seulement permet à la bactérie de se échapper défenses de l&#39;hôte, mais sert également de réservoir pour l&#39;avenir ré-infection ainsi que modifie la cellule hôte. Des études sur les mécanismes moléculaires impliqués dans l&#39;adhésion et l&#39;internalisation de la bactérie par des cellules hôtes sont nécessaires. Recherche dans plusieurs laboratoires se concentre sur la compréhension des événements moléculaires associés à l&#39;internalisation de P. gingivalis par les cellules hôtesainsi que les mécanismes utilisés pour réprimer et détourner la réponse immunitaire et survivre aux mécanismes de défense de l&#39;hôte hostiles. Il existe de nombreux dosages capables d&#39;identifier et de caractériser des agents pathogènes qui sont capables d&#39;envahir les cellules hôtes. Cependant, des études in vitro avec des agents pathogènes anaérobies posent de nombreux problèmes expérimentaux pour le chercheur, principalement parce qu&#39;il est difficile de réaliser des études qui reposent sur ​​des instruments encombrants en l&#39;absence d&#39;oxygène. Cette situation est aggravée par le fait que les cellules eucaryotes besoin d&#39;oxygène pour se développer et doivent donc être préparés séparément dans des incubateurs de culture de tissus. Une façon d&#39;éviter ces obstacles serait d&#39;effectuer les études sous oxygène atmosphérique, mais ce serait faire de la croissance de bactéries anaérobies impossible. Une autre méthode serait d&#39;utiliser des bactéries tuées par la chaleur à infecter et à étudier les interactions de la cellule hôte. Cependant, des différences existent entre les bactéries tuées par la chaleur et viables qui diminuent la pertinence de la interacti hôte-pathogènele 16. Il est central pour étudier les bactéries viables avec l&#39;expression inchangé interagir avec des cellules hôtes; par conséquent, des procédés pour cultiver P. gingivalis dans un cadre anaérobie sont donnés. En outre, deux protocoles rentables simples sont démontrées pour évaluer la capacité de P. gingivalis à être internalisée par les cellules humaines ombilicales veineuses endothéliales (HUVEC). Le premier protocole est basé sur le dosage de protection populaire antibiotique. Bien que le test est simple, les considérations lors de l&#39;utilisation de micro-organismes anaérobies sont donnés. Le deuxième protocole nécessite l&#39;utilisation d&#39;un microscope à fluorescence à balayage visualiser et interagir internalisé P. gingivalis. Chaque test a ses limites et avantages qui seront discutés de fournir au chercheur un aperçu pour l&#39;étude de l&#39;envahissement de bactéries anaérobies. Bien que le manuscrit en cours étudie P. gingivalis et HUVECs, ces protocoles peuvent être utilisés pour de nombreuses autres bactéries anaérobies ainsique pour les autres types de cellules hôtes.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Vinyl Anaerobic Chamber-Type B</td>
			<td>Coy Laboratory Products</td>
			<td></td>
			<td>Model 2000 incubator&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TSA II Trypticase Soy Agar w/5% Sheep Blood</td>
			<td>BBL</td>
			<td>221261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Umbilical Vein Endothelial Cells 10-donor Pool</td>
			<td>LifeLine Technology</td>
			<td>FC-0044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VascuLife VEGF Medium Complete Kit</td>
			<td>LifeLine Technology</td>
			<td>LL-0003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypKit</td>
			<td>LifeLine</td>
			<td>LL-0013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>Riedel-de Haen</td>
			<td>16109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin Sulfate Salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G-1264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metronidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M-3761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCECF-AM</td>
			<td>LifeTechnologies</td>
			<td>B1150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRITC Phalloidin&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1951</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 mm Circular Coverslips</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72222-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VectaShield Mounting Medium with DAPI</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

porphyromonas gingivalis as a model organism for assessing interaction of anaerobic bacteria with host cells

Les bactéries anaérobies sont beaucoup plus nombreux aérobies dans de nombreuses niches humaines telles que l&#39;intestin, de la bouche et le vagin. En outre, les infections anaérobies sont fréquents et souvent d&#39;origine indigène. La capacité de certains agents pathogènes anaérobies à envahir les cellules humaines leur donne des mesures d&#39;adaptation pour échapper à l&#39;immunité innée, ainsi que pour moduler le comportement de la cellule hôte. Cependant, veiller à ce que les bactéries anaérobies sont en direct pendant l&#39;enquête expérimentale des événements peuvent poser des problèmes. Porphyromonas gingivalis, un anaérobie à Gram négatif, est capable d&#39;envahir une variété de cellules non-phagocytaires eucaryotes. Cet article décrit comment réussir à la culture et d&#39;évaluer la capacité de P. gingivalis à envahir les cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine (HUVEC). Deux protocoles ont été développés: de mesurer les bactéries qui peuvent survivre avec succès envahir et à l&#39;intérieur de l&#39;hôte, et l&#39;autre pour visualiser les bactéries qui interagissent avec les cellules hôtes. Ces techniques nécessitent l&#39;utilisation d&#39;un anaechambre pour fournir P. Robic gingivalis avec un milieu anaérobie pour une croissance optimale. Le premier protocole est basé sur le test de protection aux antibiotiques, qui est largement utilisé pour étudier l&#39;invasion des cellules hôtes par des bactéries. Toutefois, l&#39;essai de protection antibiotique est limité; seules les bactéries intracellulaires qui sont cultivables et après un traitement antibiotique de lyse de la cellule hôte sont mesurées. Pour évaluer toutes les bactéries interagissent avec les cellules hôtes, à la fois vivants et morts, nous avons développé un protocole qui utilise la microscopie à fluorescence pour examiner l&#39;interaction hôte-pathogène. Les bactéries sont marquées par fluorescence avec la 2 &#39;, 7&#39;-bis- (2-carboxyéthyl) -5- (et-6) -carboxyfluorescéine acétoxyméthyl ester (BCECF-AM) et utilisé pour infecter des cellules eucaryotes dans des conditions anaérobies. Suite à la fixation avec du paraformaldehyde et perméabilisation avec 0,2% de Triton X-100, les cellules hôtes sont marqués avec DAPI et TRITC phalloïdine pour marquer le cytosquelette de la cellule et du noyau, respectivement. Multiple images prises à différents points focaux (Z-Stack) sont obtenus pour la visualisation spatio-temporelle des bactéries. Les méthodes utilisées dans cette étude peuvent être appliqués à n&#39;importe quel anaérobie cultivable et n&#39;importe quel type de cellule eucaryote.

Protocoles décrits ci-dessus ont été utilisés dans l&#39;étude de l&#39;interaction hôte-pathogène entre P. gingivalis et les cellules endothéliales. P. gingivalis W83 et une p gingivalis V3150 portant une délétion de PG0228 ont été utilisés dans l&#39;étude. Le PG0228 est prédit pour coder pour une protéine susceptible de modifier les niveaux d&#39;ARN et de protéines, qui peuvent en fin de compte affecter l&#39;interaction de P. gingivalis avec les cellules...

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Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells

This article presents two protocols: one to measure anaerobic bacteria that can successfully invade and survive within the host, and the other to visualize anaerobic bacteria interacting with host cells. This study can be applied to any cultivable anaerobe and any eukaryotic cell type.

Porphyromonas gingivalis comme un organisme modèle pour l&#39;évaluation de l&#39;interaction des bactéries anaérobies avec des cellules hôtes

Anaerobic bacteria far outnumber aerobes in many human niches such as the gut, mouth, and vagina. Furthermore, anaerobic infections are common and ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells

26.1K vues.  Virginia Commonwealth University. This article presents two protocols: one to measure anaerobic bacteria that can successfully invade and survive within the host, and the other to visualize anaerobic bacteria interacting with host cells. This study can be applied to any cultivable anaerobe and any eukaryotic cell type. 

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Dissecting Host-virus Interaction in Lytic Replication of a Model Herpesvirus

In response to viral infection, a host develops various defensive responses, such as activating innate immune signaling pathways that lead to antiviral cytokine production1,2. In order to colonize the host, viruses are obligate to evade host antiviral responses and manipulate signaling pathways. Unraveling the host-virus interaction will shed light on the development of novel therapeutic strategies against viral infection.
Murine &gamma;HV68 is closely related to human oncogenic Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus and Epsten-Barr virus3,4. &gamma;HV68 infection in laboratory mice provides a tractable small animal model to examine the entire course of host responses and viral infection in vivo, which are not available for human herpesviruses. In this protocol, we present a panel of methods for phenotypic characterization and molecular dissection of host signaling components in &gamma;HV68 lytic replication both in vivo and ex vivo. The availability of genetically modified mouse strains permits the interrogation of the roles of host signaling pathways during &gamma;HV68 acute infection in vivo. Additionally, mouse embryonic fibroblasts (MEFs) isolated from these deficient mouse strains can be used to further dissect roles of these molecules during &gamma;HV68 lytic replication ex vivo.
Using virological and molecular biology assays, we can pinpoint the molecular mechanism of host-virus interactions and identify host and viral genes essential for viral lytic replication. Finally, a bacterial artificial chromosome (BAC) system facilitates the introduction of mutations into the viral factor(s) that specifically interrupt the host-virus interaction. Recombinant &gamma;HV68 carrying these mutations can be used to recapitulate the phenotypes of &gamma;HV68 lytic replication in MEFs deficient in key host signaling components. This protocol offers an excellent strategy to interrogate host-pathogen interaction at multiple levels of intervention in vivo and ex vivo.
Recently, we have discovered that &gamma;HV68 usurps an innate immune signaling pathway to promote viral lytic replication5. Specifically, &gamma;HV68 de novo infection activates the immune kinase IKK&beta; and activated IKK&beta; phosphorylates the master viral transcription factor, replication and transactivator (RTA), to promote viral transcriptional activation. In doing so, &gamma;HV68 efficiently couples its transcriptional activation to host innate immune activation, thereby facilitating viral transcription and lytic replication. This study provides an excellent example that can be applied to other viruses to interrogate host-virus interaction.

We describe a protocol to identify key roles of host signaling molecules in lytic replication of a model herpesvirus, gamma herpesvirus 68 (&gamma;HV68). Utilizing genetically modified mouse strains and embryonic fibroblasts for &gamma;HV68 lytic replication, the protocol permits both phenotypic characterization and molecular interrogation of virus-host interactions in viral lytic replication.

Dissection hôte-virus interaction dans la réplication lytique d&#39;un virus de l&#39;herpès modèle

In response to viral infection, a host develops various defensive responses, such as activating innate immune signaling pathways that lead to antiviral ...

Recherche

Immunologie et infection

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the initial and determining step of the pathogenesis. Although experimentally adhesion is mostly studied in static conditions adhesion actually takes place in the presence of flowing liquid. First encounters between bacteria and their host often occur at the mucosal level, mouth, lung, gut, eye, etc. where mucus flows along the surface of epithelial cells. Later in infection, pathogens occasionally access the blood circulation causing life-threatening illnesses such as septicemia, sepsis and meningitis. A defining feature of these infections is the ability of these pathogens to interact with endothelial cells in presence of circulating blood. The presence of flowing liquid, mucus or blood for instance, determines adhesion because it generates a mechanical force on the pathogen. To characterize the effect of flowing liquid one usually refers to the notion of shear stress, which is the tangential force exerted per unit area by a fluid moving near a stationary wall, expressed in dynes/cm2. Intensities of shear stress vary widely according to the different vessels type, size, organ, location etc. (0-100 dynes/cm2). Circulation in capillaries can reach very low shear stress values and even temporarily stop during periods ranging between a few seconds to several minutes 1. On the other end of the spectrum shear stress in arterioles can reach 100 dynes/cm2 2. The impact of shear stress on different biological processes has been clearly demonstrated as for instance during the interaction of leukocytes with the endothelium 3. To take into account this mechanical parameter in the process of bacterial adhesion we took advantage of an experimental procedure based on the use of a disposable flow chamber 4. Host cells are grown in the flow chamber and fluorescent bacteria are introduced in the flow controlled by a syringe pump. We initially focused our investigations on the bacterial pathogen Neisseria meningitidis, a Gram-negative bacterium responsible for septicemia and meningitis. The procedure described here allowed us to study the impact of shear stress on the ability of the bacteria to: adhere to cells 1, to proliferate on the cell surface 5and to detach to colonize new sites 6 (Figure 1). Complementary technical information can be found in reference 7. Shear stress values presented here were chosen based on our previous experience1 and to represent values found in the literature. The protocol should be applicable to a wide range of pathogens with specific adjustments depending on the objectives of the study.

During the infection process, a key step is the adhesion of pathogens with host cells. In most instances this adhesion step occurs in the presence of mechanical stress generated by flowing liquid. We describe a technique that introduces shear stress as an important parameter in the study of bacterial adhesion.

Présentation de contrainte de cisaillement dans l&#39;étude de l&#39;adhésion bactérienne

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Use of the EpiAirway Model for Characterizing Long-term Host-pathogen Interactions

Nontypeable Haemophilus influenzae (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory mucosa 1; 2. To study the mechanisms by which these organisms survive on and inside respiratory tissues, a model in which successful long-term co-culture of bacteria and human cells can be performed is required. We use primary human respiratory epithelial tissues raised to the air-liquid interface, the EpiAirway model (MatTek, Ashland, MA). These are non-immortalized, well-differentiated, 3-dimensional tissues that contain tight junctions, ciliated and nonciliated cells, goblet cells that produce mucin, and retain the ability to produce cytokines in response to infection. 
This biologically relevant in vitro model of the human upper airway can be used in a number of ways; the overall goal of this method is to perform long-term co-culture of EpiAirway tissues with NTHi and quantitate cell-associated and internalized bacteria over time. As well, mucin production and the cytokine profile of the infected co-cultures can be determined. This approach improves upon existing methods in that many current protocols use submerged monolayer or Transwell cultures of human cells, which are not capable of supporting bacterial infections over extended periods3. For example, if an organism can replicate in the overlying media, this can result in unacceptable levels of cytotoxicity and loss of host cells, arresting the experiment. The EpiAirway model allows characterization of long-term host-pathogen interactions. Further, since the source for the EpiAirway is normal human tracheo-bronchial cells rather than an immortalized line, each is an excellent representation of actual human upper respiratory tract tissue, both in structure and in function4.
For this method, the EpiAirway tissues are weaned off of anti-microbial and anti-fungal compounds for 2 days prior to delivery, and all procedures are performed under antibiotic-free conditions. This necessitates special considerations, since both bacteria and primary human tissues are used in the same biosafety cabinet, and are co-cultured for extended periods.

This method allows characterization of extended bacterial co-culture with EpiAirways, primary human respiratory epithelial tissue grown at the air-liquid interface, a biologically relevant in vitro model. The approach can be used with any microbe that is amenable to long-term co-culture.

L&#39;utilisation du modèle EpiAirway pour Caractériser long terme Interactions hôte-pathogène

Nontypeable Haemophilus influenzae  (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory ...

Use of Image Cytometry for Quantification of Pathogenic Fungi in Association with Host Cells

Studies of the cellular pathogenesis mechanisms of pathogenic yeasts such as Candida albicans, Histoplasma capsulatum, and Cryptococcus neoformans commonly employ infection of mammalian hosts or host cells (i.e. macrophages) followed by yeast quantification using colony forming unit analysis or flow cytometry. While colony forming unit enumeration has been the most commonly used method in the field, this technique has disadvantages and limitations, including slow growth of some fungal species on solid media and low and/or variable plating efficiencies, which is of particular concern when comparing growth of wild-type and mutant strains. Flow cytometry can provide rapid quantitative information regarding yeast viability, however, adoption of flow cytometric detection for pathogenic yeasts has been limited for a number of practical reasons including its high cost and biosafety considerations. Here, we demonstrate an image-based cytometric methodology using the Cellometer Vision (Nexcelom Bioscience, LLC) for the quantification of viable pathogenic yeasts in co-culture with macrophages. Our studies focus on detection of two human fungal pathogens: Histoplasma capsulatum and Candida albicans. H. capsulatum colonizes alveolar macrophages by replicating within the macrophage phagosome, and here, we quantitatively assess the growth of H. capsulatum yeasts in RAW 264.7 macrophages using acridine orange/propidium iodide staining in combination with image cytometry. Our method faithfully recapitulates growth trends as measured by traditional colony forming unit enumeration, but with significantly increased sensitivity. Additionally, we directly assess infection of live macrophages with a GFP-expressing strain of C. albicans. Our methodology offers a rapid, accurate, and economical means for detection and quantification of important human fungal pathogens in association with host cells.

Here, we demonstrate how image cytometry can be used for quantification of pathogenic fungi in association with host cells in culture. This technique can be used as an alternative to CFU enumeration.

Utilisation de la cytométrie d&#39;image pour la quantification des champignons pathogènes en association avec les cellules hôtes

Studies of the cellular pathogenesis mechanisms of pathogenic yeasts such as Candida albicans, Histoplasma capsulatum, and Cryptococcus neoformans ...

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

Legionella pneumophila, the causative agent of a severe pneumonia named Legionnaires&#39; disease, is an important human pathogen that infects and replicates within alveolar macrophages. Its virulence depends on the Dot/Icm type IV secretion system (T4SS), which is essential to establish a replication permissive vacuole known as the Legionella containing vacuole (LCV). L. pneumophila infection can be modeled in mice however most mouse strains are not permissive, leading to the search for novel infection models. We have recently shown that the larvae of the wax moth Galleria mellonella are suitable for investigation of L. pneumophila infection. G. mellonella is increasingly used as an infection model for human pathogens and a good correlation exists between virulence of several bacterial species in the insect and in mammalian models. A key component of the larvae&#39;s immune defenses are hemocytes, professional phagocytes, which take up and destroy invaders. L. pneumophila is able to infect, form a LCV and replicate within these cells. Here we demonstrate protocols for analyzing L. pneumophila virulence in the G. mellonella model, including how to grow infectious L. pneumophila, pretreat the larvae with inhibitors, infect the larvae and how to extract infected cells for quantification and immunofluorescence microscopy. We also describe how to quantify bacterial replication and fitness in competition assays. These approaches allow for the rapid screening of mutants to determine factors important in L. pneumophila virulence, describing a new tool to aid our understanding of this complex pathogen.

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

The larva of the wax moth Galleria mellonella was recently established as an in vivo model to study Legionella pneumophila infection. Here, we demonstrate fundamental techniques to characterize the pathogenesis of Legionella in the larvae, including inoculation, measurement of bacterial virulence and replication as well as extraction and analysis of infected hemocytes.

Utilisation d&#39;<em&gt; Galleria mellonella</em&gt; Comme un organisme modèle pour l&#39;étude<em&gt; Legionella pneumophila</em&gt; Maladies infectieuses

Legionella pneumophila, the causative agent of a severe pneumonia named Legionnaires&#39; disease, is an important human pathogen that infects and ...

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

Studying host-pathogen interaction enables us to understand the underlying mechanisms of the pathogenicity during microbial infection. The prognosis of the host depends on the involvement of an adapted immune response against the pathogen1. Immune response is complex and results from interaction of the pathogens and several immune or non-immune cellular types2. In vitro studies cannot characterise these interactions and focus on cell-pathogen interactions. Moreover, in the airway3, particularly in patients with suppurative chronic lung disease or in mechanically ventilated patients, polymicrobial communities are present and complicate host-pathogen interaction. Pseudomonas aeruginosa and Candida albicans are both problem pathogens4, frequently isolated from tracheobronchial samples, and associated to severe infections, especially in intensive care unit5. Microbial interactions have been reported between these pathogens in vitro but the clinical impact of these interactions remains unclear6. To study the interactions between C. albicans and P. aeruginosa, a murine model of C. albicans airways colonization, followed by a P. aeruginosa-mediated acute lung infection was performed.

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

While in vitro study of host-pathogen interactions allow the characterization of specific immune responses, in vivo models are required to observe the effects of complex responses. Using Candida albicans exposure followed by Pseudomonas aeruginosa-mediated lung infection, we established a murine model of microbial interactions involved in ventilator-associated pneumonia pathogenicity.

Etudier communautés microbiennes<em&gt; In Vivo</em&gt;: Un modèle d&#39;interaction hôte intermédiaire Entre<em&gt; Candida albicans</em&gt; Et<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Dans les Airways

Studying host-pathogen interaction enables us to understand the underlying mechanisms of the pathogenicity during microbial infection. The prognosis of ...

Biomimetic Materials to Characterize Bacteria-host Interactions

Bacterial attachment to host cells is one of the earliest events during bacterial colonization of host tissues and thus a key step during infection. The biochemical and functional characterization of adhesins mediating these initial bacteria-host interactions is often compromised by the presence of other bacterial factors, such as cell wall components or secreted molecules, which interfere with the analysis. This protocol describes the production and use of biomimetic materials, consisting of pure recombinant adhesins chemically coupled to commercially available, functionalized polystyrene beads, which have been used successfully to dissect the biochemical and functional interactions between individual bacterial adhesins and host cell receptors. Protocols for different coupling chemistries, allowing directional immobilization of recombinant adhesins on polymer scaffolds, and for assessment of the coupling efficiency of the resulting &#8220;bacteriomimetic&#8221; materials are also discussed. We further describe how these materials can be used as a tool to inhibit pathogen mediated cytotoxicity and discuss scope, limitations and further applications of this approach in studying bacterial - host interactions.

Bacterial attachment to host cells is a key step during host colonization and infection. This protocol describes the generation of polymer-coupled recombinant adhesins as biomimetic materials which allow analysis of the contribution of individual adhesins to these processes, independent of other bacterial factors.

Matériaux biomimétiques à caractériser les interactions bactéries-hôtes

Bacterial attachment to host cells is one of the earliest events during bacterial colonization of host tissues and thus a key step during infection. The ...

Experimental Infection with Listeria monocytogenes as a Model for Studying Host Interferon-&#947; Responses

L. monocytogenes is a gram-positive bacterium that is a cause of food borne disease in humans. Experimental infection of mice with this pathogen has been highly informative on the role of innate and adaptive immune cells and specific cytokines in host immunity against intracellular pathogens. Production of IFN-&#947; by innate cells during sublethal infection with L. monocytogenes is important for activating macrophages and early control of the pathogen1-3. In addition, IFN-&#947; production by adaptive memory lymphocytes is important for priming the activation of innate cells upon reinfection4. The L. monocytogenes infection model thus serves as a great tool for investigating whether new therapies that are designed to increase IFN-&#947; production have an impact on IFN-&#947; responses in vivo and have productive biological effects such as increasing bacterial clearance or improving mouse survival from infection. Described here is a basic protocol for how to conduct intraperitoneal infections of C57BL/6J mice with the EGD strain of L. monocytogenes and to measure IFN-&#947; production by NK cells, NKT cells, and adaptive lymphocytes by flow cytometry. In addition, procedures are described to: (1) grow and prepare the bacteria for inoculation, (2) measure bacterial load in the spleen and liver, and (3) measure animal survival to endpoints. Representative data are also provided to illustrate how this infection model can be used to test the effect of specific agents on IFN-&#947; responses to L. monocytogenes and survival of mice from this infection.

Experimental Infection with &lt;em&gt;Listeria monocytogenes&lt;/em&gt; as a Model for Studying Host Interferon-&amp;#947; Responses

This protocol describes how to inoculate C57BL/6J mice with the EGD strain of Listeria monocytogenes (L. monocytogenes) and to measure interferon-&#947; (IFN-&#947;) responses by natural killer (NK) cells, natural killer T (NKT) cells, and adaptive T lymphocytes post-infection. This protocol also describes how to conduct survival studies in mice after infection with a modified LD50 dose of the pathogen.

Infection expérimentale avec<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; En tant que modèle pour l&#39;étude de l&#39;hôte Réponses Interféron-y

L. monocytogenes is a gram-positive bacterium that is a cause of food borne disease in humans. Experimental infection of mice with this pathogen has been ...

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

Streptococcus agalactiae (group B Streptococcus, GBS), is a Gram-positive, asymptomatic colonizer of the human gastrointestinal tract and vaginal tract of 10 - 30% of adults. In immune-compromised individuals, including neonates, pregnant women, and the elderly, GBS may switch to an invasive pathogen causing sepsis, arthritis, pneumonia, and meningitis. Because GBS is a leading bacterial pathogen of neonates, current prophylaxis is comprised of late gestation screening for GBS vaginal colonization and subsequent peripartum antibiotic treatment of GBS-positive mothers. Heavy GBS vaginal burden is a risk factor for both neonatal disease and colonization. Unfortunately, little is known about the host and bacterial factors that promote or permit GBS vaginal colonization. This protocol describes a technique for establishing persistent GBS vaginal colonization using a single &#946;-estradiol pre-treatment and daily sampling to determine bacterial load. It further details methods to administer additional therapies or reagents of interest and to collect vaginal lavage fluid and reproductive tract tissues. This mouse model will further the understanding of the GBS-host interaction within the vaginal environment, which will lead to potential therapeutic targets to control maternal vaginal colonization during pregnancy and to prevent transmission to the vulnerable newborn. It will also be of interest to increase our understanding of general bacterial-host interactions in the female vaginal tract.

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

The purpose of this protocol is to imitate human group B Streptococcus (GBS) vaginal colonization in a murine model. This method may be used to investigate host immune responses and bacterial factors contributing to GBS vaginal persistence, as well as to test therapeutic strategies.

Un modèle murin du Groupe B<em&gt; Streptococcus</em&gt; Vaginal Colonisation

Streptococcus agalactiae (group B Streptococcus, GBS), is a Gram-positive, asymptomatic colonizer of the human gastrointestinal tract and vaginal tract of ...

Arbovirus Infections As Screening Tools for the Identification of Viral Immunomodulators and Host Antiviral Factors

RNA interference- and genome editing-based screening platforms have been widely used to identify host cell factors that restrict virus replication. However, these screens are typically conducted in cells that are naturally permissive to the viral pathogen under study. Therefore, the robust replication of viruses in control conditions may limit the dynamic range of these screens. Furthermore, these screens may be unable to easily identify cellular defense pathways that restrict virus replication if the virus is well-adapted to the host and capable of countering antiviral defenses. In this article, we describe a new paradigm for exploring virus-host interactions through the use of screens that center on naturally abortive infections by arboviruses such as vesicular stomatitis virus (VSV). Despite the ability of VSV to replicate in a wide range of dipteran insect and mammalian hosts, VSV undergoes a post-entry, abortive infection in a variety of cell lines derived from lepidopteran insects, such as the gypsy moth (Lymantria dispar). However, these abortive VSV infections can be &#34;rescued&#34; when host cell antiviral defenses are compromised. We describe how VSV strains encoding convenient reporter genes and restrictive L. dispar cell lines can be paired to set-up screens to identify host factors involved in arbovirus restriction. Furthermore, we also show the utility of these screening tools in the identification of virally encoded factors that rescue VSV replication during coinfection or through ectopic expression, including those encoded by mammalian viruses. The natural restriction of VSV replication in L. dispar cells provides a high signal-to-noise ratio when screening for the conditions that promote VSV rescue, thus enabling the use of simplistic luminescence- and fluorescence-based assays to monitor the changes in VSV replication. These methodologies are valuable for understanding the interplay between host antiviral responses and viral immune evasion factors.

Here, we present the protocols to identify 1) virus-encoded immunomodulators that promote arbovirus replication and 2) eukaryotic host factors that restrict arbovirus replication. These fluorescence- and luminescence-based methods allow researchers to rapidly obtain quantitative readouts of arbovirus replication in simplistic assays with low signal-to-noise ratios.

Arbovirus Infections comme outils de dépistage pour l’Identification des virales facteurs antiviraux immunomodulateurs et hôte

RNA interference- and genome editing-based screening platforms have been widely used to identify host cell factors that restrict virus replication. ...