This work was supported by UWS and ThermoFisher Scientific. One of the authors (DK) acknowledges the receipt of an Australian Postgraduate Award.

Attention: S&#39;il vous plaît se référer à des fiches de données de sécurité (FDS) pour tous les matériaux et réactifs avant utilisation (c. -à- FS pour le méthanol). Assurer l&#39;utilisation de toutes les pratiques de sécurité appropriées lors de la manipulation des solvants et chromatographie liquide haute performance (HPLC) éluant. Veiller à l&#39;utilisation appropriée des contrôles techniques de HPLC analytique équilibre et détecteur instrumentation, et d&#39;assurer l&#39;utilisation des équipements de protection individuelle (lunettes de sécurité, gants, blouse, pantalon de longueur, et des chaussures fermées). Remarque: Ce protocole décrit 3 méthodes de flux de réaction dérivatisation post-colonne (RF-PCD) techniques, chacune avec un réactif différent spécifique à la nature d&#39;un composé chimique d&#39;intérêt. Pour l&#39;analyse des ROS passez à la section «1. Détection des ROS en utilisant DPPH •&quot;, pour l&#39;analyse des amines primaires voir section &quot;2. Détection des amines primaires en utilisant fluorescamine&quot;, et pour l&#39;analyse des composés phénoliques passez à la section &quot;3 . La détection des phénolsen utilisant 4-aminoantipyrine et ferricyanure de potassium &quot;. Utiliser de l&#39; eau ultra-pure (par exemple, l&#39; eau Milli-Q) tout au long. Remarque: la connexion de la colonne HF est réalisée pratiquement de la même manière qu&#39;une colonne de HPLC classique avec la différence majeure étant le nombre de raccords d&#39;extrémité sur une colonne RF. Les raccords utilisés pour connecter une colonne de HPLC standard pour le système HPLC peuvent être utilisés pour connecter une colonne RF au système HPLC. 1. Détection des ERO Utilisation DPPH • <ol><li> Mise en place d&#39;instrument HPLC <ol><li> Préparation de l&#39;instrument HPLC avec 100% d&#39;eau sur la ligne A et 100% de methanol à la ligne B en tant que phase mobile. Purger les pompes selon les exigences du fabricant. </li><li> Mettre en place les composants instrumentaux HPLC et la pompe de dérivation supplémentaire , comme illustré sur la figure 4A. </li><li> Régler le détecteur UV-Vis à analyser à une longueur d&#39;onde de 520 nm. </li></ol></li><li> Mise en place decolonne RF <ol><li> Relier l&#39;entrée de la colonne de RF à l&#39;instrument CLHP. </li><li> Connecter une longueur de 15 cm de 0,13 mm id tube à l&#39;orifice de sortie central de la colonne HF. </li><li> Connecter un orifice périphérique de sortie du détecteur UV-Vis en utilisant une longueur de 15 cm de 0,13 mm Tuyau id. </li><li> Connectez la ligne de pompe DPPH • à un port périphérique sur la sortie de la colonne de RF. </li><li> Bloquer le port de périphérique utilisé sur la sortie de la colonne RF en utilisant un bouchon de colonne. </li><li> Porter le débit de la pompe HPLC de débit à 1 ml min -1 à 100% de la ligne B - 100% de methanol. </li><li> Équilibrer la colonne avec la phase mobile 100% de methanol pendant 10 minutes pour une colonne de longueur mm 4,6 mm DI x 100. Ce temps doit être adapté en fonction des dimensions des autres colonnes, l&#39;utilisateur peut employer. </li></ol></li><li> Préparation du DPPH • réactif <ol><li> Préparer une solution / ml 0,1 mg de DPPH • dans le méthanol. </li&gt; <li> Soniquer le flacon contenant le DPPH • réactif pendant 10 min. </li><li> Couvrir le flacon dans du papier pour éviter l&#39;exposition à la lumière. </li><li> Purger le DPPH • pompe avec le prêt DPPH • réactif selon les exigences du fabricant. </li></ol></li><li> Réglage de la sortie de la colonne HF <ol><li> Peser deux navires propres et secs. Etiqueter un navire comme un élément central et l&#39;autre périphérique. </li><li> Recueillir l&#39;effluent sortant du port central dans le récipient étiqueté central pour 1,0 min. </li><li> Repeser le récipient de port central et calculer le poids de l&#39;écoulement depuis l&#39;orifice central de la manière suivante: Poids de Port centrale (g) = Poids final de Port Central navire (g) - Poids initial de Port Central navire (g) </li><li> Répéter les étapes 1.4.2 et 1.4.3 de l&#39;effluent sortant de l&#39;UV-Vis qui est attaché au port périphérique de la colonne HF et de calculer le poids du récipient de port périphérique quesuit: Poids du port périphérique (g) = Poids final du port périphérique navire (g) - poids initial du port périphérique navire (g) </li><li> Calculer le pourcentage du flux provenant des orifices centraux et périphériques comme suit: % Port Central = Poids de Port centrale (g) / (poids de Port centrale (g) + Poids du port périphérique (g)) x 100 % Port périphérique = Poids du port périphérique (g) / (poids de Port centrale (g) + Poids du port périphérique (g)) x 100 </li><li> Assurer le rapport de segmentation entre le flux central et le flux périphérique est 30:70 (central: périphérique). Si l&#39;écoulement central est supérieure à 30%, de diminuer la quantité de flux sortant en ajoutant une longueur de 0,13 mm Tuyau identifiant à la sortie de l&#39;orifice central. Si l&#39;écoulement central est inférieure à 30% diminuer la longueur de 0,13 mm tube du port central. </li><li> Répétez l&#39;étape 1.4.1 à 1.4.6 jusqu&#39;à ce qu&#39;un rapport de segmentation de 30:70 (central: périphérique) est atteint. </li><li> Réglez le taux de la D d&#39;écoulementPPH • pompe de réactif à 0,5 ml min -1. Remarque: La colonne RF mis en place avec DPPH • réactif est maintenant prêt pour l&#39; analyse. Les échantillons peuvent maintenant être injectés. </li></ol></li><li> Déposer exécuter des conditions d&#39;arrêt <ol><li> Une fois que tous les échantillons ont été injectés, ce qui indique que la course est terminée, arrêter le débit de la pompe de réactif de dérivatisation. </li><li> Retirez le DPPH • ligne de pompe de réactif du port périphérique et boucher le port. </li><li> Équilibrer la colonne avec la phase mobile dans laquelle il doit être stocké en permettant à la phase mobile de passer à travers la colonne à 1 ml min - 1 pendant 10 min. </li><li> Arrêter l&#39;écoulement de la pompe de la phase mobile de l&#39;instrument CLHP. </li><li> Remplacer le DPPH • réactif avec du méthanol et purger la pompe supplémentaire. Remarque: Le système HPLC peut maintenant être arrêté. </li></ol></li></ol> 2. Détection de Amines primaires Utilisation Fluorescamine <ol><li> Préparation de la phase mobile <ol><li> Préparer 1 L d&#39;une solution 10 mM d&#39;acétate d&#39;ammonium, en ajustant le pH de la solution à 9,0 avec de 5 M d&#39;hydroxyde d&#39;ammonium avant la dilution au volume. </li><li> Ajouter 52,6 ml d&#39;acétonitrile (ACN) dans le tampon d&#39;acétate d&#39;ammonium pour obtenir une phase mobile prémélangée de 95:05 (tampon: ACN). </li></ol></li><li> Mise en place d&#39;instrument HPLC <ol><li> Préparation de l&#39;instrument HPLC avec le tampon préparé préalablement mélangé à la ligne A en tant que phase mobile. Purger la pompe selon les exigences du fabricant. </li><li> Mettre en place les composants instrumentaux HPLC et la pompe de dérivation supplémentaire , comme illustré sur la figure 4A. </li><li> Fixer une bobine impulsion de l&#39;amortisseur à la pompe de dérivation. </li><li> Mettre en place le détecteur de fluorescence (FLD) avec une longueur d&#39;onde d&#39;excitation de 390 nm et une longueur d&#39;onde d&#39;émission de 475 nm. </li></ol></li><li> Mise en place de la colonne RF <ol><li> Connectez el&#39;entrée e de la colonne de RF à l&#39;instrument CLHP. </li><li> Connecter une longueur de 15 cm de 0,13 mm id tube à l&#39;orifice de sortie central de la colonne HF. </li><li> Connecter un port périphérique sortie de la colonne HF au détecteur FLD en utilisant une longueur de 15 cm de 0,13 mm Tuyau id. </li><li> Connecter la ligne de la pompe à dérivatisation à un port périphérique sur la sortie de la colonne HF. </li><li> Bloquer le port de périphérique utilisé sur la sortie de la colonne RF en utilisant un bouchon de colonne. </li><li> Amener le débit de la pompe HPLC de débit à 1 ml min -1 à 100% de la ligne A - 10 mM de tampon d&#39;acétate d&#39; ammonium à pH 9, prémélangée avec 5% d&#39; ACN. </li><li> Equilibrer la colonne avec la ligne A phase mobile 100% pendant 10 min pour une colonne de longueur mm 4,6 mm id x 100. Ce temps peut être mis à l&#39;échelle en fonction des dimensions des autres colonnes, l&#39;utilisateur peut employer. </li></ol></li><li> Préparation du réactif à la fluorescamine <ol><li> Faire 100 ml d&#39;un ml -1 fluorescamine réactif 0,1 mg. </li> &lt;li&gt; Soniquer pendant 1 min. </li><li> Couvrir de papier d&#39;aluminium pour éviter l&#39;exposition à la lumière. </li><li> Purger la pompe de réactif avec le réactif fluorescamine préparé selon les exigences du fabricant. </li></ol></li><li> Réglage de la sortie de la colonne HF <ol><li> Peser deux navires propres et secs. Etiqueter un navire comme un élément central et l&#39;autre périphérique. </li><li> Recueillir l&#39;effluent sortant du port central dans le récipient étiqueté central pour 1,0 min. </li><li> Peser le récipient central et calculer le poids de l&#39;écoulement de l&#39;orifice central de la manière suivante à l&#39;étape 1.4.3. </li><li> À répéter les étapes 2.5.2 2.5.3 de l&#39;effluent sortant de la FLD qui est attaché au port périphérique de la colonne HF et de calculer le poids pour périphérique de la façon suivante à l&#39;étape 1.4.4. </li><li> Calculer le pourcentage du flux provenant des orifices centraux et périphériques comme suit dans l&#39;étape 1.4.5. </li><li> Assurer le rapport de segmentation entre le flux central et périphériquedébit est 43:57 (central: périphérique). Si l&#39;écoulement central est supérieur à 43%, de diminuer la quantité de flux sortant en ajoutant une longueur de 0,13 mm Tuyau identifiant à la sortie de l&#39;orifice central. Si l&#39;écoulement central est inférieure à 43%, diminuer la longueur de 0,13 mm tube du port central. </li><li> Répétez l&#39;étape 2.5.1 à 2.5.6 jusqu&#39;à ce qu&#39;un rapport de segmentation de 43:57 (central: périphérique) est atteint. </li><li> Régler le débit de la pompe de la phase mobile de débit à 0,7 ml min -1. </li><li> Réglez la pompe de dérivation à l&#39; écoulement à 0,1 ml min -1. Remarque: La colonne RF mis en place avec le réactif fluorescamine est maintenant prêt pour l&#39;analyse. Les échantillons peuvent maintenant être injectés. </li></ol></li><li> Déposer exécuter des conditions d&#39;arrêt <ol><li> Une fois que tous les échantillons ont été injectés, ce qui indique que la course est terminée, arrêter la pompe de dérivation. </li><li> Retirer la ligne de pompe de dérivation du port périphérique et le bouchon. </li><li> Équilibrer la colonne avec la phase mobilelaquelle il doit être stocké en permettant à la phase mobile de passer à travers la colonne à 1 ml min - 1 pendant 10 min. </li><li> Arrêter l&#39;écoulement de la pompe de la phase mobile. </li><li> Remplacer le réactif fluorescamine avec de l&#39;acétonitrile et purger la pompe de dérivation. Remarque: Le système HPLC peut maintenant être arrêté. </li></ol></li></ol> 3. Détection de Phénols Utilisation 4-aminoantipyrine et Potassium Ferricyanide <ol><li> Préparation de la phase mobile <ol><li> Préparer 1 L d&#39;une solution d&#39;acétate d&#39;ammonium 100 mM, on ajuste le pH de la solution à 9,0 avec de 5 M d&#39;hydroxyde d&#39;ammonium avant la dilution au volume. </li><li> Ajouter 52,6 ml de méthanol dans le tampon d&#39;acétate d&#39;ammonium pour obtenir une phase mobile prémélangée de 95: 5 (tampon: methanol). </li></ol></li><li> Mise en place d&#39;instrument HPLC <ol><li> Préparation de l&#39;instrument HPLC avec le tampon préparé préalablement mélangé à la ligne A en tant que phase mobile. Purger la pompe selon fabricant »; S exigences. </li><li> Mettre en place les composants instrumentaux HPLC et les deux pompes de réactif supplémentaires , comme illustré sur la figure 4B. </li><li> Fixer une bobine impulsion de l&#39;amortisseur à chacune des pompes de réactif. </li><li> Régler le détecteur UV-Vis pour analyser à une longueur d&#39;onde de 500 nm. </li></ol></li><li> Mise en place de la colonne RF <ol><li> Relier l&#39;entrée de la colonne de RF à l&#39;instrument CLHP. </li><li> Connecter une longueur de 15 cm de 0,13 mm id tube à l&#39;orifice de sortie central de la colonne HF. </li><li> Connecter un port périphérique sortie de la colonne RF au détecteur UV-Vis en utilisant une longueur de 15 cm de 0,13 mm Tuyau id. </li><li> Connecter chaque réactif ( par exemple, la 4-aminoantipyrine et du ferricyanure de potassium) , la ligne de la pompe à un orifice périphérique à la sortie de la colonne HF. </li><li> Amener le débit de la pompe HPLC de débit à 1 ml min -1 à 100% de la ligne A - 100 mM de tampon d&#39;acétate d&#39; ammonium à pH 9, prémélangée avec 5% de methanol. </li><li> Équilibrer la colonne wvec la ligne A phase mobile 100% pendant 10 min pour une colonne de longueur mm 4,6 mm id x 100. Ce temps peut être mis à l&#39;échelle en fonction des dimensions des autres colonnes, l&#39;utilisateur peut employer. </li></ol></li><li> Préparation du réactif 4-aminoantipyrine <ol><li> Préparer un tampon d&#39;acétate d&#39;ammonium avec un pH de 9 par suite de l&#39;étape 3.1.1. </li><li> Peser 150 mg de 4-aminoantipyrine et le dissoudre dans 100 ml de tampon d&#39;acétate d&#39;ammonium préparé (pH 9). </li><li> Sonication pendant 1 min. </li><li> Couvrir de papier d&#39;aluminium pour éviter l&#39;exposition à la lumière. </li><li> Purger la première pompe de réactif avec le réactif préparé 4-aminoantipyrine selon les exigences du fabricant. </li></ol></li><li> Préparation du réactif de potassium , le ferricyanure <ol><li> Peser 150 mg de ferricyanure de potassium et de se dissoudre dans 100 ml de tampon d&#39;acétate d&#39;ammonium (pH 9) préparés selon l&#39;étape 3.1.1. </li><li> Sonication pendant 1 min. </li><li> Couvrir de papier d&#39;aluminium pour éviter l&#39;exposition à la lumière. </li><li> Purge la seconde pompe de réactif avec le réactif de ferricyanure de potassium préparé selon les exigences du fabricant. </li></ol></li><li> Tuning de la colonne RF <ol><li> Peser deux navires propres et secs. Etiqueter un navire comme un élément central et l&#39;autre périphérique. </li><li> Recueillir l&#39;effluent sortant du port central dans le récipient étiqueté central pour 1,0 min. </li><li> Peser le récipient central et calculer le poids de l&#39;écoulement de l&#39;orifice central de la manière suivante à l&#39;étape 1.4.3. </li><li> Répéter les étapes 3.6.2 à 3.6.3 pour l&#39;effluent sortant de l&#39;UV-Vis qui est attaché au port périphérique de la colonne HF et de calculer le poids pour périphérique de la façon suivante à l&#39;étape 1.4.4. </li><li> Calculer le pourcentage du flux provenant des orifices centraux et périphériques comme suit dans l&#39;étape 1.4.5. </li><li> Assurer le rapport de segmentation entre le flux central et le flux périphérique est 50:50 (central: périphérique). Si l&#39;écoulement central est supérieure à 50%, diminuer laquantité de flux sortant en ajoutant une longueur de 0,13 mm, un tube d&#39;identification au centre port de sortie. Si l&#39;écoulement central est inférieure à 50%, diminuer la longueur de 0,13 mm tube du port central. </li><li> Répétez l&#39;étape 3.6.1 à 3.6.6 jusqu&#39;à ce qu&#39;un rapport de segmentation de 50:50 (central: périphérique) est atteint. </li><li> Régler le débit de la pompe 4-aminoantipyrine débit à 0,5 ml min -1. </li><li> Régler le débit de la pompe de ferricyanure de potassium d&#39;écoulement de 0,25 ml min -1. Remarque: La colonne RF mis en place avec les réactifs à deux composants est maintenant prêt pour l&#39;analyse. Les échantillons peuvent maintenant être injectés. </li></ol></li><li> Déposer exécuter des conditions d&#39;arrêt <ol><li> Une fois que tous les échantillons ont été injectés la course est terminée, ce qui indique que la course est terminée, arrêtez les deux pompes de réactif. </li><li> Supprimer les lignes de pompe à réactif à partir des orifices périphériques et les remplacer par un morceau de 0,13 mm Tuyau 15 cm. </li><li> Equilibrer la colonne avec la phase mobile dans which , il doit être stocké en permettant à la phase mobile de passer à travers la colonne à 1 ml min - 1 pendant 10 min. </li><li> Arrêter l&#39;écoulement de la pompe de la phase mobile de l&#39;instrument CLHP. </li><li> Remplacer les deux réactifs sur le réactif pompes avec du méthanol et purger les pompes supplémentaires selon l&#39;exigence du fabricant. Remarque: Le système HPLC peut maintenant être arrêté. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Srijaranai, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+1-(2-pyridylazo)-2-naphthol+as+the+post+column+reagent+for+ion+exchange+chromatography+of+heavy+metals+in+environmental+samples.">Use of 1-(2-pyridylazo)-2-naphthol as the post column reagent for ion exchange chromatography of heavy metals in environmental samples.</a> Microchem. J. 99, 152-158 (2011).</li><li>Kubickova, A., Kubicek, V., Coufal, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UV-VIS+detection+of+amino+acids+in+liquid+chromatography:+online+post-column+solid-state+derivatization+with+Cu(II)+ions.">UV-VIS detection of amino acids in liquid chromatography: online post-column solid-state derivatization with Cu(II) ions.</a> J Sep Sci. 34, 3131-3135 (2011).</li><li>Quinto, M., Spadaccino, G., Palermo, C., Centonze, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+aflatoxins+in+cereal+flours+by+solid-phase+microextraction+coupled+with+liquid+chromatography+and+post-column+photochemical+derivatization-fluorescence+detection.">Determination of aflatoxins in cereal flours by solid-phase microextraction coupled with liquid chromatography and post-column photochemical derivatization-fluorescence detection.</a> J. Chromatogr. A. 1216, 8636-8641 (2009).</li><li>Lee, M., Lee, Y., Soltermann, F., von Gunten, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+N-nitrosamines+and+other+nitro(so)+compounds+in+water+by+high-performance+liquid+chromatography+with+post-column+UV+photolysis/Griess+reaction.">Analysis of N-nitrosamines and other nitro(so) compounds in water by high-performance liquid chromatography with post-column UV photolysis/Griess reaction.</a> Water Res. 47, 4893-4903 (2013).</li><li>Niu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+isoflavonoids+in+Radix+Puerariae+for+quality+control+using+on-line+high+performance+liquid+chromatography-diode+array+detector-electrospray+ionization-mass+spectrometry+coupled+with+post-column+derivatization.">Identification of isoflavonoids in Radix Puerariae for quality control using on-line high performance liquid chromatography-diode array detector-electrospray ionization-mass spectrometry coupled with post-column derivatization.</a> Food Res Int. 48, 528-537 (2012).</li><li>Zacharis, C. K., Tzanavaras, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+chromatography+coupled+to+on-line+post+column+derivatization+for+the+determination+of+organic+compounds:+a+review+on+instrumentation+and+chemistries.">Liquid chromatography coupled to on-line post column derivatization for the determination of organic compounds: a review on instrumentation and chemistries.</a> Anal. Chim. Acta. 798, 1-24 (2013).</li><li>Dousa, M., Brichac, J., Gibala, P., Lehnert, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+hydrophilic+interaction+chromatography+determination+of+lysine+in+pharmaceutical+preparations+with+fluorescence+detection+after+postcolumn+derivatization+with+o-phtaldialdehyde.">Rapid hydrophilic interaction chromatography determination of lysine in pharmaceutical preparations with fluorescence detection after postcolumn derivatization with o-phtaldialdehyde.</a> J Pharm Biomed Anal. 54, 972-978 (2011).</li><li>Iijima, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+an+Online+Post-Column+Derivatization+System+for+Ultra+High-Performance+Liquid+Chromatography+(UHPLC)+and+Its+Applications+to+Analysis+of+Biogenic+Amines.">Optimization of an Online Post-Column Derivatization System for Ultra High-Performance Liquid Chromatography (UHPLC) and Its Applications to Analysis of Biogenic Amines.</a> Anal Sci. 29, 539-545 (2013).</li><li>Cunico, R. L., Schlabach, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Ninhydrin+and+o-Phthalaldehyde+Postcolumn+Detection+Techniques+for+High+Performance+Liquid+Chromatography+of+Free+Amino.">Comparison of Ninhydrin and o-Phthalaldehyde Postcolumn Detection Techniques for High Performance Liquid Chromatography of Free Amino.</a> J. Chromatogr. A. 1983, 461-470 (1983).</li><li>Donahue, E. P., Brown, L. L., Flakoll, P. J., Abumrad, N. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Measurement+of+Leucine-specific+Activity+in+Biological+Fluids+by+Ion-exchange+Chromatography+and+Post-column+Ninhydrin+Detection.">Rapid Measurement of Leucine-specific Activity in Biological Fluids by Ion-exchange Chromatography and Post-column Ninhydrin Detection.</a> J. Chromatogr. A. 571, 29-36 (1998).</li><li>Udenfriend, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescamine:+A+Reagent+for+Assay+of+Amino+Acids,+Peptides,+Proteins+and+Primary+Amines+in+the+Picomole+Range.">Fluorescamine: A Reagent for Assay of Amino Acids, Peptides, Proteins and Primary Amines in the Picomole Range.</a> Science. 1972, 871-872 (1972).</li><li>Samejima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+Fluorescamine+Derivitices+of+Aliphatic+Diamines+and+Polyamines+by+High+Speed+Liquid+Chromatography.">Separation of Fluorescamine Derivitices of Aliphatic Diamines and Polyamines by High Speed Liquid Chromatography.</a> J. Chromatogr. A. 96, 250-254 (1974).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+antioxidant+activity+of+ten+compounds+in+different+tea+samples+by+means+of+an+on-line+HPLC-DPPH+assay.">Evaluation of antioxidant activity of ten compounds in different tea samples by means of an on-line HPLC-DPPH assay.</a> Food Res Int. 53, 847-856 (2013).</li><li>Niu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+anti-oxidants+in+Flos+Chrysanthemi+by+HPLC-DAD-ESI/MS(n)+and+HPLC+coupled+with+a+post-column+derivatisation+system.">Identification of the anti-oxidants in Flos Chrysanthemi by HPLC-DAD-ESI/MS(n) and HPLC coupled with a post-column derivatisation system.</a> Phytochem Anal. 24, 59-68 (2013).</li><li>Raudonis, R., Bumblauskiene, L., Jakstas, V., Pukalskas, A., Janulis, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+and+validation+of+post-column+assay+for+screening+of+radical+scavengers+in+herbal+raw+materials+and+herbal+preparations.">Optimization and validation of post-column assay for screening of radical scavengers in herbal raw materials and herbal preparations.</a> J. Chromatogr. A. 1217, 7690-7698 (2010).</li><li>Raudonis, R., Raudone, L., Jakstas, V., Janulis, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+evaluation+of+post-column+free+radical+scavenging+and+ferric+reducing+antioxidant+power+assays+for+screening+of+antioxidants+in+strawberries.">Comparative evaluation of post-column free radical scavenging and ferric reducing antioxidant power assays for screening of antioxidants in strawberries.</a> J. Chromatogr. A. 1233, 8-15 (2012).</li><li>Zakrzewski, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+Methimazole+in+Pharmaceutical+Preparations+using+an+HPLC+Method+Coupled+with+an+Iodine-Azide+Post-Column+Reaction.">Determination of Methimazole in Pharmaceutical Preparations using an HPLC Method Coupled with an Iodine-Azide Post-Column Reaction.</a> J. Liq. Chrom. Rel. Technol. 32, 383-398 (2008).</li><li>Zakrzewski, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+validation+of+a+reversed-phase+HPLC+method+with+post-column+iodine-azide+reaction+for+the+determination+of+thioguanine.">Development and validation of a reversed-phase HPLC method with post-column iodine-azide reaction for the determination of thioguanine.</a> J. Anal. Chem. 64, 1235-1241 (2009).</li><li>Gritti, F., Guiochon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+measurements+of+the+true+column+efficiency+and+of+the+instrument+band+broadening+contributions+in+the+presence+of+a+chromatographic+column.">Accurate measurements of the true column efficiency and of the instrument band broadening contributions in the presence of a chromatographic column.</a> J. Chromatogr. A. 1327, 49-56 (2014).</li><li>Stewart, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post+cotumn+derivatization+methodology+in+high+performance+liquid+chromatography+(HPLC).">Post cotumn derivatization methodology in high performance liquid chromatography (HPLC).</a> Trends Anal. Chem. 1, 170-174 (1982).</li><li>Rigas, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-column+labeling+techniques+in+amino+acid+analysis+by+liquid+chromatography.">Post-column labeling techniques in amino acid analysis by liquid chromatography.</a> Anal. Bioanal. Chem. 405, 7957-7992 (2013).</li><li>Frei, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reaction+Detectors+in+Modern+Liquid+Chromatography.">Reaction Detectors in Modern Liquid Chromatography.</a> Chromatographia. 15, 161-166 (1982).</li><li>Pravadil-Cekic, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+Reaction+Flow+Chromatography+for+the+Analysis+of+Amino+Acid:+Derivatisation+With+Fluorescamine+Reagent.">Using Reaction Flow Chromatography for the Analysis of Amino Acid: Derivatisation With Fluorescamine Reagent.</a> Microchem. J. , (2015).</li><li>Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Dennis, G. R., Shalliker, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+segmented+flow+chromatography+columns+with+multiplexed+detection:+An+illustration+using+antioxidant+screening+of+natural+products.">Parallel segmented flow chromatography columns with multiplexed detection: An illustration using antioxidant screening of natural products.</a> Microchem. J. 110, 726-730 (2013).</li><li>Koleva, I. I., Niederlander, H. A. G., van Beek, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+On-Line+HPLC+Method+for+Detection+of+Radical+Scavenging+Compounds+in+Complex+Mixtures.">An On-Line HPLC Method for Detection of Radical Scavenging Compounds in Complex Mixtures.</a> Anal Chem. 72, 2323-2328 (2000).</li><li>Selim, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Two-component+Post-column+Derivatisation+Method+Utilsing+Reaction+Flow+Chromatography.">A Two-component Post-column Derivatisation Method Utilsing Reaction Flow Chromatography.</a> Microchem. J. 116, 87-91 (2014).</li><li>Bigley, F. P., Grob, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+Phenols+in+Water+and+Wastewater+by+Post-column+Reaction+Detection+High-performance+Liquid+Chromatography.">Determination of Phenols in Water and Wastewater by Post-column Reaction Detection High-performance Liquid Chromatography.</a> J. Chromatogr. A. 350, 407-416 (1985).</li><li>Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Dennis, G. R., Shalliker, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reaction+flow+chromatography+for+rapid+post+column+derivatisations:+The+analysis+of+antioxidants+in+natural+products.">Reaction flow chromatography for rapid post column derivatisations: The analysis of antioxidants in natural products.</a> J. Chromatogr. A. 1303, 62-65 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

RF-PCD permet le mélange efficace du réactif de dérivatisation avec le post-colonne HPLC effluent sans l&#39;utilisation de bobines de réaction, minimisant ainsi les effets de l&#39;élargissement de bande et améliorer la performance de séparation. Méthodes RF-CPD ont également montré l&#39;amélioration de la réponse du signal par rapport au procédé de détection. Camenzuli et al. 28 a été le premier à signaler l&#39;utilisation de colonnes de flux de réaction avec DPPH •</sup...

Chromatographie haute performance liquide (HPLC) couplée à la colonne après dérivatisation (PCD) est un outil puissant qui est utile dans la résolution d&#39;un certain nombre de questions dans le laboratoire d&#39;analyse. Il peut être utilisé pour détecter des composés qui sont par ailleurs indétectable à la série de détecteurs disponibles 1,2, augmenter le signal de l&#39;analyte cible, ce qui permet aux limites inférieures de détection et la quantification ou de manière sélective 05/03 dérivatiser un analyte cible, afin d&#39;éviter les effets de matrice 6. Les réactions PCD couramment utilisés comprennent la réaction des amines, telles que des acides aminés, avec l&#39; ortho-phthaladehyde 7-9, ou ninhydrine 9,10 11,12 fluorescamine, la dérivatisation d&#39;espèces réactives de l&#39; oxygène (ERO) avec le 2,2-diphényl 1-picrylhydrazil radicaux DPPH (•) ou 13,14 2,2&#39;-azino-bis (acide 3-éthylbenzothiazoline-6-sulfonique (ABTS) 15,16, et l&#39;utilisation du réactif iodure azoture pour dériver du soufre ccomposés ontenant 17,18. Il existe, cependant, de nombreux inconvénients à l&#39;utilisation de réactions de PCD avec des systèmes HPLC 6. Parmi ceux - ci principalement l&#39;utilisation de bobines de réaction entre le point d&#39;addition du réactif de dérivatisation (s) et le détecteur, ce qui permet le temps de mélange et la réaction se produise 8. Ces réactions boucles ont souvent des volumes de 500 ul ou plus, ce qui est important par rapport au volume du reste du système HPLC 19. L&#39;utilisation de ces réactions à volume élevé entraîne une augmentation de boucles élargissement du pic par rapport à celle qui serait observée en l&#39;absence de la boucle de réaction. Il en résulte, des pics plus courts plus larges qui ont des limites plus élevées de quantification et de détection et négativement effets que la résolution chromatographique. Les figures 1 et 2 mettre en évidence la détérioration de la forme des pics qui résultent de l&#39;addition de divers volumes de boucle de réaction post-colonne. cette analysea été réalisée avec une composition de phase mobile de 94% de methanol et de 6% d&#39;eau Milli-Q. Le débit de la phase mobile d&#39;écoulement était de 1 ml / min, le volume d&#39;injection était de 20 ul et l&#39;analyse de la longueur d&#39;onde est de 265 nm. Des bobines de faire varier les volumes morts de 20 pi à 1000 pi ont été insérées entre la colonne et le détecteur pour simuler les effets de la boucle de réaction un volume mort dans les procédés de PCD. Ces boucles ont été préparés à partir d&#39;un tube de diamètre intérieur 0,5 mm en acier inoxydable. L&#39;expérience a été effectuée sur un système HPLC constitué d&#39;un dispositif de commande (SCL-10Avp), un faible gradient de pression de soupape (LCM-10ALVP), une pompe (LC-20ad), un injecteur (SIL-10ADVP), et un détecteur (PDA SPD-M10ADVP). La phase mobile est pompée à travers un dégazeur avant l&#39;introduction dans le système HPLC. La séparation a été effectuée en utilisant un x 4,6 mm id 5 um colonne de 250 mm. Les conditions expérimentales ont été choisies pour être typique de réactions PCD qui ont récemment été publiés dans la littérature. lela plus simple, la configuration du réacteur à colonne de poste le plus commun est appelé un réacteur tubulaire non segmenté qui est effectivement un long tube mince à travers lequel le liquide peut couler et la réaction peut avoir lieu. Dans ce pic système élargissement dépend non seulement sur ​​le volume mort ajouté au système, mais aussi le diamètre intérieur du tube , comme mis en évidence par Iijima et al. , 8. En outre, la géométrie de la bobine joue un rôle dans la marque élargissement observée. Stewart a indiqué que 20 l&#39; enroulement du réacteur modifie les profils d&#39;écoulement secondaire, ce qui entraîne un meilleur mélange, ce qui signifie que le volume mort peut être réduite au minimum. Il a été déclaré que l&#39; élargissement des pics est pas significative lors de l&#39; utilisation d&#39; un tube ouvert tricoté bobine 21. Lors de l&#39;élargissement du pic est trop grande, d&#39; autres types de réacteurs peuvent également être considérés 20,22. Ceux-ci peuvent comprendre des réacteurs à lit ou réacteurs à écoulement segmenté. Ces réacteurs sont particulièrement utiles pour des réactions lentes qui seraient autrement require grande réaction des boucles. Comme réacteurs tubulaires non-segmentés sont les types les plus courants de réacteurs utilisés dans les applications PCD, le reste de cet article traite de ce type de configuration du réacteur. La conception de la colonne d&#39;écoulement de réaction (RF) comprend un raccord d&#39;extrémité à orifices multiples qui permet la phase mobile pour sortir (ou entrée) de la colonne à travers un seul port situé dans la zone centrale radiale de la colonne ou trois ports situés à l&#39;extérieur région de paroi de la colonne (voir figure 3). Ces deux courants sont séparés au moyen d&#39;un raccord d&#39;extrémité contenant une fritte poreuse centrale qui est entourée par un anneau imperméable qui est à son tour entourée par une fritte poreuse externe qui se prolonge vers la paroi de la colonne. En raison de l&#39;écoulement imperméable bague de croix centrale est pas possible entre les deux régions poreuses. Au cours de la Chromatographie d&#39;écoulement de réaction, le réactif (s) de dérivation sont pompés à l&#39;encontre du sens d&#39;écoulement de la phase mobile dans une ou two des orifices extérieurs de la colonne d&#39;écoulement de réaction. L&#39;éluant de la colonne est mélangée avec le réactif (s) de dérivatisation dans la fritte externe et transmis au détecteur à travers un orifice externe libre. écoulement de réaction peut être utilisé soit pour un dérivé réactif unique (1 port du réactif de dérivatisation, 1 port pour passer l&#39;éluant de la colonne au détecteur et 1 port bloqué) ou d&#39;un système réactif à deux (2 ports pour les réactifs de dérivatisation et 1 port passer la colonne éluant au détecteur). Le débit du courant central peut soit être utilisé pour détecter l&#39;éluant de la colonne dérivatisé, la détection efficace de multiplexage 23, ou passé à perdre. Une technique de réglage principal qui est disponible lors de l&#39;exécution chromatographie RF-CPD est le rapport entre les flux centraux et périphériques. Le rapport optimal pour chaque dérivatisation dépend d&#39;un certain nombre de facteurs, tels que l&#39;écoulement central sera détecté ou transmis à déchets. Par conséquent, une fois que le rapport optimal a été déterminé, Il faut veiller à ce que le rapport de débit correct est réalisé avant chaque exécution en cours d&#39;exécution. Il a été constaté que l&#39;utilisation d&#39;une fritte pour mélanger le courant colonne d&#39;éluant et le réactif de dérivatisation dans les résultats RF-CPD dans un mélange plus efficace par rapport à des techniques de mélange classiques qui emploient typiquement une pièce en T à zéro du volume mort ou de faible volume mort W- pièce à mélanger les deux courants. Ceci a permis l&#39;utilisation de relativement petites boucles de réaction, voire la suppression de la boucle de réaction au total. La diminution des résultats de la taille de réaction en boucle pics plus par rapport aux méthodes traditionnelles de dérivatisation post-colonne. Cela signifie que, en dépit du fait que la totalité de l&#39;éluant de la colonne est dérivatisé, un plus grand rapport signal sur bruit sont observés et donc des limites inférieures de détection et la quantification peut être réalisée. Chromatographie d&#39;écoulement de réaction a été mis au point pour surmonter les difficultés d&#39;adaptation de la réaction de CPDs aux colonnes modernes de CLHP et de systèmes, en particulier la perte d&#39;efficacité causée par l&#39;élargissement de bande en raison de grands volumes morts après des colonnes causées par la nécessité d&#39;employer la réaction de grand volume boucles. Les procédés de mélange plus efficaces RF-PCD PCD par rapport au conventionnel signifie que le volume de la boucle de réaction inférieures peuvent être employées conduisant à une augmentation de l&#39;efficacité de la séparation observée. Par ailleurs Chromatographie RF-PCD montre à la fois le signal augmenté et diminué de bruit par rapport aux techniques de PCD classiques aboutissant à des limites inférieures de détection et la quantification par rapport aux méthodes de PCD classiques. Un autre avantage de la CPD-RF par rapport aux méthodes classiques de la CPD est la capacité à surveiller le courant dérivatisé qui est élué à partir de l&#39;orifice central de la colonne HF ainsi que le courant dérivé qui est élué à partir de la région périphérique de la colonne. RF-PCD est relativement nouvelle mais prometteuse technique qui affiche de nombreux avantages par rapport aux méthodes traditionnelles de PCD. <p class="jove_content"&gt; Connexion de la colonne HF est réalisée pratiquement de la même manière qu&#39;une colonne de HPLC classique avec la différence majeure étant le nombre de raccords d&#39;extrémité sur une colonne RF. Les raccords utilisés pour connecter une colonne de HPLC standard pour le système HPLC peuvent être utilisés pour connecter une colonne RF au système HPLC.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>HPLC instrument</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>1290 Series HPLC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Additional Pump(s) for derivatisation system</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td>LC-20A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RF colum</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Non-commercial</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEEK tubing</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z227307</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Column stoppers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Provided with column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEEK tube cutter</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z290882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical Scale Balance</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>4-point analytical balance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stop watch</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Non-Scientific equiptment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eluent collection vials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any Small vial with a flat bottom will do e.g. HPLC vials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC Vials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Will depend on instrument used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vessels for mobile phase and derivatisation solution(s)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z232211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>General Laboratory glassware</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Volumetric Flasks, pippettes, etc. Quantity and volumes will depend on sample preparation method</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>34860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPPH</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D9132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Acetate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>17836</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonia</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>320145</td>
			<td>Corrosive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>34998</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescamine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F9015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-aminoantipyrene&#160;</td>
			<td>Acros Organics BVBA</td>
			<td>AC103151000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium ferricyanide&#160;</td>
			<td>AnalaR</td>
			<td>B10204-30</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

post column derivatization using reaction flow high performance liquid chromatography columns

A protocol for the use of reaction flow high performance liquid chromatography columns for methods employing post column derivatization (PCD) is presented. A major difficulty in adapting PCD to modern HPLC systems and columns is the need for large volume reaction coils that enable reagent mixing and then the derivatization reaction to take place. This large post column dead volume leads to band broadening, which results in a loss of observed separation efficiency and indeed detection in sensitivity. In reaction flow post column derivatization (RF-PCD) the derivatization reagent(s) are pumped against the flow of mobile phase into either one or two of the outer ports of the reaction flow column where it is mixed with column effluent inside a frit housed within the column end fitting. This technique allows for more efficient mixing of the column effluent and derivatization reagent(s) meaning that the volume of the reaction loops can be minimized or even eliminated altogether. It has been found that RF-PCD methods perform better than conventional PCD methods in terms of observed separation efficiency and signal to noise ratio. A further advantage of RF-PCD techniques is the ability to monitor effluent coming from the central port in its underivatized state. RF-PCD has currently been trialed on a relatively small range of post column reactions, however, there is currently no reason to suggest that RF-PCD could not be adapted to any existing one or two component (as long as both reagents are added at the same time) post column derivatization reaction.

La première méthode PCD qui a été adapté pour être utilisé par RF-PCD est la dérivatisation d&#39;antioxydants en utilisant le radical 2,2-diphényl-1-picrylhydrazil (DPPH •) 24. Cette réaction a été introduit par Koleva et al. , 25 et a été largement utilisée depuis. La détection repose sur la décoloration du DPPH • radicalaire en présence d&#39;espèces réactives de l&#39; oxygène, d&#39; où la présence d&#39;anti - oxydants se traduit par u...

Watch this Scientific Journal Video about Post Column Derivatization Using Reaction Flow High Performance Liquid Chromatography Columns at JoVE.com

Post Column Derivatization Using Reaction Flow High Performance Liquid Chromatography Columns

A protocol for the use of reaction flow high performance liquid chromatography columns for methods employing post column derivatization (PCD) is presented.

Poster Colonne dérivatisation en utilisant la réaction Colonnes flux chromatographie liquide haute performance

A protocol for the use of reaction flow high performance liquid chromatography columns for methods employing post column derivatization (PCD) is ...

post-column-derivatization-using-reaction-flow-high-performance

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Analytical Chemistry

Chemistry

Unit 1

Principles of Chromatography

SCIENTISTS IN ACTION

14.9K vues.  University of Western Sydney. A protocol for the use of reaction flow high performance liquid chromatography columns for methods employing post column derivatization (PCD) is presented.

Vidéo: Post Column Derivatization Using Reaction Flow High Performance Liquid Chromatography Columns

Large Scale Non-targeted Metabolomic Profiling of Serum by Ultra Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (UPLC-MS)

Non-targeted metabolite profiling by ultra performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry (UPLC-MS) is a powerful technique to investigate metabolism. The approach offers an unbiased and in-depth analysis that can enable the development of diagnostic tests, novel therapies, and further our understanding of disease processes. The inherent chemical diversity of the metabolome creates significant analytical challenges and there is no single experimental approach that can detect all metabolites. Additionally, the biological variation in individual metabolism and the dependence of metabolism on environmental factors necessitates large sample numbers to achieve the appropriate statistical power required for meaningful biological interpretation. To address these challenges, this tutorial outlines an analytical workflow for large scale non-targeted metabolite profiling of serum by UPLC-MS. The procedure includes guidelines for sample organization and preparation, data acquisition, quality control, and metabolite identification and will enable reliable acquisition of data for large experiments and provide a starting point for laboratories new to non-targeted metabolite profiling by UPLC-MS.

Large Scale Non-targeted Metabolomic Profiling of Serum by Ultra Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry UPLC-MS

Non-targeted metabolite profiling by ultra performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry (UPLC-MS) is a powerful technique to investigate metabolism. This article outlines a typical workflow utilized for non-targeted metabolite profiling of serum including sample organization and preparation, data acquisition, data analysis, quality control, and metabolite identification.

À grande échelle non ciblée profilage métabolomique du sérum par Ultra Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (UPLC-MS)

Non-targeted metabolite profiling by ultra performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry (UPLC-MS) is a powerful technique to ...

Recherche

Chimie

Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry (UPLC-HRMS)

Here we present a workflow to analyze the metabolic profiles for biological samples of interest including; cells, serum, or tissue. The sample is first separated into polar and non-polar fractions by a liquid-liquid phase extraction, and partially purified to facilitate downstream analysis. Both aqueous (polar metabolites) and organic (non-polar metabolites) phases of the initial extraction are processed to survey a broad range of metabolites. Metabolites are separated by different liquid chromatography methods based upon their partition properties. In this method, we present microflow ultra-performance (UP)LC methods, but the protocol is scalable to higher flows and lower pressures. Introduction into the mass spectrometer can be through either general or compound optimized source conditions. Detection of a broad range of ions is carried out in full scan mode in both positive and negative mode over a broad m/z range using high resolution on a recently calibrated instrument. Label-free differential analysis is carried out on bioinformatics platforms. Applications of this approach include metabolic pathway screening, biomarker discovery, and drug development.

Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry UPLC-HRMS

Untargeted metabolomics provides a hypothesis generating snapshot of a metabolic profile. This protocol will demonstrate the extraction and analysis of metabolites from cells, serum, or tissue. A range of metabolites are surveyed using liquid-liquid phase extraction, microflow ultraperformance liquid chromatography/high-resolution mass spectrometry (UPLC-HRMS) coupled to differential analysis software.

Metabolomics non ciblées de sources biologiques en utilisant UltraPerformance chromatographie liquide haute résolution spectrométrie de masse (UPLC-HRMS)

Here we present a workflow to analyze the metabolic profiles for biological samples of interest including; cells, serum, or tissue. The sample is first ...

Isolation and Preparation of Bacterial Cell Walls for Compositional Analysis by Ultra Performance Liquid Chromatography

The bacterial cell wall is critical for the determination of cell shape during growth and division, and maintains the mechanical integrity of cells in the face of turgor pressures several atmospheres in magnitude. Across the diverse shapes and sizes of the bacterial kingdom, the cell wall is composed of peptidoglycan, a macromolecular network of sugar strands crosslinked by short peptides. Peptidoglycan&#8217;s central importance to bacterial physiology underlies its use as an antibiotic target and has motivated genetic, structural, and cell biological studies of how it is robustly assembled during growth and division. Nonetheless, extensive investigations are still required to fully characterize the key enzymatic activities in peptidoglycan synthesis and the chemical composition of bacterial cell walls. High Performance Liquid Chromatography (HPLC) is a powerful analytical method for quantifying differences in the chemical composition of the walls of bacteria grown under a variety of environmental and genetic conditions, but its throughput is often limited. Here, we present a straightforward procedure for the isolation and preparation of bacterial cell walls for biological analyses of peptidoglycan via HPLC and Ultra Performance Liquid Chromatography (UPLC), an extension of HPLC that utilizes pumps to deliver ultra-high pressures of up to 15,000 psi, compared with 6,000 psi for HPLC. In combination with the preparation of bacterial cell walls presented here, the low-volume sample injectors, detectors with high sampling rates, smaller sample volumes, and shorter run times of UPLC will enable high resolution and throughput for novel discoveries of peptidoglycan composition and fundamental bacterial cell biology in most biological laboratories with access to an ultracentrifuge and UPLC.

The bacterial cell wall is composed of peptidoglycan, a macromolecular network of sugar strands crosslinked by peptides. Ultra Performance Liquid Chromatography provides high resolution and throughput for novel discoveries of peptidoglycan composition. We present a procedure for the isolation of cell walls (sacculi) and their subsequent preparation for analysis via UPLC.

Isolement et préparation de parois cellulaires bactériennes pour l’analyse de composition par chromatographie liquide ultra-performante

The bacterial cell wall is critical for the determination of cell shape during growth and division, and maintains the mechanical integrity of cells in the ...

Tuning a Parallel Segmented Flow Column and Enabling Multiplexed Detection

Active flow technology (AFT) is new form of column technology that was designed to overcome flow heterogeneity to increase separation performance in terms of efficiency and sensitivity and to enable multiplexed detection. This form of AFT uses a parallel segmented flow (PSF) column. A PSF column outlet end-fitting consists of 2 or 4 ports, which can be multiplexed to connect up to 4 detectors. The PSF column not only allows a platform for multiplexed detection but also the combination of both destructive and non-destructive detectors, without additional dead volume tubing, simultaneously. The amount of flow through each port can also be adjusted through pressure management to suit the requirements of a specific detector(s). To achieve multiplexed detection using a PSF column there are a number of parameters which can be controlled to ensure optimal separation performance and quality of results; that is tube dimensions for each port, choice of port for each type of detector and flow adjustment. This protocol is intended to show how to use and tune a PSF column functioning in a multiplexed mode of detection.

Here, we present a protocol for the operation and tuning of parallel segmented flow chromatography columns to enable multiplexed detection.

Tuning une colonne sectorielle écoulement parallèle et Activation de la détection multiplexée

Active flow technology (AFT) is new form of column technology that was designed to overcome flow heterogeneity to increase separation performance in terms ...

Curtain Flow Column: Optimization of Efficiency and Sensitivity

Active Flow Technology (AFT) is a form of column technology that increases the separation performance of a HPLC column through the use of a specially purpose built multiport end-fitting(s). Curtain Flow (CF) columns belong to the AFT suite of columns, specifically the CF column is designed so that the sample is injected into the radial central region of the bed and a curtain flow of mobile phase surrounding the injection of solute prevents the radial dispersion of the sample to the wall. The column functions as an 'infinite diameter' column. The purpose of the design is to overcome the radial heterogeneity of the column bed, and at the same time maximize the sample load into the radial central region of the column bed, which serves to increase detection sensitivity. The protocol described herein outlines the system and CF column set up and the tuning process for an optimized infinite diameter 'virtual' column.

Here, we present a protocol for the operation and optimization of Active Flow Technology (AFT) column in Curtain flow (CF) mode for enhanced separation performance.

Rideau Colonne Débit: Optimisation de l&#39;efficacité et sensibilité

Active Flow Technology (AFT) is a form of column technology that increases the separation performance of a HPLC column through the use of a specially ...

Radiolabeling and Quantification of Cellular Levels of Phosphoinositides by High Performance Liquid Chromatography-coupled Flow Scintillation

Phosphoinositides (PtdInsPs) are essential signaling lipids responsible for recruiting specific effectors and conferring organelles with molecular identity and function. Each of the seven PtdInsPs varies in their distribution and abundance, which are tightly regulated by specific kinases and phosphatases. The abundance of PtdInsPs can change abruptly in response to various signaling events or disturbance of the regulatory machinery. To understand how these events lead to changes in the amount of PtdInsPs and their resulting impact, it is important to quantify PtdInsP levels before and after a signaling event or between control and abnormal conditions. However, due to their low abundance and similarity, quantifying the relative amounts of each PtdInsP can be challenging. This article describes a method for quantifying PtdInsP levels by metabolically labeling cells with 3H-myo-inositol, which is incorporated into PtdInsPs. Phospholipids are then precipitated and deacylated. The resulting soluble 3H-glycero-inositides are further extracted, separated by high-performance liquid chromatography (HPLC), and detected by flow scintillation. The labeling and processing of yeast samples is described in detail, as well as the instrumental setup for the HPLC and flow scintillator. Despite losing structural information regarding acyl chain content, this method is sensitive and can be optimized to concurrently quantify all seven PtdInsPs in cells.

Phosphoinositides are signaling lipids whose relative abundance rapidly changes in response to various stimuli. This article describes a method to measure the abundance of phosphoinositides by metabolically labeling cells with 3H-myo-inositol, followed by extraction and deacylation. Extracted glycero-inositides are then separated by high-performance liquid chromatography and quantified by flow scintillation.

Radiomarquage et la quantification des niveaux cellulaires de phosphoinositides par chromatographie liquide haute performance couplée flux scintillation

Phosphoinositides (PtdInsPs) are essential signaling lipids responsible for recruiting specific effectors and conferring organelles with molecular ...

Synthesis of Programmable Main-chain Liquid-crystalline Elastomers Using a Two-stage Thiol-acrylate Reaction

This study presents a novel two-stage thiol-acrylate Michael addition-photopolymerization (TAMAP) reaction to prepare main-chain liquid-crystalline elastomers (LCEs) with facile control over network structure and programming of an aligned monodomain. Tailored LCE networks were synthesized using routine mixing of commercially available starting materials and pouring monomer solutions into molds to cure. An initial polydomain LCE network is formed via a self-limiting thiol-acrylate Michael-addition reaction. Strain-to-failure and glass transition behavior were investigated as a function of crosslinking monomer, pentaerythritol tetrakis(3-mercaptopropionate) (PETMP). An example non-stoichiometric system of 15 mol% PETMP thiol groups and an excess of 15 mol% acrylate groups was used to demonstrate the robust nature of the material. The LCE formed an aligned and transparent monodomain when stretched, with a maximum failure strain over 600%. Stretched LCE samples were able to demonstrate both stress-driven thermal actuation when held under a constant bias stress or the shape-memory effect when stretched and unloaded. A permanently programmed monodomain was achieved via a second-stage photopolymerization reaction of the excess acrylate groups when the sample was in the stretched state. LCE samples were photo-cured and programmed at 100%, 200%, 300%, and 400% strain, with all samples demonstrating over 90% shape fixity when unloaded. The magnitude of total stress-free actuation increased from 35% to 115% with increased programming strain. Overall, the two-stage TAMAP methodology is presented as a powerful tool to prepare main-chain LCE systems and explore structure-property-performance relationships in these fascinating stimuli-sensitive materials.

A novel methodology is presented to synthesize and program main-chain liquid-crystalline elastomers using commercially available starting monomers. A wide range of thermomechanical properties was tailored by adjusting the amount of crosslinker, while the actuation performance was dependent on the amount of applied strain during programming.

Synthèse de la chaîne principale programmable élastomères à cristaux liquides à l&#39;aide d&#39;un thiol-acrylate de réaction en deux étapes

This study presents a novel two-stage thiol-acrylate Michael addition-photopolymerization (TAMAP) reaction to prepare main-chain liquid-crystalline ...

A Straightforward Method for Glucosinolate Extraction and Analysis with High-pressure Liquid Chromatography (HPLC)

Glucosinolates are a well-studied and highly diverse class of natural plant compounds. They play important roles in plant resistance, rapeseed oil quality, food flavoring, and human health. The biological activity of glucosinolates is released upon tissue damage, when they are mixed with the enzyme myrosinase. This results in the formation of pungent and toxic breakdown products, such as isothiocyanates and nitriles. Currently, more than 130 structurally different glucosinolates have been identified. The chemical structure of the glucosinolate is an important determinant of the product that is formed, which in turn determines its biological activity. The latter may range from detrimental (e.g., progoitrin) to beneficial (e.g., glucoraphanin). Each glucosinolate-containing plant species has its own specific glucosinolate profile. For this reason, it is important to correctly identify and reliably quantify the different glucosinolates present in brassicaceous leaf, seed, and root crops or, for ecological studies, in their wild relatives. Here, we present a well-validated, targeted, and robust method to analyze glucosinolate profiles in a wide range of plant species and plant organs. Intact glucosinolates are extracted from ground plant materials with a methanol-water mixture at high temperatures to disable myrosinase activity. Thereafter, the resulting extract is brought onto an ion-exchange column for purification. After sulfatase treatment, the desulfoglucosinolates are eluted with water and the eluate is freeze-dried. The residue is taken up in an exact volume of water, which is analyzed by high-pressure liquid chromatography (HPLC) with a photodiode array (PDA) or ultraviolet (UV) detector. Detection and quantification are achieved by conducting comparisons of the retention times and UV spectra of commercial reference standards. The concentrations are calculated based on a sinigrin reference curve and well-established response factors. The advantages and disadvantages of this straightforward method, when compared to faster and more technologically advanced methods, are discussed here.

A Straightforward Method for Glucosinolate Extraction and Analysis with High-pressure Liquid Chromatography HPLC

Here, we describe in great detail an established and robust protocol for the extraction of glucosinolates from ground plant materials. After an on-column sulfatase treatment of the extracts, the desulfoglucosinolates are eluted and analyzed by high-pressure liquid chromatography.

Une méthode simple pour l&#39;extraction et l&#39;analyse glucosinolates avec haute pression chromatographie liquide (HPLC)

Glucosinolates are a well-studied and highly diverse class of natural plant compounds. They play important roles in plant resistance, rapeseed oil ...

A Convenient Method for Extraction and Analysis with High-Pressure Liquid Chromatography of Catecholamine Neurotransmitters and Their Metabolites

The extraction and analysis of catecholamine neurotransmitters in biological fluids is of great importance in assessing nervous system function and related diseases, but their precise measurement is still a challenge. Many protocols have been described for neurotransmitter measurement by a variety of instruments, including high-pressure liquid chromatography (HPLC). However, there are shortcomings, such as complicated operation or hard-to-detect multiple targets, which cannot be avoided, and presently, the dominant analysis technique is still HPLC coupled with sensitive electrochemical or fluorimetric detection, due to its high sensitivity and good selectivity. Here, a detailed protocol is described for the pretreatment and detection of catecholamines with high pressure liquid chromatography with electrochemical detection (HPLC-ECD) in real urine samples of infants, using electrospun composite nanofibers composed of polymeric crown ether with polystyrene as adsorbent, also known as the packed-fiber solid phase extraction (PFSPE) method. We show how urine samples can be easily precleaned by a nanofiber-packed solid phase column, and how the analytes in the sample can be rapidly enriched, desorbed, and detected on an ECD system. PFSPE greatly simplifies the pretreatment procedures for biological samples, allowing for decreased time, expense, and reduction of the loss of targets. 
Overall, this work illustrates a simple and convenient protocol for solid-phase extraction coupled to an HPLC-ECD system for simultaneous determination of three monoamine neurotransmitters (norepinephrine (NE), epinephrine (E), dopamine (DA)) and two of their metabolites (3-methoxy-4-hydroxyphenylglycol (MHPG) and 3,4-dihydroxy-phenylacetic acid (DOPAC)) in infants' urine. The established protocol was applied to assess the differences of urinary catecholamines and their metabolites between high-risk infants with perinatal brain damage and healthy controls. Comparative analysis revealed a significant difference in urinary MHPG between the two groups, indicating that the catecholamine metabolites may be an important candidate marker for early diagnosis of cases at risk for brain damage in infants.

We present a convenient solid-phase extraction coupled to high-pressure liquid chromatography (HPLC) with electrochemical detection (ECD) for simultaneous determination of three monoamine neurotransmitters and two of their metabolites in infants' urine. We also identify the metabolite MHPG as a potential biomarker for the early diagnosis of brain damage for infants.

Une méthode pratique pour l’Extraction et analyse par chromatographie liquide à haute pression des neurotransmetteurs catécholamines et de leurs métabolites

The extraction and analysis of catecholamine neurotransmitters in biological fluids is of great importance in assessing nervous system function and ...

Continuous Flow Chemistry: Reaction of Diphenyldiazomethane with p-Nitrobenzoic Acid

Continuous flow technology has been identified as instrumental for its environmental and economic advantages leveraging superior mixing, heat transfer and cost savings through the &#34;scaling out&#34; strategy as opposed to the traditional &#34;scaling up&#34;. Herein, we report the reaction of diphenyldiazomethane with p-nitrobenzoic acid in both batch and flow modes. To effectively transfer the reaction from batch to flow mode, it is essential to first conduct the reaction in batch. As a consequence, the reaction of diphenyldiazomethane was first studied in batch as a function of temperature, reaction time, and concentration to obtain kinetic information and process parameters. The glass flow reactor set-up is described and combines two types of reaction modules with &#34;mixing&#34; and &#34;linear&#34; microstructures. Finally, the reaction of diphenyldiazomethane with p-nitrobenzoic acid was successfully conducted in the flow reactor, with up to 95% conversion of the diphenyldiazomethane in 11 min. This proof of concept reaction aims to provide insight for scientists to consider flow technology&#39;s competitiveness, sustainability, and versatility in their research.

Continuous Flow Chemistry: Reaction of Diphenyldiazomethane with p-Nitrobenzoic Acid

Flow chemistry carries environmental and economic advantages by leveraging superior mixing, heat transfer and cost benefits. Herein, we provide a blueprint to transfer chemical processes from batch to flow mode. The reaction of diphenyldiazomethane (DDM) with p-nitrobenzoic acid, conducted in batch and flow, was chosen for proof of concept.

Débit continu de chimie : La réaction de Diphenyldiazomethane avec de l’acide p- nitrobenzoïque

Continuous flow technology has been identified as instrumental for its environmental and economic advantages leveraging superior mixing, heat transfer and ...