The authors would like to thank all members of the Colucci lab for helpful discussions. This work was funded by The Wellcome Trust [094073/Z/10/Z], The Centre for Trophoblast Research and The British Heart Foundation.

Toutes les procédures décrites dans ce manuscrit sont conformes à la réglementation UK Home Office et sont approuvés par le comité d&#39;examen éthique Cambridge. 1. Prélèvement <ol><li> Mettre en place des accouplements chronométrés en utilisant 8-12 souris C57BL / 6 souris femelles avec des mâles adultes (jusqu&#39;à 2 femelles par mâle) dans l&#39;après-midi. Vérifier la présence de bouchons vaginaux comme un signe de la copulation tôt le matin les jours suivants. La présence d&#39;un bouchon dans les marques du matin gd0.5. </li><li> Sur gd9.5, euthanasier l&#39;animal par dislocation cervicale et ouvrir la cavité abdominale. Notez que l&#39;euthanasie par le CO 2 peut provoquer une vasodilatation. </li><li> Utilisation de la soie dentaire doucement pour ligaturer les artères utérines (de la figure 1, des flèches en pointillés). Attachez le fil autour des artères à l&#39;extrémité de chaque corne utérine, proximale aux ovaires, ainsi que dans le col de l&#39;utérus. Note: Ne pas rompre les vaisseaux que cela peut entraîner dans les artères effondrés. </li> &lt;li&gt; Disséquer l&#39;utérus rapidement à l&#39;aide des ciseaux de dissection, exciser toute utérus distale pour les trois points de ligature à la pointe des cornes utérines et col de l&#39;utérus. </li><li> Placer l&#39;utérus sur une feuille de polystyrène préparés sorte que les deux cornes sont alignées le long du même axe longitudinal dans des directions opposées à partir du col. Étirer doucement et l&#39;épingler en place en utilisant 2-3 25 g d&#39;aiguilles. </li><li> Immerger le polystyrène dans un tube conique de 50 ml préparée. Compléter à 50 ml avec 10% de formol. Correction pour les 5-6 heures à la température ambiante. </li><li> Jeter la solution de formol et de le remplacer par 50 ml 1x solution saline tamponnée au phosphate (PBS) pendant 5 min. </li><li> Exciser les deux cornes utérines proximale au point à chaque extrémité de ligature et proximale du col dans le centre, rogner l&#39;excédent de gras autour des sites d&#39;implantation et laver deux fois dans du PBS pendant 5 min pour éliminer les traces de formol. </li><li> Conserver les échantillons à 70% d&#39;éthanol à 4 ° C (jusqu&#39;à deux semaines) jusqu&#39;à leur traitement. ATTENTION: Ethanol est hautement inflammable. </li><li> Utiliser un système de traitement automatisé en utilisant les paramètres indiqués dans le tableau 1. Incorporer les cornes individuellement dans de la paraffine de sorte qu&#39;elles peuvent être coupées le long du plan perpendiculaire à l&#39;axe long de l&#39;utérus. Cela garantit que la surface maximale de chaque site d&#39;implantation sera exposé à analyser dans le milieu du bloc (figure 2A). OPTION: Ceci est un point de moment opportun pour la randomisation des blocs, si désiré. </li><li> L&#39;utilisation d&#39;un microtome, couper des sections de série de 7 um d&#39;épaisseur à partir des blocs. Colorer une section à chaque intervalle de 49 um avec hématoxyline et l&#39;éosine (H &amp; E, voir section 2.1). Stocker les sections restantes à la température ambiante pendant SMA coloration et d&#39;autres applications en aval. </li></ol><table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:99px;"> Solution </td><td style="width:43px;"> Temps<html></td><td style="width:97px;"> Température </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> 70% d&#39;éthanol </td><td> 1 h </td><td> 40 ° C </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> 100% Ethanol </td><td> 1 h </td><td> 40 ° C </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> 100% Ethanol </td><td> 1 h </td><td> 40 ° C </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> 100% Ethanol </td><td> 1 h </td><td> 40 ° C </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> 100% Ethanol </td><td> 1 h </td><td> 40 ° C </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> 100% Ethanol </td><td> 1 h </td><td> 40 ° C </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> 100% Ethanol </td><td> 1 h </td><td> 40 ° C </td></tr><tr height="21">: 21px; &quot;&gt; Xylène </td><td> 1 h </td><td> 40 ° C </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> Xylène </td><td> 1 h </td><td> 40 ° C </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> Xylène </td><td> 1 h </td><td> 40 ° C </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> Paraffine </td><td> 1 h </td><td> 63 ° C </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> Paraffine </td><td> 1 h </td><td> 63 ° C </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> Paraffine </td><td> 1 h </td><td> 63 ° C </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;"> Paraffine </td><td> 1 h </td><td> 63 ° C </td></tr></tbody></table> Tableau 1:. Réglages pour le traitement des tissus automatisé Aperçu du réglage utilisé pour le traitement de tissu utérin 2. SterÉvaluation eological <ol><li> Coloration H &amp; E <ol><li> Déparaffiner sections par immersion de lames montées dans un porte-diapositive dans un bain de xylène à 100% pendant 10 min à température ambiante. ATTENTION: Le xylène est inflammable et soupçonné d&#39;être cancérigène qui est toxique par contact et inhalation. Ce travail doit être effectué dans une hotte, en utilisant un équipement de protection individuelle (EPI). </li><li> Immerger les lames dans un bain contenant xylène propre pour encore 10 min. </li><li> Immerger séquentiellement diapositives dans des bains contenant 100% d&#39;éthanol, 95% d&#39;éthanol, 70% d&#39;éthanol et de l&#39;eau purifiée pendant 5 minutes chacun. </li><li> Immerger les lames dans 50% Gill Aucune solution à 3 hématoxyline, dilué avec de l&#39;eau purifiée, pendant 5 min. ATTENTION: Hematoxylin est nocif par ingestion et par contact pour les yeux. Porter des EPI appropriés lors de la manipulation. </li><li> Laver les lames dans une cuve de coloration sous l&#39;eau du robinet pendant 10 min. </li><li> Immerger les lames dans une solution acide% / alcool (10% 1 M d&#39;acide chlorhydrique dans l&#39;éthanol 70%) pendant 10 set laver dans une cuve de coloration sous l&#39;eau du robinet. </li><li> Plonger les lames dans une solution de l&#39;éosine pendant 30 secondes et se laver dans une cuve de coloration sous l&#39;eau du robinet pendant 10 min. </li><li> Dans une hotte, immerger séquentiellement diapositives dans des bains contenant 70% d&#39;éthanol, 95% d&#39;éthanol et 100% d&#39;éthanol pendant 5 minutes chacun. </li><li> Immerger les lames dans un bain contenant du xylène pendant 10 min. </li><li> Mont lamelles de l&#39;aide d&#39;un milieu de montage à base de xylène. Sécher complètement horizontalement et dans une hotte de laboratoire avant de visualiser les lames au microscope. </li></ol></li><li> Évaluation stéréologique la taille du navire et le remodelage Statut <ol><li> Pour chaque site d&#39;implantation, déterminer les sections sont près du point sagittal médian. L&#39;attachement chorioallantoïque entre le foetus et le développement du placenta sert comme un bon indicateur du point sagittal médian. </li><li> Sélectionnez 3 sections à 49 um intervalles rapprochés au point sagittal médian pour l&#39;analyse. Numériser des diapositives sélectionnées. Afin d&#39;éviter incveines Luding, qui ont été montrés pour être plus située à la périphérie dans les sites d&#39;implantation 16, restreignent l&#39;analyse sur la centrale 2/4 de chaque site d&#39;implantation (figure 2A). </li><li> Pour évaluer la taille lumière, dessiner autour de l&#39;intérieur des vaisseaux et enregistrer la zone de cette forme. Pour la taille totale de la cuve, dessiner autour de la paroi extérieure de la cuve, y compris les cellules endothéliales, les péricytes et les leucocytes intra-muros. Remarque: Le rapport de la taille navires total de lumière est un proxy pour le statut de remodelage d&#39;un navire. Comme les vaisseaux bobine à travers le plan que la section a été coupée le long, il peut y avoir plusieurs sections transversales de la même artère dans une diapositive. Éviter de mesurer la même artère plusieurs fois. </li><li> Inscrire les mesures des 5 navires dans chaque site d&#39;implantation avec les plus grands et les plus ronds lumens. Mesurer chaque site d&#39;implantation en triple (trois sections espacées de 49 pm les unes des autres). La moyenne de ces 15 mesures represeNTS le diamètre moyen des plus grands navires. </li><li> Pour éviter la surreprésentation des grands navires dans certains échantillons, mesurer le même nombre de navires dans chaque site d&#39;implantation. </li></ol></li></ol> 3. Évaluation qualitative par immunohistochimie <ol><li> Déparaffinage et la réhydratation <ol><li> Déparaffiner sections en immergeant diapositives montées dans un rack résistant à la chaleur de glisser dans un bain de xylène à 100% pendant 10 min à température ambiante. </li><li> Immerger les lames dans un bain contenant xylène propre pour encore 10 min. </li><li> Immerger séquentiellement diapositives dans des bains contenant 100% d&#39;éthanol, 95% d&#39;éthanol et 70% et de l&#39;eau purifiée pendant 5 minutes chacun. </li></ol></li><li> Antigène Retrieval <ol><li> Préparer un tampon de citrate de sodium 10 mM dans de l&#39;eau purifiée et ajuster le pH à 6 avec de l&#39;acide chlorhydrique 10 M. </li><li> Remplissez un récipient résistant à la chaleur qui peut contenir 600 ml avec 400 ml de sodium citrate et placer dans un autocuiseur domestique contenant wat suffisanteer à immerger moitié du récipient. Attachez sans serrer le couvercle de la cocotte et chauffer jusqu&#39;à ébullition. </li><li> Lieu glisser la grille dans la mémoire tampon de citrate de sodium et bien fixer le couvercle de la cocotte-minute. Une fois sous pression, laisser bouillir pendant 3 min. </li><li> Dépressuriser l&#39;autocuiseur et retirer le récipient interne. Laisser refroidir lames dans le tampon de citrate de sodium pendant 10 min à température ambiante. </li><li> Laver les lames dans un bain contenant de l&#39;eau purifiée pendant 5 min. </li><li> Encercler les sections à l&#39;aide d&#39;un stylo à barrière hydrophobe. </li><li> Laver les lames en immergeant dans du PBS pendant 5 min. </li></ol></li><li> Blocage endogène peroxydase et la liaison non spécifique <ol><li> Incuber les coupes avec 3% de peroxyde d&#39;hydrogène dilué dans de l&#39;eau purifiée dans une chambre humidifiée pendant 30 minutes à température ambiante. ATTENTION: Le peroxyde d&#39;hydrogène est très irritant pour les yeux, la peau et par ingestion. Porter des EPI appropriés. </li><li> Tapoter solution de peroxyde d&#39;hydrogène en excès et laver slides deux fois par immersion dans une solution saline tamponnée au Tris (TBS) pendant 2 min chacun. </li><li> Incuber les coupes avec des immunoglobulines de souris réactif de blocage de la souris sur la souris kit préparé selon les instructions du fabricant. </li><li> Laver les lames deux fois dans TBS pendant 2 min chacun. </li></ol></li><li> Immunodétection de Smooth Muscle Actin <ol><li> Préparer la solution de dilution d&#39;anticorps (fourni dans le kit) et incuber avec les sections pendant 5 minutes à la température ambiante, ou selon les instructions du fabricant. </li><li> Diluer 1: lisse 100 souris anti-humain actine musculaire (DAKO M0851) dans une solution d&#39;anticorps de diluant. Diluer souris d&#39;isotype IgG2a contrôle solution dans un diluant d&#39;anticorps, en veillant à ce que la concentration finale d&#39;immunoglobuline est équivalente dans les deux solutions. </li><li> Tapoter sections excès de solution d&#39;anticorps de diluant et couvrir avec soit des solutions de contrôle d&#39;anticorps ou isotype dilué. Incuber dans une chambre humidifiée pendant 30 minutes à température ambiante. </li><li> Laver les lames à deux reprises dans le SCT pour2 min chacun. </li><li> Diluer l&#39;anticorps secondaire anti-souris biotinylé et incuber les sections pendant 10 minutes à température ambiante, ou selon les instructions du fabricant. </li><li> Laver les lames une fois par le SCT et PBS pendant 2 min, respectivement. </li><li> Préparer 3,3&#39;-diaminobenzidine (DAB) solution selon les instructions du fabricant. Couvrir sections avec une solution DAB et laisser incuber jusqu&#39;à 4 min, assurant de suivre sections pour éviter le développement de la couleur en excès. ATTENTION: DAB est inflammable et soupçonné d&#39;être cancérigène qui est toxique par contact et inhalation. Porter des EPI appropriés lors de la manipulation. </li><li> Immerger les lames dans de l&#39;eau purifiée fois l&#39;intensité de la coloration désirée est atteinte. </li><li> Counterstain avec 50% Gill N ° 3 hématoxyline pendant 20 secondes et se laver dans une cuve de coloration sous l&#39;eau du robinet jusqu&#39;à ce l&#39;eau soit claire. </li></ol></li><li> Déshydratation et montage <ol><li> Dans une hotte, immerger séquentiellement diapositives dans des bains contenant 70% ethanol, éthanol à 95% et 100% d&#39;éthanol pendant 5 minutes chacun. </li><li> Immerger les lames dans un bain contenant du xylène pendant 10 min. </li><li> Mont lamelles de l&#39;aide d&#39;un milieu de montage à base de xylène. Sécher complètement horizontalement et dans une hotte de laboratoire avant de visualiser les lames au microscope </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Le protocole présenté ici est conçu pour fournir un procédé reproductible permettant d&#39;évaluer les changements vasculaires qui sont nécessaires pour grossesse réussie. Critique pour le succès de l&#39;évaluation est la qualité des coupes de tissu. Tant déterminer avec précision l&#39;âge gestationnel des sites d&#39;implantation ainsi que la ligature de manière fiable les artères utérines sont des étapes cruciales. Les modifications des paramètres tels que le temps de la fixation, le protocole de traitement du tissu, etc., peuvent aussi influer sur le résultat. Pour une évaluation objective stéréologique, il est important de mesurer le même nombre de vaisseaux dans chaque site d&#39;implantation. Il est recommandé de mesurer 5 navires par site d&#39;implantation et chaque site d&#39;implantation en trois exemplaires. La moyenne de ces 15 mesures représente la taille moyenne des 5 plus grands navires. En outre les données de Rag2 alymphoïde - / - IL2RG - / - souris présentés ici, nous avons trouvé cette protocol utile pour un certain nombre de modèles de la fonction immunitaire maternelle inadéquate, y compris l&#39;une des cellules NK inhibés 14. Des défauts dans le remodelage artériel ont également été montré dans des modèles de facultés affaiblies l&#39;invasion du trophoblaste 18 et les techniques décrites ici peuvent être utiles pour évaluer la vascularisation dans ces cas. Nous avons optimisé et validé ce protocole pour l&#39;enquête sur le remodelage vasculaire décidual à mi-gestation chez la souris, mais il est également envisageable d&#39;adapter ce protocole à travailler dans d&#39;autres systèmes modèles (par exemple des rats) ou même dans d&#39;autres organes. Alors que nous constatons que le remodelage NK-dépendante peut être solidement évalué à gd9.5, il peut être modifié pour d&#39;autres points dans le temps tels que gd12.5, lorsque le système vasculaire maternelle est complètement remodelé. A ce point de temps, l&#39;invasion du trophoblaste endovasculaire est plus profond 16 et ce point de temps peut être plus approprié pour les enquêtes sur le rôle de trophoblaste des changements vasculaires. Si les lectures quantitatives supplémentaires sont souhaités,les enquêteurs peuvent également augmenter le nombre de sections colorées pour SMA et d&#39;évaluer le pourcentage de navires partiellement rénovées au sein de chaque site d&#39;implantation. Une limitation de ce protocole est la nature descriptive des examens histologiques. Des dosages fonctionnels, cependant, ne sont plus en lentement disponible (tel que l&#39;échographie Doppler 19). Ces techniques nécessitent une expertise technique et des dépenses beaucoup plus élevées pour l&#39;acquisition et l&#39;entretien du matériel, mais ont l&#39;avantage de fournir une lecture longitudinale in vivo de l&#39;effet des changements qui peuvent être observées histologiquement. Un inconvénient possible de tous les examens stéréologiques est la subjectivité des enquêteurs. À cette fin, en utilisant deux examinateurs indépendants qui analysent tous les échantillons indépendamment peut aider à éviter ce problème. Alors que le protocole décrit ici donne un aperçu de la façon dont beaucoup de sang peut atteindre l&#39;interface foeto-maternelle, il peut être avantageux de combiner avec le complementary approche de l&#39;évaluation de la quantité totale de sang à un moment donné dans le système vasculaire à travers le plastique jette 16. La force de ce protocole est qu&#39;il combine deux approches indépendantes. Changement vasculaire est d&#39;abord évaluée quantitativement par stéréologie et le résultat est ensuite validée qualitativement par immunohistochimie. La fiabilité des résultats peut être encore renforcée par randomisation des échantillons. Les échantillons préparés pour ce protocole peuvent facilement être utilisés pour étudier aussi d&#39;autres paramètres de la grossesse tels que décidualisation, le développement de l&#39;agrégat lymphoïde mesometrial de la grossesse (MLAP) ou immunodétection de cellules d&#39;intérêt, à évaluer rigoureusement un phénotype de grossesse au milieu de la gestation. Remodelage artériel est une étape cruciale pour les grossesses sans complications chez les femmes et l&#39;échec de ces changements sous-tend les grands syndromes obstétricales (GOS), à savoir la pré-éclampsie, retard de croissance fœtale etmortinaissance. Nous présentons ici des techniques pour évaluer soigneusement un phénotype de grossesse dans des modèles de souris qui imitent certaines caractéristiques de la physiopathologie du SMO.

L&#39;échange de nutriments, les gaz et les déchets produits pendant la gestation eutherian est médiée par le placenta. Dans le tractus génital féminin, les artères utérines sont les principaux conduits de sang à l&#39;utérus. Après l&#39;implantation, ces navires spécialisés dans la branche appelé artères spiralées que la bobine à travers les caduque basale vers l&#39;unité foeto-placentaire. Le diamètre et l&#39;élasticité de ces artères spiralées, qui sont entourés par les leucocytes, en particulier des cellules tueuses naturelles utérin (unk), dictent volume et la vitesse de sang disponible pour le placenta 1,2. Les changements hémodynamiques correctes, à la suite de remodelage des artères spiralées sont essentiels pour le succès de la grossesse. Bien que les mécanismes sous-jacents diffèrent dans le détail entre l&#39;humain et murin grossesse, le résultat final du processus de remodelage chez les deux espèces est dilaté, le système vasculaire de conductance élevée qui perd sa couche de muscle lisse. Chez la souris, UNK interféron dérivé des cellules (SIN-) γ est nécessaire pour induire ces changements à la mi-gestation 3-5. Les souris qui manquent soit des cellules ou des composants de la voie de signalisation de l&#39;IFN-γ NK ne parviennent pas à subir ces changements, ce qui est associé à une réduction de 6,7 de croissance fœtale, soulignant l&#39;importance d&#39;un approvisionnement en sang adéquat pour l&#39;unité foeto-placentaire. Au début de la grossesse humaine, l&#39;invasion interstitielle et endovasculaire des trophoblaste extravilleux et leur interaction avec les cellules UNK sont importants pour induire des changements vasculaires et la promotion de 8-10 de la croissance du fœtus. UNK cellules peuvent orchestrer l&#39;invasion du trophoblaste humain par des chimiokines et de cytokines 11 telles que granulocytes et de macrophages - facteur stimulant les colonies (GM-CSF) 12. L&#39;invasion du trophoblaste faible est associé à remodelage artériel et complications de la grossesse réduits tels que la pré-éclampsie 9. Ce protocole est basé sur le travail de pionnier de Anne Croy qui a décrit l&#39;importanterôle du système immunitaire et l&#39;IFN-γ particulièrement NK-dérivée pour le remodelage vasculaire succès grâce à l&#39;immunohistochimie et de transfert élégante expériences 5,13. Nous décrivons ici un moyen rapide et économique pour évaluer l&#39;état de remodelage des artères spiralées. Bien que notre laboratoire évalue régulièrement ce à mi-gestation (jour de gestation (gd) 9.5) 14, le processus de remodelage a lieu entre gd8.5 15 et 12,5. L&#39;avènement des scanners de diaporamas automatiques a grandement facilité l&#39;évaluation des zones de vaisseaux et de lumières de sections et nous avons trouvé que cela soit une approche plus reproductible que la mesure de diamètre des vaisseaux. L&#39;addition de la détection immunohistochimique de SMA permet une simple validation des résultats obtenus à partir de l&#39;évaluation stéréologique. Comme avec toutes les techniques stéréologiques, il est recommandé d&#39;effectuer l&#39;évaluation comme une expérience aveuglé par au moins deux examinateurs. À cette fin, une étape de randomisation peut être introduite lorsque couper en sérieTing les échantillons de sorte que les enquêteurs évaluent les diapositives ne savent pas de quel groupe expérimental les échantillons proviennent. L&#39;objectif global de ce protocole est de fournir un outil fiable d&#39;évaluer soigneusement le remodelage des artères spiralées chez la souris avec les génotypes maternels et paternels définies, dans le contexte de modèles de souris pour des complications liées à la grossesse. Les résultats soulignent la dépendance sur les cellules UNK de ce processus, qui est essentielle pour la croissance normale du fœtus.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="704">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:212px;">C57BL/6 mice (8-12 weeks old)</td>
			<td style="width:99px;">Charles River</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:283px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Dental floss</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Polystyrene</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td>Used for holding tissue in place</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Straight dissection scissors</td>
			<td style="width:99px;">EMS</td>
			<td style="width:111px;">72940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">25G needles</td>
			<td style="width:99px;">BD&#160;</td>
			<td style="width:111px;">300600</td>
			<td>Used for holding tissue in place</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">50 ml conical tubes</td>
			<td style="width:99px;">Falcon</td>
			<td style="width:111px;">352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:212px;">Formalin solution, neutral buffered, 10%</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">HT501128-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Phosphate buffered saline</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">P3813-10PAK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Ethanol</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">32221-2.5L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Paraffin</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">327204-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:212px;">Xylene</td>
			<td style="width:99px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:111px;">X/0250/17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Automated tissue processor</td>
			<td style="width:99px;">Sakura</td>
			<td style="width:111px;">6032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Microtome</td>
			<td style="width:99px;">Leica</td>
			<td style="width:111px;">RM2245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Slide rack</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">Z710989</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Coplin jar</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">S5891</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Purified water</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:212px;">Hematoxylin solution, Gill No. 3</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">GHS332-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:212px;">Eosin Y solution</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">HT110116-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Fume hood</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Xylene-based mounting media</td>
			<td style="width:99px;">VWR</td>
			<td style="width:111px;">361254D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Slide scanner</td>
			<td style="width:99px;">Hamamatsu</td>
			<td style="width:111px;">NanoZoomer</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Slide scanner software</td>
			<td style="width:99px;">Hamamatsu</td>
			<td style="width:111px;">NDP viewer</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:212px;">Sodium citrate tribasic dihydrate</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">32320</td>
			<td>Make 10 mM solution and adjust pH to 6</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Pressure cooker</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td>Used for antigen retrieval</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Heating plate</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td>Used for antigen retrieval</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Hydrophobic barrier pen</td>
			<td style="width:99px;">Vector</td>
			<td style="width:111px;">H-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:212px;">Hydrogen peroxide</td>
			<td style="width:99px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:111px;">H/1800/15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Tris buffered saline</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">T6664-10PAK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Mouse on mouse kit</td>
			<td style="width:99px;">Vector</td>
			<td style="width:111px;">BMK-2202</td>
			<td>Significantly reduces background</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:212px;">Mouse anti-human smooth muscle actin</td>
			<td style="width:99px;">DAKO</td>
			<td style="width:111px;">M0851</td>
			<td>Cross-reacts with mouse</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">IgG2a isotype control</td>
			<td style="width:99px;">DAKO</td>
			<td style="width:111px;">X0943</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Humidified chamber</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">H6644</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:212px;">3,3&#8217;-Diaminobenzidine solution</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">D4293-5SET</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:212px;">Hydrochloric acid</td>
			<td style="width:99px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:111px;">H/1050/PB17</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of maternal vascular remodeling during pregnancy in the mouse uterus

The placenta mediates the exchange of factors such as gases and nutrients between mother and fetus and has specific demands for supply of blood from the maternal circulation. The maternal uterine vasculature needs to adapt to this temporary demand and the success of this arterial remodeling process has implications for fetal growth. Cells of the maternal immune system, especially natural killer (NK) cells, play a critical role in this process. Here we describe a method to assess the degree of remodeling of maternal spiral arteries during mouse pregnancy. Hematoxylin and eosin-stained tissue sections are scanned and the size of the vessels analysed. As a complementary validation method, we also present a qualitative assessment for the success of the remodeling process by immunohistochemical detection of smooth muscle actin (SMA), which normally disappears from within the arterial vascular media at mid-gestation. Together, these methods enable determination of an important parameter of the pregnancy phenotype. These results can be combined with other endpoints of mouse pregnancy to provide insight into the mechanisms underlying pregnancy-related complications.

Rag2 - / - IL2RG - / - souris manquent tous les lymphocytes matures, y compris les cellules NK 17, et leurs artères utérines ne parviennent pas à subir les changements vasculaires observés dans congénique type sauvage C57BL / 6 (WT) les souris autour de la mi-gestation 5,14. A la suite de cette réduction de remodelage Rag2 - / - IL2RG - / - souris montrent nettement plus petites zones de surface luminale des vaisseaux, indiquant globalement plus petites qui peuvent être visualisés sur des coupes H &amp; E-colorées et quantifiées stereologically (figure 2). En outre, l&#39;épaisseur de paroi relative (taux de vaisseau à lumière) est plus élevé dans les artères spiralées chez ces souris, ce qui suggère réduit approvisionnement en sang et la vitesse du sang ultérieure. Cette évaluation quantitative a été confirmée en utilisant la détection immunohistochimique de SMA. Il est caractéristique pour les souris WT le plus à perdre de la SMA dans les médias vasculairedes artères spiralées par mi-gestation. Si ce processus conduit de cellules NK-n&#39;a pas lieu, SMA reste dans les médias des vaisseaux et peut être facilement détectée par immunohistochimie comme des anneaux autour des vaisseaux sanguins (Figure 3). <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/53534/53534fig1.jpg" /> Figure 1: l&#39;utérus de la souris au gd9.5, aperçu schématique Dessin montrant les positions relatives des cornes utérines, col (bleu) et les principales artères utérines (rouge).. Indiquées sont l&#39;axe long des cornes utérines (flèches) et les points de ligature (flèches pointillées). Les sections pour l&#39;immunohistochimie sont coupés le long du plan de vue. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/53534/53534fig2.jpg" /> Figure 2:. Évaluation stéréologique de remodelage artériel à mi-gestation (A) Exemple assessment luminale et les superficies totales des navires sur les sections H &amp; E colorées des femelles WT dans le centre de 2/4 des caduque basale (délimitée par la noire verticale lignes pointillées) au gd9.5. Dans les navires à plus fort grossissement, la ligne pointillée rouge délimite la zone de navires total, jaune pointillés délimite la zone de lumière. Bar = 500 um (à gauche), 50 pm (à droite). Le grand axe de l&#39;utérus est une ligne horizontale dans cette orientation. (B) Quantification des zones luminal (panneau de gauche) et le ratio de la zone luminale à la superficie totale de la cuve (panneau de droite) de WT (C57BL / 6) et Rag2 - / - IL2RG - / - la souris (sur des souris C57BL / 6 de fond). Chaque point de données représente la moyenne de 15 mesures (5 mesures par section, 3 sections par site d&#39;implantation). Bars représentent la moyenne de n = 11-13 sites d&#39;implantation de 4 grossesses par groupe; p-valeur à partir d&#39;un, non apparié test de Mann-Whitney bilatéral. WT: type sauvage. <img alt = &quot;Figure 3&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 53534 / 53534fig3.jpg&quot; /&gt; Figure 3:. La détection immunohistochimique de l&#39;actine musculaire lisse dans les caduque basale Représentant SMA coloration sur WT (en haut) et Rag2 - / - IL2RG - / - souris (sur C57BL / 6 fond, bas) à gd9.5. Bar = 100 um. WT: type sauvage.

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Assessment of Maternal Vascular Remodeling During Pregnancy in the Mouse Uterus

This protocol describes a technique to assess changes in the maternal vasculature during pregnancy in mice. Using stereological methods, remodeling of the decidual spiral arteries is assessed quantitatively and the results confirmed qualitatively using immunohistochemistry.

Évaluation de la maternelle remodelage vasculaire pendant la grossesse dans l&#39;utérus de la souris

The placenta mediates the exchange of factors such as gases and nutrients between mother and fetus and has specific demands for supply of blood from the ...

assessment-maternal-vascular-remodeling-during-pregnancy-mouse

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

13.0K vues.  University of Cambridge. This protocol describes a technique to assess changes in the maternal vasculature during pregnancy in mice. Using stereological methods, remodeling of the decidual spiral arteries is assessed quantitatively and the results confirmed qualitatively using immunohistochemistry. 

Vidéo: Assessment of Maternal Vascular Remodeling During Pregnancy in the Mouse Uterus

Visualizing the Interrenal Steroidogenic Tissue and Its Vascular Microenvironment in Zebrafish

This protocol introduces how to detect differentiated interrenal steroidogenic cells through a simple whole-mount enzymatic activity assay. Identifying differentiated steroidogenic tissues through chromogenic histochemical staining of 3-&#946;-Hydroxysteroid dehydrogenase /&#916;5-4 isomerase (3&#946;-Hsd) activity-positive cells is critical for monitoring the morphology and differentiation of adrenocortical and interrenal tissues in mammals and teleosts, respectively. In the zebrafish model, the optical transparency and tissue permeability of the developing embryos and larvae allow for whole-mount staining of 3&#946;-Hsd activity. This staining protocol, as performed on transgenic fluorescent reporter lines marking the developing pronephric and endothelial cells, enables the detection of the steroidogenic interrenal tissue in addition to the kidney and neighboring vasculature. In combination with vibratome sectioning, immunohistochemistry, and confocal microscopy, we can visualize and assay the vascular microenvironment of interrenal steroidogenic tissues. The 3&#946;-Hsd activity assay is essential for studying the cell biology of the zebrafish interrenal gland because to date, no suitable antibody is available for labeling zebrafish steroidogenic cells. Furthermore, this assay is rapid and simple, thus providing a powerful tool for mutant screens targeting adrenal (interrenal) genetic disorders as well as for determining disruption effects of chemicals on steroidogenesis in pharmaceutical or toxicological studies.

The interrenal gland in zebrafish is the teleostean counterpart of the mammalian adrenal gland. This protocol introduces how to perform the 3-&#946;-hydroxysteroid dehydrogenase (&#916;5-4 isomerase; 3&#946;-Hsd) enzymatic activity assay, which detects differentiated steroidogenic cells in the developing zebrafish.

Visualiser le tissu interrénal stéroïdogénique et son vasculaire Microenvironnement dans Zebrafish

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Biologie du développement

Functional Manipulation of Maternal Gene Products Using In Vitro Oocyte Maturation in Zebrafish

Cellular events that take place during the earliest stages of animal embryonic development are driven by maternally derived gene products deposited into the developing oocyte. Because these events rely on maternal products which typically act very soon after fertilization-that preexist inside the egg, standard approaches for expression and functional reduction involving the injection of reagents into the fertilized egg are typically ineffective. Instead, such manipulations must be performed during oogenesis, prior to or during the accumulation of maternal products. This article describes in detail a protocol for the in vitro maturation of immature zebrafish oocytes and their subsequent in vitro fertilization, yielding viable embryos that survive to adulthood. This method allows the functional manipulation of maternal products during oogenesis, such as the expression of products for phenotypic rescue and tagged construct visualization, as well as the reduction of gene function through reverse-genetics agents.

Functional Manipulation of Maternal Gene Products Using In Vitro Oocyte Maturation in Zebrafish

An optimized protocol for the in vitro maturation of zebrafish oocytes used for the manipulation of maternal gene products is presented here.

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Analysis of Retinoic Acid-induced Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Two and Three-dimensional Embryoid Bodies

Mouse embryonic stem cells (ESCs) isolated from the inner mass of the blastocyst (typically at day E3.5), can be used as in vitro model system for studying early embryonic development. In the absence of leukemia inhibitory factor (LIF), ESCs differentiate by default into neural precursor cells. They can be amassed into a three dimensional (3D) spherical aggregate termed embryoid body (EB) due to its similarity to the early stage embryo. EBs can be seeded on fibronectin-coated coverslips, where they expand by growing two dimensional (2D) extensions, or implanted in 3D collagen matrices where they continue growing as spheroids, and differentiate into the three germ layers: endodermal, mesodermal, and ectodermal. The 3D collagen culture mimics the in vivo environment more closely than the 2D EBs. The 2D EB culture facilitates analysis by immunofluorescence and immunoblotting to track differentiation. We have developed a two-step neural differentiation protocol. In the first step, EBs are generated by the hanging-drop technique, and, simultaneously, are induced to differentiate by exposure to retinoic acid (RA). In the second step, neural differentiation proceeds in a 2D or 3D format in the absence of RA.

We describe a technique for using murine embryonic stem cells for generating two or three dimensional embryoid bodies. We then explain how to induce neural differentiation of the embryoid body cells by retinoic acid, and how to analyze their state of differentiation by progenitor cell marker immunofluorescence and immunoblotting.

L&#39;analyse des rétinoïque induite par l&#39;acide Neuro-Différenciation de cellules souches embryonnaires de souris en deux et trois dimensions corps embryoïdes

Mouse embryonic stem cells (ESCs) isolated from the inner mass of the blastocyst (typically at day E3.5), can be used as in vitro model system for ...

A Novel Mammary Fat Pad Transplantation Technique to Visualize the Vessel Generation of Vascular Endothelial Stem Cells

Endothelial cells (ECs) are the fundamental building blocks of the vascular architecture and mediate vascular growth and remodeling to ensure proper vessel development and homeostasis. However, studies on endothelial lineage hierarchy remain elusive due to the lack of tools to gain access as well as to directly evaluate their behavior in vivo. To address this shortcoming, a new tissue model to study angiogenesis using the mammary fat pad has been developed. The mammary gland develops mostly in the postnatal stages, including puberty and pregnancy, during which robust epithelium proliferation is accompanied by extensive vascular remodeling. Mammary fat pads provide space, matrix, and rich angiogenic stimuli from the growing mammary epithelium. Furthermore, mammary fat pads are located outside the peritoneal cavity, making them an easily accessible grafting site for assessing the angiogenic potential of exogenous cells. This work also describes an efficient tracing approach using fluorescent reporter mice to specifically label the targeted population of vascular endothelial stem cells (VESCs) in vivo. This lineage tracing method, coupled with subsequent tissue whole-mount microscopy, enable the direct visualization of targeted cells and their descendants, through which the proliferation capability can be quantified and the differentiation commitment can be fate-mapped. Using these methods, a population of bipotent protein C receptor (Procr) expressing VESCs has recently been identified in multiple vascular systems. Procr+ VESCs, giving rise to both new ECs and pericytes, actively contribute to angiogenesis during development, homeostasis, and injury repair. Overall, this manuscript describes a new mammary fat pad transplantation and in vivo lineage tracing techniques that can be used to evaluate the stem cell properties of VESCs.

This work demonstrates a novel approach to assess the proliferation, differentiation, and vessel-forming potential of vascular endothelial stem cells (VESCs) through mammary fat pad transplantation followed by whole-mount tissue preparation for microscopic observation. A lineage tracing strategy to investigate the behavior of VESCs in vivo is also presented.

Une nouvelle technique de transplantation de graisse mammaire mammaire pour visualiser la génération de vaisseaux de cellules souches endothéliales vasculaires

Endothelial cells (ECs) are the fundamental building blocks of the vascular architecture and mediate vascular growth and remodeling to ensure proper ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to cleft secondary palate, a common congenital anomaly in humans. Secondary palate fusion has been extensively studied leading to several proposed cellular mechanisms that may mediate this process. However, these studies have been mostly performed on fixed embryonic tissues at progressive timepoints during development or in fixed explant cultures analyzed at static timepoints. Static analysis is limited for the analysis of dynamic morphogenetic processes such a palate fusion and what types of dynamic cellular behaviors mediate palatal fusion is incompletely understood. Here we describe a protocol for live imaging of ex vivo secondary palate fusion in mouse embryos. To examine cellular behaviors of palate fusion, epithelial-specific Keratin14-cre was used to label palate epithelial cells in ROSA26-mTmGflox reporter embryos. To visualize filamentous actin, Lifeact-mRFPruby reporter mice were used. Live imaging of secondary palate fusion was performed by dissecting recently-adhered secondary palatal shelves of embryonic day (E) 14.5 stage embryos and culturing in agarose-containing media on a glass bottom dish to enable imaging with an inverted confocal microscope. Using this method, we have detected a variety of novel cellular behaviors during secondary palate fusion. An appreciation of how distinct cell behaviors are coordinated in space and time greatly contributes to our understanding of this dynamic morphogenetic process. This protocol can be applied to mutant mouse lines, or cultures treated with pharmacological inhibitors to further advance understanding of how secondary palate fusion is controlled.

Here, we present a protocol for live imaging of mouse secondary palate fusion using confocal microscopy. This protocol can be used in combination with a variety of fluorescent reporter mouse lines, and with pathway inhibitors for mechanistic insight. This protocol can be adapted for live imaging in other developmental systems.

Imagerie en direct de la souris Fusion de palais secondaire

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

A Novel Use of Three-dimensional High-frequency Ultrasonography for Early Pregnancy Characterization in the Mouse

High-frequency ultrasonography (HFUS) is a common method to non-invasively monitor the real-time development of the human fetus in utero. The mouse is routinely used as an in vivo model to study embryo implantation and pregnancy progression. Unfortunately, such murine studies require pregnancy interruption to enable follow-up phenotypic analysis. To address this issue, we used three-dimensional (3-D) reconstruction of HFUS imaging data for early detection and characterization of murine embryo implantation sites and their individual developmental progression in utero. Combining HFUS imaging with 3-D reconstruction and modeling, we were able to accurately quantify embryo implantation site number as well as monitor developmental progression in pregnant C57BL6J/129S mice from 5.5 days post coitus (d.p.c.) through to 9.5 d.p.c. with the use of a transducer. Measurements included: number, location, and volume of implantation sites as well as inter-implantation site spacing; embryo viability was assessed by cardiac activity monitoring. In the immediate post-implantation period (5.5 to 8.5 d.p.c.), 3-D reconstruction of the gravid uterus in both mesh and solid overlay format enabled visual representation of the developing pregnancies within each uterine horn. As genetically engineered mice continue to be used to characterize female reproductive phenotypes derived from uterine dysfunction, this method offers a new approach to detect, quantify, and characterize early implantation events in vivo. This novel use of 3-D HFUS imaging demonstrates the ability to successfully detect, visualize, and characterize embryo-implantation sites during early murine pregnancy in a non-invasive manner. The technology offers a significant improvement over current methods, which rely on the interruption of pregnancies for gross tissue and histopathologic characterization. Here we use a video and text format to describe how to successfully perform ultrasounds of early murine pregnancy to generate reliable and reproducible data with reconstruction of the uterine form in mesh and solid 3-D images.

Mice are widely used to study gestational biology. However, pregnancy termination is required for such studies which precludes longitudinal investigations and necessitates the use of large numbers of animals. Therefore, we describe a non-invasive technique of high-frequency ultrasonography for early detection and monitoring of post-implantation events in the pregnant mouse.

Une nouvelle utilisation d’échographie en trois dimensions de haute fréquence pour la caractérisation de grossesse précoce chez la souris

High-frequency ultrasonography (HFUS) is a common method to non-invasively monitor the real-time development of the human fetus in utero. The mouse is ...

Ovarian Tissue Culture to Visualize Phenomena in Mouse Ovary

Mammalian females periodically ovulate an almost constant number of oocytes during each estrus cycle. To sustain such regularity and periodicity, regulation occurs at the hypothalamic-pituitary-gonadal axis level and on developing follicles in the ovary. Despite active studies, follicle development mechanisms are not clear because of the several steps involved from the dormant primordial follicle activation to ovulation, and because of the regulation complexity that differs at each follicular stage. To investigate the mechanisms of follicle development, and the dynamics of follicles throughout the estrus cycle, we developed a mouse ovarian tissue culture model that can be used to observe follicle development using a microscope. Systematic follicle development, periodical ovulation, and follicle atresia can all be reproduced in the cultured ovary model, and the culture conditions can be experimentally modulated. Here, we demonstrate the usefulness of this method in the study of the regulatory mechanisms of follicle development and other ovarian phenomena.

Ovarian tissue cultures can be used as models of follicle development, ovulation, and follicle atresia and indicate regulatory mechanisms of dynamic ovarian processes.

Culture de tissus ovariens pour visualiser les phénomènes dans les ovaires de souris

Mammalian females periodically ovulate an almost constant number of oocytes during each estrus cycle. To sustain such regularity and periodicity, ...

Assessment of Ultrastructural Neuroplasticity Parameters After In Utero Transduction of the Developing Mouse Brain and Spinal Cord

The present study combines in utero transduction with transmission electron microscopy (TEM) aiming at a precise morphometrical analysis of ultrastructural parameters in unambiguously identified topographical structures, affected by a protein of interest that is introduced into the organism via viral transfer. This combined approach allows for a smooth transition from macrostructural to ultrastructural identification by following topographical navigation maps in a tissue atlas. High-resolution electron microscopy of the in-utero-transduced tissue reveals the fine ultrastructure of the neuropil and its plasticity parameters, such as cross-sectioned synaptic bouton areas, the number of synaptic vesicles and mitochondria within a bouton profile, the length of synaptic contacts, cross-sectioned axonal areas, the thickness of myelin sheaths, the number of myelin lamellae, and cross-sectioned areas of mitochondria profiles. The analysis of these parameters reveals essential insights into changes of ultrastructural plasticity in the areas of the nervous system that are affected by the viral transfer of the genetic construct. This combined method can not only be used for studying the direct effect of genetically engineered biomolecules and/or drugs on neuronal plasticity but also opens the possibility to study the in utero rescue of neuronal plasticity (e.g., in the context of neurodegenerative diseases).

The combination of transmission electron microscopy and in utero transduction is a powerful approach for studying morphological changes in the fine ultrastructure of the nervous system during development. This combined method allows deep insights into changes in structural details underlying neuroplasticity with respect to their topographical representation.

Évaluation des paramètres de la neuroplasticité ultrastructurales après In Utero Transduction du cerveau de souris et la moelle épinière en développement

The present study combines in utero transduction with transmission electron microscopy (TEM) aiming at a precise morphometrical analysis of ...

Vascular Casting of Adult and Early Postnatal Mouse Lungs for Micro-CT Imaging

Blood vessels form intricate networks in 3-dimensional space. Consequently, it is difficult to visually appreciate how vascular networks interact and behave by observing the surface of a tissue. This method provides a means to visualize the complex 3-dimensional vascular architecture of the lung.
To accomplish this, a catheter is inserted into the pulmonary artery and the vasculature is simultaneously flushed of blood and chemically dilated to limit resistance. Lungs are then inflated through the trachea at a standard pressure and the polymer compound is infused into the vascular bed at a standard flow rate. Once the entire arterial network is filled and allowed to cure, the lung vasculature may be visualized directly or imaged on a micro-CT (&#181;CT) scanner.
When performed successfully, one can appreciate the pulmonary arterial network in mice ranging from early postnatal ages to adults. Additionally, while demonstrated in the pulmonary arterial bed, this method can be applied to any vascular bed with optimized catheter placement and endpoints.

The aim of this technique is ex vivo visualization of pulmonary arterial networks of early postnatal and adult mice through lung inflation and injection of a radio-opaque polymer-based compound via the pulmonary artery. Potential applications for casted tissues are also discussed.

Moulage vasculaire des poumons de souris postnatales adultes et précoces pour l’imagerie micro-CT

Blood vessels form intricate networks in 3-dimensional space. Consequently, it is difficult to visually appreciate how vascular networks interact and ...

Defining the Program of Maternal mRNA Translation during In vitro Maturation using a Single Oocyte Reporter Assay

Events associated with oocyte nuclear maturation have been well described. However, much less is known about the molecular pathways and processes that take place in the cytoplasm in preparation for fertilization and acquisition of totipotency. During oocyte maturation, changes in gene expression depend exclusively on the translation and degradation of maternal messenger RNAs (mRNAs) rather than on transcription. Execution of the translational program, therefore, plays a key role in establishing oocyte developmental competence to sustain embryo development. This paper is part of a focus on defining the program of maternal mRNA translation that takes place during meiotic maturation and at the oocyte-to-zygote transition. In this method paper, a strategy is presented to study the regulation of translation of target mRNAs during in vitro oocyte maturation. Here, a Ypet reporter is fused to the 3&#39; untranslated region (UTR) of the gene of interest and then micro-injected into oocytes together with polyadenylated mRNA encoding for mCherry to control for injected volume. By using time-lapse microscopy to measure reporter accumulation, translation rates are calculated at different transitions during oocyte meiotic maturation. Here, the protocols for oocyte isolation and injection, time-lapse recording, and data analysis have been described, using the Ypet/interleukin-7 (IL-7)-3&#39; UTR reporter as an example.

This protocol describes a reporter assay to study the regulation of mRNA translation in single oocytes during in vitro maturation.

Définition du programme de traduction de l’ARNm maternel au cours de la maturation in vitro à l’aide d’un test de rapporteur d’ovocytes unique

Events associated with oocyte nuclear maturation have been well described. However, much less is known about the molecular pathways and processes that ...