The authors would like to thank all members of the Colucci lab for helpful discussions. This work was funded by The Wellcome Trust [094073/Z/10/Z], The Centre for Trophoblast Research and The British Heart Foundation.

כל הנהלים דנו בכתב יד זה הם בהתאם לתקנות משרד פנים בבריטניה ומאושרות על ידי לוח הסקירה אתית קיימברידג &#39;. 1. דגימה אוסף <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת הזדווגויות מתוזמן באמצעות C57BL / 6 נקבות עכברים ישנים 8-12 שבוע עם זכרים בוגרים (עד 2 נקבות לזכרים) בשעתי אחר הצהריים. לבדוק את קיומו של תקעי נרתיק כסימן להזדווגות מוקדם בבוקר בימים הבאים. הנוכחות של תקע בgd0.5 סימני בוקר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על gd9.5, להרדימו נקע בצוואר רחם ולפתוח את חלל הבטן. הערה המתת חסד שעל ידי CO 2 עלולים לגרום vasodilatation. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בחוט דנטלי ולקשור בעדינות את עורקי רחם (איור 1, חצים מקווקוים). לקשור את החוט סביב העורקים בקצה של כל קרן רחם, הפרוקסימלי לשחלות, כמו גם סביב צוואר הרחם. הערה: אל להיקרע כלי מכיוון שהדבר עלול לגרום לעורקים התמוטטו. </li> &lt;li&gt; לנתח את הרחם במהירות באמצעות מספריים לנתיחה, מוציא את כל הרחם distally לשלוש נקודות קשירה בקצה קרן הרחם וצוואר הרחם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הרחם על פיסת קלקר מוכנה כך ששני הקרניים מיושרות לאורך אותו הציר הארוך בכיוונים מנוגדים מצוואר הרחם. בעדינות למתוח אותו ולהצמיד למקום באמצעות 2-3 25 מחטי G. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטבול את הקלקר לתוך צינור חרוטי 50 מיליליטר מוכן. ראש הדף עד 50 מיליליטר עם פורמלין 10%. תקן עבור 5-6 שעות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחק את פתרון פורמלין ולהחליף עם 50 1x מלוח מיליליטר פוספט (PBS) במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בלו שתי קרנות רחם proximally לנקודת קשירה בכל קצה וproximally לצוואר הרחם במרכז, לקצץ משם כל שומן עודף סביב אתרי ההשתלה ולשטוף פעמים PBS במשך 5 דקות כדי להסיר עקבות של פורמלין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסן את הדגימות באתנול 70% ב 4 ° C. (לתקופה של עד שבועיים) עד לעיבוד. זהירות: Ethanol הוא דליק מאוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במערכת עיבוד אוטומטית באמצעות הפרמטרים שצוינו בטבלה 1. שבץ הקרניים בנפרד בפרפין, כך שהם יכולים לחתוך לאורך המישור ניצבת לציר של הרחם הארוך. הדבר מבטיח כי השטח המרבי של כל אתר השתלה יהיה חשוף לניתוח באמצע הבלוק (איור 2 א). אופציונאלי: זוהי נקודת זמן נוחה לאקראית של בלוקים אם תרצה בכך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות microtome, לחתוך קטעים סידוריים של 7 עובי מיקרומטר מהלוקים. כתם סעיף אחד בכל מרווח 49 מיקרומטר עם hematoxylin ו eosin (H &amp; E, ראה סעיף 2.1). אחסן את החלקים שנותרו בטמפרטורת חדר למשך צביעת SMA ויישומים במורד הזרם אחרים. </li></ol><table fo:keep-together.within-page="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:99px;"> פִּתָרוֹן </td><td style="width:43px;"> זְמַן<html></td><td style="width:97px;"> טֶמפֶּרָטוּרָה </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> אתנול 70% </td><td> שעה 1 </td><td> 40 מעלות צלזיוס </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> אתנול 100% </td><td> שעה 1 </td><td> 40 מעלות צלזיוס </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> אתנול 100% </td><td> שעה 1 </td><td> 40 מעלות צלזיוס </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> אתנול 100% </td><td> שעה 1 </td><td> 40 מעלות צלזיוס </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> אתנול 100% </td><td> שעה 1 </td><td> 40 מעלות צלזיוס </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> אתנול 100% </td><td> שעה 1 </td><td> 40 מעלות צלזיוס </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> אתנול 100% </td><td> שעה 1 </td><td> 40 מעלות צלזיוס </td></tr><tr height="21">21px; &quot;&gt; קסילן: </td><td> שעה 1 </td><td> 40 מעלות צלזיוס </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> קסילן </td><td> שעה 1 </td><td> 40 מעלות צלזיוס </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> קסילן </td><td> שעה 1 </td><td> 40 מעלות צלזיוס </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> פָּרָפִין </td><td> שעה 1 </td><td> 63 מעלות צלזיוס </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> פָּרָפִין </td><td> שעה 1 </td><td> 63 מעלות צלזיוס </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> פָּרָפִין </td><td> שעה 1 </td><td> 63 מעלות צלזיוס </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;"> פָּרָפִין </td><td> שעה 1 </td><td> 63 מעלות צלזיוס </td></tr></tbody></table> טבלת 1:. הגדרות עבור עיבוד רקמות אוטומטי סקירה כללית של ההגדרה המשמשת לעיבוד של רקמת רחם 2. Sterהערכת eological <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> H &amp; E מכתים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סעיפי Deparaffinize ידי טבילת שקופיות רכובים במעמד שקופית לתוך אמבטיה קסילן 100% במשך 10 דקות בטמפרטורת חדר. זהירות: קסילן הוא דליק ומסרטן חשד שהוא רעיל באמצעות מגע ושאיפה. עבודה זו חייבת להתנהל במנדף, תוך שימוש בציוד מגן אישי (PPE). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטבול את השקופיות באמבטיה המכילות קסילן הנקי לעוד 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רצף לטבול שקופיות באמבטיות המכילות 100% אתנול, 95% אתנול, 70% אתנול ומים מטוהרים במשך 5 דקות כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטבול את השקופיות בפתרון של 50% 3 hematoxylin גיל לא, מדולל במים מטוהרים, במשך 5 דקות. זהירות: Hematoxylin מזיק על ידי בליעה ומגע לעיניים. ללבוש PPE המתאים בעת טיפול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף שקופיות בשוקת צביעה תחת זרם מים ברז במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטבול את השקופיות בפתרון 1% חומצה / אלכוהול (1% חומצה הידרוכלורית 10 M באתנול 70%) למשך 10 שניותולשטוף בשוקת צביעה תחת זרם מים ברז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטבול את השקופיות בפתרון eosin למשך 30 שניות ולשטוף בשוקת צביעה תחת זרם מים ברז במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתוך מנדף, ברצף לטבול שקופיות באמבטיות המכילות 70% אתנול, 95% אתנול ו 100% אתנול במשך 5 דקות כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטבול את השקופיות באמבטיה המכילה קסילן במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר coverslips באמצעות הרכבה בינונית מבוסס קסילן. ייבש אופקי וביסודיות במנדף לפני לדמיין את השקופיות תחת מיקרוסקופ. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הערכת Stereological של גודל כלי שיט וסטטוס שיפוץ <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור כל אתר השתלה, לקבוע אילו חלקים קרובים לנקודת midsagittal. הקובץ המצורף chorioallantoic בין השליה לעובר ופיתוח משמש כמדד טוב לנקודת midsagittal. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר 3 חלקים ב 49 מיקרומטר במרווחים קרובים לנקודת midsagittal לניתוח. סריקת שקופיות שנבחרו. על מנת להימנע מIncורידי luding, אשר הוכחו להיות ממוקמים יותר שולי באתרי ההשתלה 16, להגביל את הניתוח על 2/4 של כל אתר השתלה (איור 2 א) המרכזי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להעריך גודל לומן, לצייר סביב החלק הפנימי של כלי הדם ולהקליט את השטח של צורה זו. לסך גודל הכלי, לצייר סביב הקיר החיצוני של כלי השיט, כולל תאי אנדותל, pericytes ולויקוציטים ביצוע עצמי. הערה: היחס בין סך גודל כלי ללומן הוא מדד למצב שיפוץ של ספינה. ככלי סליל באמצעות המטוס שהסעיף היה לחתוך לאורך, ייתכנו חתכים מרובים של אותו העורק בשקופית אחת. הימנע מדידה אותו העורק מספר פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רשום את המדידות מ 5 כלים בכל אתר השתלה עם לומן הגדול ועגול. למדוד כל אתר השתלה בשלושה עותקים (שלושה חלקים במרווחים 49 מיקרומטר זה מזה). הממוצע של 15 represe מדידות אלהNTS הקוטר הממוצע של כלי הגדולים ביותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להימנע מייצוג יתר של כלי גדול יותר בכמה דוגמאות, למדוד אותו המספר של כלי שיט בכל אתר השתלה. </li></ol></li></ol> 3. הערכה איכותית באמצעות אימונוהיסטוכימיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Deparaffinization וRehydration <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סעיפי Deparaffinize ידי טבילת שקופיות רכובים במעמד שקופית חסינה חומה לאמבטית קסילן 100% במשך 10 דקות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטבול את השקופיות באמבטיה המכילות קסילן הנקי לעוד 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רצף לטבול שקופיות באמבטיות המכילות 100% אתנול, 95% אתנול ו -70% ומים מטוהרים במשך 5 דקות כל אחד. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אנטיגן אחזור <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן חיץ נתרן ציטרט 10 מ&quot;מ במים מטוהרים ולהתאים לpH 6 באמצעות 10 חומצה הידרוכלורית M. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא מיכל חסין חום שיכול להכיל 600 מיליליטר עם חיץ ציטראט 400 מיליליטר נתרן ומקום בסיר לחץ מקומי המכיל ואט מספיקאה לצלול מחצית מהמכל. באופן רופף לצרף את המכסה של סיר הלחץ והחום עד רתיחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מתלה מקום שקופיות למאגר נתרן ציטרט והדוק לתקן את המכסה של סיר הלחץ. ברגע שלחץ, לאפשר לרתיחה במשך 3 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לְהַפִיג לַחַץ סיר הלחץ ולהסיר את המכל הפנימי. לאפשר שקופיות להתקרר במאגר נתרן ציטרט במשך 10 דקות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף מחליק באמבט המכיל מים מטוהרים במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקיף את החלקים באמצעות עט מחסום הידרופובי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף שקופיות על ידי השריית בPBS במשך 5 דקות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חסימת אנדוגני Peroxidase והלא ספציפי מחייב <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סעיפי דגירה עם מי חמצן 3% בדילול מלא במים מטוהרים בתא humidified למשך 30 דקות בטמפרטורת חדר. זהירות: מי חמצן הוא גירוי מאוד לעיניים, עור ועל בליעה. ללבוש PPE המתאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקש את פתרון מי חמצן עודף ולשטוף SLIdes פעמיים על ידי השריית בטריס שנאגרו מלוח (TBS) עבור 2 דקות כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סעיפי דגירה עם אימונוגלובולינים עכבר חסימה מגיב מאת העכבר על ערכת עכבר הוכן בהתאם להוראות יצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף שקופיות פעמיים ב TBS עבור 2 דקות כל אחד. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Immunodetection של אקטין שריר חלק <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון נוגדן diluent (הניתן בערכה) ודגירה עם קטעים של 5 דקות בטמפרטורת חדר, או על פי הוראות יצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל 1: שריר אקטין חלק 100 עכבר אנטי-אנושי (DAKO M0851) בפתרון diluent הנוגדן. לדלל את שליטת אלוטיפ עכבר IgG2a בפתרון diluent נוגדן, להבטיח כי ריכוז אימונוגלובולינים הסופי הוא שווה ערך בשני הפתרונות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקש את סעיפי פתרון diluent הנוגדן וכיסוי עודפים עם פתרונות בקרה או בדילול נוגדן או אלוטיפ. דגירה בתא humidified למשך 30 דקות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף שקופיות פעמיים ב TBS ל2 דקות כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל נוגדנים משני אנטי עכבר biotinylated דגירה סעיפים במשך 10 דקות בטמפרטורת חדר, או על פי הוראות יצרנים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף שקופיות אחת לעם כפות וPBS למשך 2 דקות, בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון 3,3&#39;-diaminobenzidine (DAB) על פי הוראות יצרן. לכסות חלקים עם פתרון DAB ודגירה של עד 4 דק &#39;, הבטחה לעקוב אחר חלקים, כדי למנוע התפתחות צבע עודפת. זהירות: DAB הוא דליק ומסרטן חשד שהוא רעיל באמצעות מגע ושאיפה. ללבוש PPE המתאים בעת טיפול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטבול את השקופיות במים מטוהרים, כאשר מגיעה לעצמה רצויה של צביעה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Counterstain עם 50% גיל מס &#39;3 hematoxylin במשך 20 שניות ולשטוף בשוקת צביעה תחת זרם מים ברז עד המים פועל ברורים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התייבשות והרכבה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתוך מנדף, ברצף לטבול שקופיות באמבטיות המכילות ETH 70%anol, 95% אתנול ו 100% אתנול במשך 5 דקות כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטבול את השקופיות באמבטיה המכילה קסילן במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר coverslips באמצעות הרכבה בינונית מבוסס קסילן. ייבשו אופקי וביסודיות במנדף לפני לדמיין את השקופיות תחת מיקרוסקופ </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Burton, G. J., Woods, A. W., Jauniaux, E., Kingdom, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rheological+and+physiological+consequences+of+conversion+of+the+maternal+spiral+arteries+for+uteroplacental+blood+flow+during+human+pregnancy.">Rheological and physiological consequences of conversion of the maternal spiral arteries for uteroplacental blood flow during human pregnancy.</a> Placenta. 30 (6), 473-482 (2009).</li><li>Pijnenborg, R., Vercruysse, L., Hanssens, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+uterine+spiral+arteries+in+human+pregnancy:+facts+and+controversies.">The uterine spiral arteries in human pregnancy: facts and controversies.</a> Placenta. 27 (9-10), 939-958 (2006).</li><li>Ashkar, A. A., Croy, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon-gamma+contributes+to+the+normalcy+of+murine+pregnancy.">Interferon-gamma contributes to the normalcy of murine pregnancy.</a> Biol Reprod. 61 (2), 493-502 (1999).</li><li>Ashkar, A. A., Croy, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functions+of+uterine+natural+killer+cells+are+mediated+by+interferon+gamma+production+during+murine+pregnancy.">Functions of uterine natural killer cells are mediated by interferon gamma production during murine pregnancy.</a> Semin Immunol. 13 (4), 235-241 (2001).</li><li>Ashkar, A. A., Di Santo, J. P., Croy, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon+gamma+contributes+to+initiation+of+uterine+vascular+modification,+decidual+integrity,+and+uterine+natural+killer+cell+maturation+during+normal+murine+pregnancy.">Interferon gamma contributes to initiation of uterine vascular modification, decidual integrity, and uterine natural killer cell maturation during normal murine pregnancy.</a> J Exp Med. 192 (2), 259-270 (2000).</li><li>Ashkar, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+requirements+for+IL-15+and+IFN+regulatory+factors+in+uterine+NK+cell+differentiation+and+function+during+pregnancy.">Assessment of requirements for IL-15 and IFN regulatory factors in uterine NK cell differentiation and function during pregnancy.</a> J Immunol. 171 (6), 2937-2944 (2003).</li><li>Barber, E. M., Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+uterine+NK+cell+population+requires+IL-15+but+these+cells+are+not+required+for+pregnancy+nor+the+resolution+of+a+Listeria+monocytogenes+infection.">The uterine NK cell population requires IL-15 but these cells are not required for pregnancy nor the resolution of a Listeria monocytogenes infection.</a> J Immunol. 171 (1), 37-46 (2003).</li><li>Colucci, F., Boulenouar, S., Kieckbusch, J., Moffett, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+does+variability+of+immune+system+genes+affect+placentation.">How does variability of immune system genes affect placentation.</a> Placenta. 32 (8), 539-545 (2011).</li><li>Pijnenborg, R., Vercruysse, L., Brosens, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+placentation.">Deep placentation.</a> Best Pract Res Clin Obstet Gynaecol. 25 (3), 273-285 (2011).</li><li>Colucci, F., Kieckbusch, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+uterine+natural+killer+cells+nurture+fetal+growth:+in+medio+stat+virtus.">Maternal uterine natural killer cells nurture fetal growth: in medio stat virtus.</a> Trends Mol Med. 21 (2), 60-67 (2015).</li><li>Hanna, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decidual+NK+cells+regulate+key+developmental+processes+at+the+human+fetal-maternal+interface.">Decidual NK cells regulate key developmental processes at the human fetal-maternal interface.</a> Nat Med. 12 (9), 1065-1074 (2006).</li><li>Xiong, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+uterine+NK+cell-activating+receptor+KIR2DS1+enhances+placentation.">Maternal uterine NK cell-activating receptor KIR2DS1 enhances placentation.</a> J Clin Invest. 123 (10), 4264-4272 (2013).</li><li>Croy, B. A., Zhang, J., Tayade, C., Colucci, F., Yadi, H., Yamada, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+uterine+natural+killer+cells+in+mice.">Analysis of uterine natural killer cells in mice.</a> Methods Mol Biol. 612, 465-503 (2010).</li><li>Kieckbusch, J., Gaynor, L. M., Moffett, A., Colucci, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MHC-dependent+inhibition+of+uterine+NK+cells+impedes+fetal+growth+and+decidual+vascular+remodelling.">MHC-dependent inhibition of uterine NK cells impedes fetal growth and decidual vascular remodelling.</a> Nat Commun. 5, (2014).</li><li>Zhang, J., Chen, Z., Smith, G. N., Croy, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+killer+cell-triggered+vascular+transformation:+maternal+care+before+birth.">Natural killer cell-triggered vascular transformation: maternal care before birth.</a> Cell Mol Immunol. 8 (1), 1-11 (2010).</li><li>Adamson, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+between+trophoblast+cells+and+the+maternal+and+fetal+circulation+in+the+mouse+placenta.">Interactions between trophoblast cells and the maternal and fetal circulation in the mouse placenta.</a> Dev Biol. 250 (2), 358-373 (2002).</li><li>Colucci, F., Soudais, C., Rosmaraki, E., Vanes, L., Tybulewicz, V. L. J., Di Santo, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+NK+cell+development+using+a+novel+alymphoid+mouse+model:+Investigating+the+role+of+the+c-abl+proto-oncogene+in+murine+NK+cell+differentiation.">Dissecting NK cell development using a novel alymphoid mouse model: Investigating the role of the c-abl proto-oncogene in murine NK cell differentiation.</a> J Immunol. 162 (5), 2761-2765 (1999).</li><li>Hu, D., Cross, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ablation+of+Tpbpa-positive+trophoblast+precursors+leads+to+defects+in+maternal+spiral+artery+remodeling+in+the+mouse+placenta.">Ablation of Tpbpa-positive trophoblast precursors leads to defects in maternal spiral artery remodeling in the mouse placenta.</a> Dev Biol. 358 (1), 231-239 (2011).</li><li>Zhang, J. H., Croy, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+Ultrasonography+to+Define+Fetal-Maternal+Relationships:+Moving+from+Humans+to+Mice.">Using Ultrasonography to Define Fetal-Maternal Relationships: Moving from Humans to Mice.</a> Comparative Med. 59 (6), 527-533 (2009).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

הפרוטוקול המובא כאן נועד לספק שיטה לשחזור הקשורים ליישום שינויים בכלי הדם הנדרשים להריון מוצלח. קריטי להצלחה של הערכה זו היא האיכות של חלקי רקמות. שניהם קביעה מדויקת של גיל הריון אתרי השתלה וכן באופן מהימן ligating עורקי הרחם הם צעדים חיוניים. שינויים בפרמטרים כגון זמן של קיבעון, פרוטוקול עיבוד רקמות, וכו &#39;עשויים להשפיע גם על התוצאה. להערכה stereological משוחדת, חשוב למדוד את אותו המספר של כלי שיט בכל אתר השתלה. מומלץ למדוד 5 כלי לאתר השתלה וכל אתר השתלה בשלושה עותקים. הממוצע של 15 מדידות אלה מייצג את הגודל הממוצע של 5 כלי הגדולים ביותר. בהמשך לנתונים מRag2 alymphoid - / - IL2rg - / - עכברים שמוצגים כאן, מצאנו prot זהocol שימושי עבור מספר הדגמים של תפקוד מערכת חיסון אימהי לקוי, כולל אחד מתאי NK עכבות 14. פגמים בשיפוץ עורקים גם הוכחו במודלים של פלישת trophoblast לקוי 18 והטכניקות המתוארות כאן עשויות להיות מועילות כדי להעריך את כלי הדם במקרים אלה. אנו מותאמים ומאומתים פרוטוקול זה לחקירת שיפוץ כלי דם decidual באמצע ההריון בעכבר, אבל זה גם מתקבל על הדעת להתאים פרוטוקול זה לעבוד במערכות אחרות מודל (למשל חולדות) או אפילו באיברים אחרים. בעוד אנו מוצאים כי שיפוץ NK-תלוי ניתן להעריך חסונה בgd9.5, זה יכול להיות מתוקן לנקודות זמן אחרות כגון gd12.5, כאשר כלי הדם האימהיים הוא שופץ לחלוטין. בנקודה זו בזמן, פלישת trophoblast endovascular היא עמוקה יותר 16 ונקודת זמן זו עשויה להיות מתאימה יותר לחקירות של התפקיד trophoblast לשינויים בכלי הדם. אם קריאות כמותית נוספות רצויים,חוקרים יכולים גם להגדיל את מספר הסעיפים המוכתמים עבור SMA ולהעריך את אחוז כלי שופצו באופן חלקי בכל אתר השתלה. הגבלה של פרוטוקול זה היא תיאורי הטבע של בדיקות היסטולוגית. מבחני פונקציונליים, לעומת זאת, הם רק הופכים לאט זמינים (כגון אולטרסאונד דופלר 19). טכניקות אלה דורשות מומחיות טכנית והוצאות גבוהות בהרבה לרכישה ותחזוקה של ציוד, אבל יש את היתרון של מתן אורך קריאת נתוני vivo להשפעת השינויים שניתן לצפות בהיסטולוגיה. חסרון אפשרי של כל בדיקות stereological הוא הסובייקטיביות של החוקרים. לשם כך, באמצעות שני בוחנים עצמאיים שלנתח את כל הדגימות באופן עצמאי יכול לעזור כדי למנוע בעיה זו. בעוד הפרוטוקול המתואר כאן נותן תובנה כמה דם יכול להגיע לממשק fetomaternal, זה עשוי להיות יתרון לשלב את זה עם complגישת ementary של בחינת הסכום הכולל של דם בכל זמן נתון בכלי הדם דרך הפלסטיק מטילה 16. כוחו של פרוטוקול זה הוא שהוא משלב שתי גישות עצמאיות. שינוי בכלי דם הוא ראשון להעריך כמותית ידי stereology והתוצאה מכן תוקף איכותי באמצעות אימונוהיסטוכימיה. האמינות של התוצאות ניתן לחזק עוד יותר על ידי באופן אקראי, הדגימות. הדגימות מוכנות לפרוטוקול זה יכול לשמש בקלות גם לחקור פרמטרים אחרים של הריון כגון decidualisation, פיתוח כולל הלימפה mesometrial של הריון (MLAp) או immunodetection של תאים של עניין, כדי להעריך את הפנוטיפ הריון בקפדנות בmidgestation. שיפוץ עורקים הוא שלב קריטי להריונות לא מסובכים בנשים וכישלון של שינויים אלה בבסיס התסמונות הגדולות יילוד (GOS), כלומר רעלת הריון, הגבלה בגדילת העובר ולידת עובר מת. אנו מציגים כאן טכניקות כדי להעריך פנוטיפ הריון במודלים של עכברים המחקים כמה מאפיינים של הפתופיזיולוגיה של GOS בזהירות.

חילופי חומרים מזינים, גזים וחומרי פסולת במהלך הריון eutherian מתווך על ידי השליה. במערכת הרבייה הנשית, עורקי הרחם הם הצינורות העיקריים של דם אל הרחם. לאחר השתלה, סניף אלה לתוך כלי מיוחד הנקרא עורקי ספירלה שסליל דרך basalis decidua ליחידת fetoplacental. קוטר ואלסטיות של עורקי ספירלה אלה, אשר מוקפים בלויקוציטים, בתאים מסוימים רוצח טבעי רחם (אונק), להכתיב נפח ומהירות של דם זמין ל1,2 השליה. שינויים המודינמית נכונים כתוצאה משיפוץ של עורקי הספירלה הם קריטיים להצלחת הריון. בעוד המנגנונים שונים בפירוט בין אדם והריון עכברי, התוצאה הסופית של תהליך שיפוץ בשני המינים הוא כלי דם מורחבים, גבוה מוליכות שמאבדים את שכבת שריר החלק שלה. בעכברים, אונק תא הנגזר אינטרפרון (IFγ N-) הוא הכרחי כדי לגרום לשינויים אלה בסביבות אמצע ההריון-3-5. עכברים שחסרים או תאים או רכיבים של מסלול איתות IFN-γ NK לא מצליחים לעבור שינויים אלה וזה קשור ל6,7 גדילת העובר מופחת, והדגיש את החשיבות של אספקת דם הולמת ליחידת fetoplacental. במהלך ההריון אנושי מוקדם, פלישת ביניים וendovascular של trophoblast extravillous והאינטראקציה שלהם עם תאים אונק חשובות לגרימת שינויים בכלי הדם וקידום 8-10 גדילת העובר. תאים אונק יכולים לתזמר פלישת trophoblast אדם באמצעות כמוקינים 11 וציטוקינים כגון מקרופאג granulocyte - גורם המושבה גירוי (GM-CSF) 12. פלישת trophoblast רדודה קשורה לסיבוכי שיפוץ עורקים והריון מופחתים כגון רעלת הריון 9. פרוטוקול זה מבוסס על עבודתו החלוצית של אנה Croy שתאר חשובתפקידה של מערכת החיסון וIFN-γ במיוחד נגזר NK לשיפוץ מוצלח של כלי דם באמצעות ניסויי אימונוהיסטוכימיה והעברה אלגנטית 5,13. כאן אנו מתארים את דרך מהירה וחסכונית כדי להעריך את מצב שיפוץ של עורקי ספירלה. למרות שהמעבדה שלנו מעריכה באופן שגרתי הזה באמצע ההריון (יום הריון (ה &#39;) 9.5) 14, תהליך שיפוץ מתקיים בין gd8.5 ו12.5 15. כניסתו של סורקי שקופיות אוטומטיים יש להקל באופן משמעותי את ההערכה של אזורי כלי ולומן מסעיפים ומצאנו את זה כדי להיות גישה לשחזור יותר מאשר מדידת קטרי כלי. התוספת של זיהוי immunohistochemical של SMA מאפשרת לאימות ישירה של התוצאות שהתקבלו מהערכת stereological. כמו בכל טכניקות stereological, מומלץ לבצע ההערכה כניסוי מסונוור לפחות שני בוחנים. לשם כך, ניתן הציג צעד אקראי כאשר סדרתי לחתוךטינג הדגימות כך שהחוקרים להעריך את השקופיות לא יודעים שמקבוצת ניסוי הדגימות לבוא. המטרה הכללית של פרוטוקול זה היא לספק כלי אמין כדי להעריך בזהירות את שיפוץ של עורקים סליליים בעכברים עם גנוטיפים אימהיים ואבהיים מוגדרים, בהקשר של מודלים עכבר לסיבוכים הקשורים להריון. התוצאות מדגישות את התלות בתאים אונק של תהליך זה, שהוא חיוני לצמיחה תקינה של העובר.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="704">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:212px;">C57BL/6 mice (8-12 weeks old)</td>
			<td style="width:99px;">Charles River</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:283px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Dental floss</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Polystyrene</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td>Used for holding tissue in place</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Straight dissection scissors</td>
			<td style="width:99px;">EMS</td>
			<td style="width:111px;">72940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">25G needles</td>
			<td style="width:99px;">BD&#160;</td>
			<td style="width:111px;">300600</td>
			<td>Used for holding tissue in place</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">50 ml conical tubes</td>
			<td style="width:99px;">Falcon</td>
			<td style="width:111px;">352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:212px;">Formalin solution, neutral buffered, 10%</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">HT501128-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Phosphate buffered saline</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">P3813-10PAK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Ethanol</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">32221-2.5L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Paraffin</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">327204-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:212px;">Xylene</td>
			<td style="width:99px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:111px;">X/0250/17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Automated tissue processor</td>
			<td style="width:99px;">Sakura</td>
			<td style="width:111px;">6032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Microtome</td>
			<td style="width:99px;">Leica</td>
			<td style="width:111px;">RM2245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Slide rack</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">Z710989</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Coplin jar</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">S5891</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Purified water</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:212px;">Hematoxylin solution, Gill No. 3</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">GHS332-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:212px;">Eosin Y solution</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">HT110116-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Fume hood</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Xylene-based mounting media</td>
			<td style="width:99px;">VWR</td>
			<td style="width:111px;">361254D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Slide scanner</td>
			<td style="width:99px;">Hamamatsu</td>
			<td style="width:111px;">NanoZoomer</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Slide scanner software</td>
			<td style="width:99px;">Hamamatsu</td>
			<td style="width:111px;">NDP viewer</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:212px;">Sodium citrate tribasic dihydrate</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">32320</td>
			<td>Make 10 mM solution and adjust pH to 6</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Pressure cooker</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td>Used for antigen retrieval</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Heating plate</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td>Used for antigen retrieval</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Hydrophobic barrier pen</td>
			<td style="width:99px;">Vector</td>
			<td style="width:111px;">H-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:212px;">Hydrogen peroxide</td>
			<td style="width:99px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:111px;">H/1800/15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Tris buffered saline</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">T6664-10PAK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Mouse on mouse kit</td>
			<td style="width:99px;">Vector</td>
			<td style="width:111px;">BMK-2202</td>
			<td>Significantly reduces background</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:212px;">Mouse anti-human smooth muscle actin</td>
			<td style="width:99px;">DAKO</td>
			<td style="width:111px;">M0851</td>
			<td>Cross-reacts with mouse</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">IgG2a isotype control</td>
			<td style="width:99px;">DAKO</td>
			<td style="width:111px;">X0943</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Humidified chamber</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">H6644</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:212px;">3,3&#8217;-Diaminobenzidine solution</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">D4293-5SET</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:212px;">Hydrochloric acid</td>
			<td style="width:99px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:111px;">H/1050/PB17</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of maternal vascular remodeling during pregnancy in the mouse uterus

The placenta mediates the exchange of factors such as gases and nutrients between mother and fetus and has specific demands for supply of blood from the maternal circulation. The maternal uterine vasculature needs to adapt to this temporary demand and the success of this arterial remodeling process has implications for fetal growth. Cells of the maternal immune system, especially natural killer (NK) cells, play a critical role in this process. Here we describe a method to assess the degree of remodeling of maternal spiral arteries during mouse pregnancy. Hematoxylin and eosin-stained tissue sections are scanned and the size of the vessels analysed. As a complementary validation method, we also present a qualitative assessment for the success of the remodeling process by immunohistochemical detection of smooth muscle actin (SMA), which normally disappears from within the arterial vascular media at mid-gestation. Together, these methods enable determination of an important parameter of the pregnancy phenotype. These results can be combined with other endpoints of mouse pregnancy to provide insight into the mechanisms underlying pregnancy-related complications.

Rag2 - / - IL2rg - / - עכברים חסרים כל ימפוציטים הבוגרים, כוללים תאי NK 17, ועורקי הרחם שלהם לא מצליחים לעבור את השינויים בכלי הדם ראו בעכברי C57BL / 6 wildtype congenic (WT) סביב אמצע הריון-5,14. כתוצאה מזה Rag2 המופחת שיפוץ - / - IL2rg - / - עכברים מראים אזורים קטנים יותר באופן משמעותי luminal פני השטח, מעידים על כלי הכוללים קטנים יותר שניתן דמיינו על חלקים מוכתמים-E H &amp; ולכמת stereologically (איור 2). יתר על כן, עובי הדופן יחסית (כלי ליחס לומן) הוא גבוה יותר בעורקי הספירלה בעכברים אלה, המצביע על אספקה ​​מופחתת של דם ומהירות גבוהה יותר בדם. הערכה כמותית זו אושרה באמצעות זיהוי immunohistochemical של SMA. זה אופייני לעכברי WT לאבד את רוב SMA בתקשורת וכלי הדםשל עורקי הספירלה באמצע ההריון. אם תהליך מונחה תא NK זה אינו מתקיים, SMA נשאר בתקשורת של כלי השיט וניתן להבחין בקלות immunohistochemically טבעות סביב כלי הדם (איור 3). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/53534/53534fig1.jpg" /> איור 1: רחם העכבר בgd9.5, סקירה סכמטית ציור המראה את מיקומם היחסי של קרנות רחם, צוואר רחם (הכחול) ועורקים ראשיים רחם (אדום).. הצביע הם הציר של קרן הרחם (חיצים) ונקודות קשירה (חיצים מקווקווים) הארוך. החלקים לאימונוהיסטוכימיה נחתכים לאורך מישור הנוף. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/53534/53534fig2.jpg" /> איור 2:. הערכת Stereological של שיפוץ עורקים באמצע ההריון () דוגמא assessment הלומינל ואזורי כלי מוחלט על סעיפי H &amp; E מוכתמות מנקבות WT ב2/4 המרכזי של basalis decidua (מוגדרת על ידי שחור האנכית קווים מקווקווים) בgd9.5. בכלי בהגדלה גבוהה יותר, האדום קו מקווקו תוחם אזור כלי כולל, קו מקווקו צהוב תוחם אזור לומן. בר = 500 מיקרומטר (משמאל), 50 מיקרומטר (מימין). הציר של הרחם הארוך הוא קו אופקי בכיוון זה. כימות (ב) לאזורי luminal (פנל משמאל) ויחס של שטח luminal לאזור ספינה כולל (פנל מימין) מWT (C57BL / 6) וRag2 - / - Il2rg - / - עכברים (על C57BL / 6 רקע). כל נקודת נתונים מייצגת את הממוצע של 15 מדידות (5 מדידות לכל סעיף, 3 חלקים לאתר השתלה). ברים מייצגים ממוצעים של n = 11-13 אתרי השתלה מ4 הריונות לכל קבוצה; p-ערך ממבחן מאן-וויטני שני זנב, מזווג. WT: wildtype. <img alt = &quot;איור 3&quot; src = &quot;/ קבצים / ftp_upload / 53,534 / 53534fig3.jpg&quot; /&gt; איור 3:. גילוי immunohistochemical של אקטין שריר חלק בbasalis decidua מכתים הנציג SMA על WT (למעלה) וRag2 - / - IL2rg - / - עכברים (על רקע C57BL / 6, תחתונה) בgd9.5. בר = 100 מיקרומטר. WT: wildtype.

Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Maternal Vascular Remodeling During Pregnancy in the Mouse Uterus at JoVE.com

Assessment of Maternal Vascular Remodeling During Pregnancy in the Mouse Uterus

This protocol describes a technique to assess changes in the maternal vasculature during pregnancy in mice. Using stereological methods, remodeling of the decidual spiral arteries is assessed quantitatively and the results confirmed qualitatively using immunohistochemistry.

הערכה של כלי דם אימהי שיפוץ במהלך ההריון ברחם העכבר

The placenta mediates the exchange of factors such as gases and nutrients between mother and fetus and has specific demands for supply of blood from the ...

assessment-maternal-vascular-remodeling-during-pregnancy-mouse

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

13.0K Views.  University of Cambridge. This protocol describes a technique to assess changes in the maternal vasculature during pregnancy in mice. Using stereological methods, remodeling of the decidual spiral arteries is assessed quantitatively and the results confirmed qualitatively using immunohistochemistry. 

Video: Assessment of Maternal Vascular Remodeling During Pregnancy in the Mouse Uterus

Visualizing the Interrenal Steroidogenic Tissue and Its Vascular Microenvironment in Zebrafish

This protocol introduces how to detect differentiated interrenal steroidogenic cells through a simple whole-mount enzymatic activity assay. Identifying differentiated steroidogenic tissues through chromogenic histochemical staining of 3-&#946;-Hydroxysteroid dehydrogenase /&#916;5-4 isomerase (3&#946;-Hsd) activity-positive cells is critical for monitoring the morphology and differentiation of adrenocortical and interrenal tissues in mammals and teleosts, respectively. In the zebrafish model, the optical transparency and tissue permeability of the developing embryos and larvae allow for whole-mount staining of 3&#946;-Hsd activity. This staining protocol, as performed on transgenic fluorescent reporter lines marking the developing pronephric and endothelial cells, enables the detection of the steroidogenic interrenal tissue in addition to the kidney and neighboring vasculature. In combination with vibratome sectioning, immunohistochemistry, and confocal microscopy, we can visualize and assay the vascular microenvironment of interrenal steroidogenic tissues. The 3&#946;-Hsd activity assay is essential for studying the cell biology of the zebrafish interrenal gland because to date, no suitable antibody is available for labeling zebrafish steroidogenic cells. Furthermore, this assay is rapid and simple, thus providing a powerful tool for mutant screens targeting adrenal (interrenal) genetic disorders as well as for determining disruption effects of chemicals on steroidogenesis in pharmaceutical or toxicological studies.

The interrenal gland in zebrafish is the teleostean counterpart of the mammalian adrenal gland. This protocol introduces how to perform the 3-&#946;-hydroxysteroid dehydrogenase (&#916;5-4 isomerase; 3&#946;-Hsd) enzymatic activity assay, which detects differentiated steroidogenic cells in the developing zebrafish.

לדמיין את רקמות Interrenal Steroidogenic ו microenvironment הדם שלה דג הזברה

This protocol introduces how to detect differentiated interrenal steroidogenic cells through a simple whole-mount enzymatic activity assay. Identifying ...

Functional Manipulation of Maternal Gene Products Using In Vitro Oocyte Maturation in Zebrafish

Cellular events that take place during the earliest stages of animal embryonic development are driven by maternally derived gene products deposited into the developing oocyte. Because these events rely on maternal products which typically act very soon after fertilization-that preexist inside the egg, standard approaches for expression and functional reduction involving the injection of reagents into the fertilized egg are typically ineffective. Instead, such manipulations must be performed during oogenesis, prior to or during the accumulation of maternal products. This article describes in detail a protocol for the in vitro maturation of immature zebrafish oocytes and their subsequent in vitro fertilization, yielding viable embryos that survive to adulthood. This method allows the functional manipulation of maternal products during oogenesis, such as the expression of products for phenotypic rescue and tagged construct visualization, as well as the reduction of gene function through reverse-genetics agents.

Functional Manipulation of Maternal Gene Products Using In Vitro Oocyte Maturation in Zebrafish

An optimized protocol for the in vitro maturation of zebrafish oocytes used for the manipulation of maternal gene products is presented here.

מניפולציה פונקציונלית של מוצרים אימהיים הגן באמצעות<em&gt; במבחנה</em&gt; הבשלת ביצית דג הזברה

Cellular events that take place during the earliest stages of animal embryonic development are driven by maternally derived gene products deposited into ...

Analysis of Retinoic Acid-induced Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Two and Three-dimensional Embryoid Bodies

Mouse embryonic stem cells (ESCs) isolated from the inner mass of the blastocyst (typically at day E3.5), can be used as in vitro model system for studying early embryonic development. In the absence of leukemia inhibitory factor (LIF), ESCs differentiate by default into neural precursor cells. They can be amassed into a three dimensional (3D) spherical aggregate termed embryoid body (EB) due to its similarity to the early stage embryo. EBs can be seeded on fibronectin-coated coverslips, where they expand by growing two dimensional (2D) extensions, or implanted in 3D collagen matrices where they continue growing as spheroids, and differentiate into the three germ layers: endodermal, mesodermal, and ectodermal. The 3D collagen culture mimics the in vivo environment more closely than the 2D EBs. The 2D EB culture facilitates analysis by immunofluorescence and immunoblotting to track differentiation. We have developed a two-step neural differentiation protocol. In the first step, EBs are generated by the hanging-drop technique, and, simultaneously, are induced to differentiate by exposure to retinoic acid (RA). In the second step, neural differentiation proceeds in a 2D or 3D format in the absence of RA.

We describe a technique for using murine embryonic stem cells for generating two or three dimensional embryoid bodies. We then explain how to induce neural differentiation of the embryoid body cells by retinoic acid, and how to analyze their state of differentiation by progenitor cell marker immunofluorescence and immunoblotting.

ניתוח של החומצה הרטינואית המושרה בידול עצבית של תאי גזע עובריים עכבר בשניים ובשלושה-ממדי גופים Embryoid

Mouse embryonic stem cells (ESCs) isolated from the inner mass of the blastocyst (typically at day E3.5), can be used as in vitro model system for ...

A Novel Mammary Fat Pad Transplantation Technique to Visualize the Vessel Generation of Vascular Endothelial Stem Cells

Endothelial cells (ECs) are the fundamental building blocks of the vascular architecture and mediate vascular growth and remodeling to ensure proper vessel development and homeostasis. However, studies on endothelial lineage hierarchy remain elusive due to the lack of tools to gain access as well as to directly evaluate their behavior in vivo. To address this shortcoming, a new tissue model to study angiogenesis using the mammary fat pad has been developed. The mammary gland develops mostly in the postnatal stages, including puberty and pregnancy, during which robust epithelium proliferation is accompanied by extensive vascular remodeling. Mammary fat pads provide space, matrix, and rich angiogenic stimuli from the growing mammary epithelium. Furthermore, mammary fat pads are located outside the peritoneal cavity, making them an easily accessible grafting site for assessing the angiogenic potential of exogenous cells. This work also describes an efficient tracing approach using fluorescent reporter mice to specifically label the targeted population of vascular endothelial stem cells (VESCs) in vivo. This lineage tracing method, coupled with subsequent tissue whole-mount microscopy, enable the direct visualization of targeted cells and their descendants, through which the proliferation capability can be quantified and the differentiation commitment can be fate-mapped. Using these methods, a population of bipotent protein C receptor (Procr) expressing VESCs has recently been identified in multiple vascular systems. Procr+ VESCs, giving rise to both new ECs and pericytes, actively contribute to angiogenesis during development, homeostasis, and injury repair. Overall, this manuscript describes a new mammary fat pad transplantation and in vivo lineage tracing techniques that can be used to evaluate the stem cell properties of VESCs.

This work demonstrates a novel approach to assess the proliferation, differentiation, and vessel-forming potential of vascular endothelial stem cells (VESCs) through mammary fat pad transplantation followed by whole-mount tissue preparation for microscopic observation. A lineage tracing strategy to investigate the behavior of VESCs in vivo is also presented.

רומן חדש פאט שומן טכניקת השתלת לדמיין את כלי השיט הדור של כלי הדם בתאי גזע אנדותל

Endothelial cells (ECs) are the fundamental building blocks of the vascular architecture and mediate vascular growth and remodeling to ensure proper ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to cleft secondary palate, a common congenital anomaly in humans. Secondary palate fusion has been extensively studied leading to several proposed cellular mechanisms that may mediate this process. However, these studies have been mostly performed on fixed embryonic tissues at progressive timepoints during development or in fixed explant cultures analyzed at static timepoints. Static analysis is limited for the analysis of dynamic morphogenetic processes such a palate fusion and what types of dynamic cellular behaviors mediate palatal fusion is incompletely understood. Here we describe a protocol for live imaging of ex vivo secondary palate fusion in mouse embryos. To examine cellular behaviors of palate fusion, epithelial-specific Keratin14-cre was used to label palate epithelial cells in ROSA26-mTmGflox reporter embryos. To visualize filamentous actin, Lifeact-mRFPruby reporter mice were used. Live imaging of secondary palate fusion was performed by dissecting recently-adhered secondary palatal shelves of embryonic day (E) 14.5 stage embryos and culturing in agarose-containing media on a glass bottom dish to enable imaging with an inverted confocal microscope. Using this method, we have detected a variety of novel cellular behaviors during secondary palate fusion. An appreciation of how distinct cell behaviors are coordinated in space and time greatly contributes to our understanding of this dynamic morphogenetic process. This protocol can be applied to mutant mouse lines, or cultures treated with pharmacological inhibitors to further advance understanding of how secondary palate fusion is controlled.

Here, we present a protocol for live imaging of mouse secondary palate fusion using confocal microscopy. This protocol can be used in combination with a variety of fluorescent reporter mouse lines, and with pathway inhibitors for mechanistic insight. This protocol can be adapted for live imaging in other developmental systems.

הדמיה חיה של עכבר משניים פיוז &#39;ן

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

A Novel Use of Three-dimensional High-frequency Ultrasonography for Early Pregnancy Characterization in the Mouse

High-frequency ultrasonography (HFUS) is a common method to non-invasively monitor the real-time development of the human fetus in utero. The mouse is routinely used as an in vivo model to study embryo implantation and pregnancy progression. Unfortunately, such murine studies require pregnancy interruption to enable follow-up phenotypic analysis. To address this issue, we used three-dimensional (3-D) reconstruction of HFUS imaging data for early detection and characterization of murine embryo implantation sites and their individual developmental progression in utero. Combining HFUS imaging with 3-D reconstruction and modeling, we were able to accurately quantify embryo implantation site number as well as monitor developmental progression in pregnant C57BL6J/129S mice from 5.5 days post coitus (d.p.c.) through to 9.5 d.p.c. with the use of a transducer. Measurements included: number, location, and volume of implantation sites as well as inter-implantation site spacing; embryo viability was assessed by cardiac activity monitoring. In the immediate post-implantation period (5.5 to 8.5 d.p.c.), 3-D reconstruction of the gravid uterus in both mesh and solid overlay format enabled visual representation of the developing pregnancies within each uterine horn. As genetically engineered mice continue to be used to characterize female reproductive phenotypes derived from uterine dysfunction, this method offers a new approach to detect, quantify, and characterize early implantation events in vivo. This novel use of 3-D HFUS imaging demonstrates the ability to successfully detect, visualize, and characterize embryo-implantation sites during early murine pregnancy in a non-invasive manner. The technology offers a significant improvement over current methods, which rely on the interruption of pregnancies for gross tissue and histopathologic characterization. Here we use a video and text format to describe how to successfully perform ultrasounds of early murine pregnancy to generate reliable and reproducible data with reconstruction of the uterine form in mesh and solid 3-D images.

Mice are widely used to study gestational biology. However, pregnancy termination is required for such studies which precludes longitudinal investigations and necessitates the use of large numbers of animals. Therefore, we describe a non-invasive technique of high-frequency ultrasonography for early detection and monitoring of post-implantation events in the pregnant mouse.

שימוש הרומן של בדיקת אולטרה סאונד בתדירות גבוהה תלת מימדי אפיון בתחילת ההריון העכבר

High-frequency ultrasonography (HFUS) is a common method to non-invasively monitor the real-time development of the human fetus in utero. The mouse is ...

Ovarian Tissue Culture to Visualize Phenomena in Mouse Ovary

Mammalian females periodically ovulate an almost constant number of oocytes during each estrus cycle. To sustain such regularity and periodicity, regulation occurs at the hypothalamic-pituitary-gonadal axis level and on developing follicles in the ovary. Despite active studies, follicle development mechanisms are not clear because of the several steps involved from the dormant primordial follicle activation to ovulation, and because of the regulation complexity that differs at each follicular stage. To investigate the mechanisms of follicle development, and the dynamics of follicles throughout the estrus cycle, we developed a mouse ovarian tissue culture model that can be used to observe follicle development using a microscope. Systematic follicle development, periodical ovulation, and follicle atresia can all be reproduced in the cultured ovary model, and the culture conditions can be experimentally modulated. Here, we demonstrate the usefulness of this method in the study of the regulatory mechanisms of follicle development and other ovarian phenomena.

Ovarian tissue cultures can be used as models of follicle development, ovulation, and follicle atresia and indicate regulatory mechanisms of dynamic ovarian processes.

תרביות רקמה השחלות כדי לחזות תופעות העכבר השחלה

Mammalian females periodically ovulate an almost constant number of oocytes during each estrus cycle. To sustain such regularity and periodicity, ...

Assessment of Ultrastructural Neuroplasticity Parameters After In Utero Transduction of the Developing Mouse Brain and Spinal Cord

The present study combines in utero transduction with transmission electron microscopy (TEM) aiming at a precise morphometrical analysis of ultrastructural parameters in unambiguously identified topographical structures, affected by a protein of interest that is introduced into the organism via viral transfer. This combined approach allows for a smooth transition from macrostructural to ultrastructural identification by following topographical navigation maps in a tissue atlas. High-resolution electron microscopy of the in-utero-transduced tissue reveals the fine ultrastructure of the neuropil and its plasticity parameters, such as cross-sectioned synaptic bouton areas, the number of synaptic vesicles and mitochondria within a bouton profile, the length of synaptic contacts, cross-sectioned axonal areas, the thickness of myelin sheaths, the number of myelin lamellae, and cross-sectioned areas of mitochondria profiles. The analysis of these parameters reveals essential insights into changes of ultrastructural plasticity in the areas of the nervous system that are affected by the viral transfer of the genetic construct. This combined method can not only be used for studying the direct effect of genetically engineered biomolecules and/or drugs on neuronal plasticity but also opens the possibility to study the in utero rescue of neuronal plasticity (e.g., in the context of neurodegenerative diseases).

The combination of transmission electron microscopy and in utero transduction is a powerful approach for studying morphological changes in the fine ultrastructure of the nervous system during development. This combined method allows deep insights into changes in structural details underlying neuroplasticity with respect to their topographical representation.

הערכה של הפרמטרים והנוירולוגיה הפלסטית Ultrastructural לאחר התמרה חושית עם רחם של פיתוח העכבר המוח ואת חוט השדרה

The present study combines in utero transduction with transmission electron microscopy (TEM) aiming at a precise morphometrical analysis of ...

Vascular Casting of Adult and Early Postnatal Mouse Lungs for Micro-CT Imaging

Blood vessels form intricate networks in 3-dimensional space. Consequently, it is difficult to visually appreciate how vascular networks interact and behave by observing the surface of a tissue. This method provides a means to visualize the complex 3-dimensional vascular architecture of the lung.
To accomplish this, a catheter is inserted into the pulmonary artery and the vasculature is simultaneously flushed of blood and chemically dilated to limit resistance. Lungs are then inflated through the trachea at a standard pressure and the polymer compound is infused into the vascular bed at a standard flow rate. Once the entire arterial network is filled and allowed to cure, the lung vasculature may be visualized directly or imaged on a micro-CT (&#181;CT) scanner.
When performed successfully, one can appreciate the pulmonary arterial network in mice ranging from early postnatal ages to adults. Additionally, while demonstrated in the pulmonary arterial bed, this method can be applied to any vascular bed with optimized catheter placement and endpoints.

The aim of this technique is ex vivo visualization of pulmonary arterial networks of early postnatal and adult mice through lung inflation and injection of a radio-opaque polymer-based compound via the pulmonary artery. Potential applications for casted tissues are also discussed.

יציקת כלי דם של ריאות עכבר מבוגר ומוקדם לאחר הלידה עבור הדמיית מיקרו-CT

Blood vessels form intricate networks in 3-dimensional space. Consequently, it is difficult to visually appreciate how vascular networks interact and ...

Defining the Program of Maternal mRNA Translation during In vitro Maturation using a Single Oocyte Reporter Assay

Events associated with oocyte nuclear maturation have been well described. However, much less is known about the molecular pathways and processes that take place in the cytoplasm in preparation for fertilization and acquisition of totipotency. During oocyte maturation, changes in gene expression depend exclusively on the translation and degradation of maternal messenger RNAs (mRNAs) rather than on transcription. Execution of the translational program, therefore, plays a key role in establishing oocyte developmental competence to sustain embryo development. This paper is part of a focus on defining the program of maternal mRNA translation that takes place during meiotic maturation and at the oocyte-to-zygote transition. In this method paper, a strategy is presented to study the regulation of translation of target mRNAs during in vitro oocyte maturation. Here, a Ypet reporter is fused to the 3&#39; untranslated region (UTR) of the gene of interest and then micro-injected into oocytes together with polyadenylated mRNA encoding for mCherry to control for injected volume. By using time-lapse microscopy to measure reporter accumulation, translation rates are calculated at different transitions during oocyte meiotic maturation. Here, the protocols for oocyte isolation and injection, time-lapse recording, and data analysis have been described, using the Ypet/interleukin-7 (IL-7)-3&#39; UTR reporter as an example.

This protocol describes a reporter assay to study the regulation of mRNA translation in single oocytes during in vitro maturation.

הגדרת התוכנית של תרגום mRNA אימהי במהלך התבגרות במבחנה באמצעות בדיקה של כתב ביצית יחיד

Events associated with oocyte nuclear maturation have been well described. However, much less is known about the molecular pathways and processes that ...