The authors would like to thank all members of the Colucci lab for helpful discussions. This work was funded by The Wellcome Trust [094073/Z/10/Z], The Centre for Trophoblast Research and The British Heart Foundation.

כל הנהלים דנו בכתב יד זה הם בהתאם לתקנות משרד פנים בבריטניה ומאושרות על ידי לוח הסקירה אתית קיימברידג &#39;. 1. דגימה אוסף <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת הזדווגויות מתוזמן באמצעות C57BL / 6 נקבות עכברים ישנים 8-12 שבוע עם זכרים בוגרים (עד 2 נקבות לזכרים) בשעתי אחר הצהריים. לבדוק את קיומו של תקעי נרתיק כסימן להזדווגות מוקדם בבוקר בימים הבאים. הנוכחות של תקע בgd0.5 סימני בוקר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על gd9.5, להרדימו נקע בצוואר רחם ולפתוח את חלל הבטן. הערה המתת חסד שעל ידי CO 2 עלולים לגרום vasodilatation. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בחוט דנטלי ולקשור בעדינות את עורקי רחם (איור 1, חצים מקווקוים). לקשור את החוט סביב העורקים בקצה של כל קרן רחם, הפרוקסימלי לשחלות, כמו גם סביב צוואר הרחם. הערה: אל להיקרע כלי מכיוון שהדבר עלול לגרום לעורקים התמוטטו. </li> &lt;li&gt; לנתח את הרחם במהירות באמצעות מספריים לנתיחה, מוציא את כל הרחם distally לשלוש נקודות קשירה בקצה קרן הרחם וצוואר הרחם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הרחם על פיסת קלקר מוכנה כך ששני הקרניים מיושרות לאורך אותו הציר הארוך בכיוונים מנוגדים מצוואר הרחם. בעדינות למתוח אותו ולהצמיד למקום באמצעות 2-3 25 מחטי G. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטבול את הקלקר לתוך צינור חרוטי 50 מיליליטר מוכן. ראש הדף עד 50 מיליליטר עם פורמלין 10%. תקן עבור 5-6 שעות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחק את פתרון פורמלין ולהחליף עם 50 1x מלוח מיליליטר פוספט (PBS) במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בלו שתי קרנות רחם proximally לנקודת קשירה בכל קצה וproximally לצוואר הרחם במרכז, לקצץ משם כל שומן עודף סביב אתרי ההשתלה ולשטוף פעמים PBS במשך 5 דקות כדי להסיר עקבות של פורמלין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסן את הדגימות באתנול 70% ב 4 ° C. (לתקופה של עד שבועיים) עד לעיבוד. זהירות: Ethanol הוא דליק מאוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במערכת עיבוד אוטומטית באמצעות הפרמטרים שצוינו בטבלה 1. שבץ הקרניים בנפרד בפרפין, כך שהם יכולים לחתוך לאורך המישור ניצבת לציר של הרחם הארוך. הדבר מבטיח כי השטח המרבי של כל אתר השתלה יהיה חשוף לניתוח באמצע הבלוק (איור 2 א). אופציונאלי: זוהי נקודת זמן נוחה לאקראית של בלוקים אם תרצה בכך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות microtome, לחתוך קטעים סידוריים של 7 עובי מיקרומטר מהלוקים. כתם סעיף אחד בכל מרווח 49 מיקרומטר עם hematoxylin ו eosin (H &amp; E, ראה סעיף 2.1). אחסן את החלקים שנותרו בטמפרטורת חדר למשך צביעת SMA ויישומים במורד הזרם אחרים. </li></ol><table fo:keep-together.within-page="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:99px;"> פִּתָרוֹן </td><td style="width:43px;"> זְמַן<html></td><td style="width:97px;"> טֶמפֶּרָטוּרָה </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> אתנול 70% </td><td> שעה 1 </td><td> 40 מעלות צלזיוס </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> אתנול 100% </td><td> שעה 1 </td><td> 40 מעלות צלזיוס </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> אתנול 100% </td><td> שעה 1 </td><td> 40 מעלות צלזיוס </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> אתנול 100% </td><td> שעה 1 </td><td> 40 מעלות צלזיוס </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> אתנול 100% </td><td> שעה 1 </td><td> 40 מעלות צלזיוס </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> אתנול 100% </td><td> שעה 1 </td><td> 40 מעלות צלזיוס </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> אתנול 100% </td><td> שעה 1 </td><td> 40 מעלות צלזיוס </td></tr><tr height="21">21px; &quot;&gt; קסילן: </td><td> שעה 1 </td><td> 40 מעלות צלזיוס </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> קסילן </td><td> שעה 1 </td><td> 40 מעלות צלזיוס </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> קסילן </td><td> שעה 1 </td><td> 40 מעלות צלזיוס </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> פָּרָפִין </td><td> שעה 1 </td><td> 63 מעלות צלזיוס </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> פָּרָפִין </td><td> שעה 1 </td><td> 63 מעלות צלזיוס </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> פָּרָפִין </td><td> שעה 1 </td><td> 63 מעלות צלזיוס </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;"> פָּרָפִין </td><td> שעה 1 </td><td> 63 מעלות צלזיוס </td></tr></tbody></table> טבלת 1:. הגדרות עבור עיבוד רקמות אוטומטי סקירה כללית של ההגדרה המשמשת לעיבוד של רקמת רחם 2. Sterהערכת eological <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> H &amp; E מכתים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סעיפי Deparaffinize ידי טבילת שקופיות רכובים במעמד שקופית לתוך אמבטיה קסילן 100% במשך 10 דקות בטמפרטורת חדר. זהירות: קסילן הוא דליק ומסרטן חשד שהוא רעיל באמצעות מגע ושאיפה. עבודה זו חייבת להתנהל במנדף, תוך שימוש בציוד מגן אישי (PPE). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטבול את השקופיות באמבטיה המכילות קסילן הנקי לעוד 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רצף לטבול שקופיות באמבטיות המכילות 100% אתנול, 95% אתנול, 70% אתנול ומים מטוהרים במשך 5 דקות כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטבול את השקופיות בפתרון של 50% 3 hematoxylin גיל לא, מדולל במים מטוהרים, במשך 5 דקות. זהירות: Hematoxylin מזיק על ידי בליעה ומגע לעיניים. ללבוש PPE המתאים בעת טיפול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף שקופיות בשוקת צביעה תחת זרם מים ברז במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטבול את השקופיות בפתרון 1% חומצה / אלכוהול (1% חומצה הידרוכלורית 10 M באתנול 70%) למשך 10 שניותולשטוף בשוקת צביעה תחת זרם מים ברז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטבול את השקופיות בפתרון eosin למשך 30 שניות ולשטוף בשוקת צביעה תחת זרם מים ברז במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתוך מנדף, ברצף לטבול שקופיות באמבטיות המכילות 70% אתנול, 95% אתנול ו 100% אתנול במשך 5 דקות כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטבול את השקופיות באמבטיה המכילה קסילן במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר coverslips באמצעות הרכבה בינונית מבוסס קסילן. ייבש אופקי וביסודיות במנדף לפני לדמיין את השקופיות תחת מיקרוסקופ. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הערכת Stereological של גודל כלי שיט וסטטוס שיפוץ <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור כל אתר השתלה, לקבוע אילו חלקים קרובים לנקודת midsagittal. הקובץ המצורף chorioallantoic בין השליה לעובר ופיתוח משמש כמדד טוב לנקודת midsagittal. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר 3 חלקים ב 49 מיקרומטר במרווחים קרובים לנקודת midsagittal לניתוח. סריקת שקופיות שנבחרו. על מנת להימנע מIncורידי luding, אשר הוכחו להיות ממוקמים יותר שולי באתרי ההשתלה 16, להגביל את הניתוח על 2/4 של כל אתר השתלה (איור 2 א) המרכזי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להעריך גודל לומן, לצייר סביב החלק הפנימי של כלי הדם ולהקליט את השטח של צורה זו. לסך גודל הכלי, לצייר סביב הקיר החיצוני של כלי השיט, כולל תאי אנדותל, pericytes ולויקוציטים ביצוע עצמי. הערה: היחס בין סך גודל כלי ללומן הוא מדד למצב שיפוץ של ספינה. ככלי סליל באמצעות המטוס שהסעיף היה לחתוך לאורך, ייתכנו חתכים מרובים של אותו העורק בשקופית אחת. הימנע מדידה אותו העורק מספר פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רשום את המדידות מ 5 כלים בכל אתר השתלה עם לומן הגדול ועגול. למדוד כל אתר השתלה בשלושה עותקים (שלושה חלקים במרווחים 49 מיקרומטר זה מזה). הממוצע של 15 represe מדידות אלהNTS הקוטר הממוצע של כלי הגדולים ביותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להימנע מייצוג יתר של כלי גדול יותר בכמה דוגמאות, למדוד אותו המספר של כלי שיט בכל אתר השתלה. </li></ol></li></ol> 3. הערכה איכותית באמצעות אימונוהיסטוכימיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Deparaffinization וRehydration <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סעיפי Deparaffinize ידי טבילת שקופיות רכובים במעמד שקופית חסינה חומה לאמבטית קסילן 100% במשך 10 דקות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטבול את השקופיות באמבטיה המכילות קסילן הנקי לעוד 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רצף לטבול שקופיות באמבטיות המכילות 100% אתנול, 95% אתנול ו -70% ומים מטוהרים במשך 5 דקות כל אחד. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אנטיגן אחזור <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן חיץ נתרן ציטרט 10 מ&quot;מ במים מטוהרים ולהתאים לpH 6 באמצעות 10 חומצה הידרוכלורית M. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא מיכל חסין חום שיכול להכיל 600 מיליליטר עם חיץ ציטראט 400 מיליליטר נתרן ומקום בסיר לחץ מקומי המכיל ואט מספיקאה לצלול מחצית מהמכל. באופן רופף לצרף את המכסה של סיר הלחץ והחום עד רתיחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מתלה מקום שקופיות למאגר נתרן ציטרט והדוק לתקן את המכסה של סיר הלחץ. ברגע שלחץ, לאפשר לרתיחה במשך 3 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לְהַפִיג לַחַץ סיר הלחץ ולהסיר את המכל הפנימי. לאפשר שקופיות להתקרר במאגר נתרן ציטרט במשך 10 דקות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף מחליק באמבט המכיל מים מטוהרים במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקיף את החלקים באמצעות עט מחסום הידרופובי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף שקופיות על ידי השריית בPBS במשך 5 דקות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חסימת אנדוגני Peroxidase והלא ספציפי מחייב <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סעיפי דגירה עם מי חמצן 3% בדילול מלא במים מטוהרים בתא humidified למשך 30 דקות בטמפרטורת חדר. זהירות: מי חמצן הוא גירוי מאוד לעיניים, עור ועל בליעה. ללבוש PPE המתאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקש את פתרון מי חמצן עודף ולשטוף SLIdes פעמיים על ידי השריית בטריס שנאגרו מלוח (TBS) עבור 2 דקות כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סעיפי דגירה עם אימונוגלובולינים עכבר חסימה מגיב מאת העכבר על ערכת עכבר הוכן בהתאם להוראות יצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף שקופיות פעמיים ב TBS עבור 2 דקות כל אחד. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Immunodetection של אקטין שריר חלק <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון נוגדן diluent (הניתן בערכה) ודגירה עם קטעים של 5 דקות בטמפרטורת חדר, או על פי הוראות יצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל 1: שריר אקטין חלק 100 עכבר אנטי-אנושי (DAKO M0851) בפתרון diluent הנוגדן. לדלל את שליטת אלוטיפ עכבר IgG2a בפתרון diluent נוגדן, להבטיח כי ריכוז אימונוגלובולינים הסופי הוא שווה ערך בשני הפתרונות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקש את סעיפי פתרון diluent הנוגדן וכיסוי עודפים עם פתרונות בקרה או בדילול נוגדן או אלוטיפ. דגירה בתא humidified למשך 30 דקות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף שקופיות פעמיים ב TBS ל2 דקות כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל נוגדנים משני אנטי עכבר biotinylated דגירה סעיפים במשך 10 דקות בטמפרטורת חדר, או על פי הוראות יצרנים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף שקופיות אחת לעם כפות וPBS למשך 2 דקות, בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון 3,3&#39;-diaminobenzidine (DAB) על פי הוראות יצרן. לכסות חלקים עם פתרון DAB ודגירה של עד 4 דק &#39;, הבטחה לעקוב אחר חלקים, כדי למנוע התפתחות צבע עודפת. זהירות: DAB הוא דליק ומסרטן חשד שהוא רעיל באמצעות מגע ושאיפה. ללבוש PPE המתאים בעת טיפול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטבול את השקופיות במים מטוהרים, כאשר מגיעה לעצמה רצויה של צביעה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Counterstain עם 50% גיל מס &#39;3 hematoxylin במשך 20 שניות ולשטוף בשוקת צביעה תחת זרם מים ברז עד המים פועל ברורים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התייבשות והרכבה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתוך מנדף, ברצף לטבול שקופיות באמבטיות המכילות ETH 70%anol, 95% אתנול ו 100% אתנול במשך 5 דקות כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטבול את השקופיות באמבטיה המכילה קסילן במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר coverslips באמצעות הרכבה בינונית מבוסס קסילן. ייבשו אופקי וביסודיות במנדף לפני לדמיין את השקופיות תחת מיקרוסקופ </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Burton, G. J., Woods, A. W., Jauniaux, E., Kingdom, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rheological+and+physiological+consequences+of+conversion+of+the+maternal+spiral+arteries+for+uteroplacental+blood+flow+during+human+pregnancy.">Rheological and physiological consequences of conversion of the maternal spiral arteries for uteroplacental blood flow during human pregnancy.</a> Placenta. 30 (6), 473-482 (2009).</li><li>Pijnenborg, R., Vercruysse, L., Hanssens, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+uterine+spiral+arteries+in+human+pregnancy:+facts+and+controversies.">The uterine spiral arteries in human pregnancy: facts and controversies.</a> Placenta. 27 (9-10), 939-958 (2006).</li><li>Ashkar, A. A., Croy, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon-gamma+contributes+to+the+normalcy+of+murine+pregnancy.">Interferon-gamma contributes to the normalcy of murine pregnancy.</a> Biol Reprod. 61 (2), 493-502 (1999).</li><li>Ashkar, A. A., Croy, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functions+of+uterine+natural+killer+cells+are+mediated+by+interferon+gamma+production+during+murine+pregnancy.">Functions of uterine natural killer cells are mediated by interferon gamma production during murine pregnancy.</a> Semin Immunol. 13 (4), 235-241 (2001).</li><li>Ashkar, A. A., Di Santo, J. P., Croy, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon+gamma+contributes+to+initiation+of+uterine+vascular+modification,+decidual+integrity,+and+uterine+natural+killer+cell+maturation+during+normal+murine+pregnancy.">Interferon gamma contributes to initiation of uterine vascular modification, decidual integrity, and uterine natural killer cell maturation during normal murine pregnancy.</a> J Exp Med. 192 (2), 259-270 (2000).</li><li>Ashkar, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+requirements+for+IL-15+and+IFN+regulatory+factors+in+uterine+NK+cell+differentiation+and+function+during+pregnancy.">Assessment of requirements for IL-15 and IFN regulatory factors in uterine NK cell differentiation and function during pregnancy.</a> J Immunol. 171 (6), 2937-2944 (2003).</li><li>Barber, E. M., Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+uterine+NK+cell+population+requires+IL-15+but+these+cells+are+not+required+for+pregnancy+nor+the+resolution+of+a+Listeria+monocytogenes+infection.">The uterine NK cell population requires IL-15 but these cells are not required for pregnancy nor the resolution of a Listeria monocytogenes infection.</a> J Immunol. 171 (1), 37-46 (2003).</li><li>Colucci, F., Boulenouar, S., Kieckbusch, J., Moffett, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+does+variability+of+immune+system+genes+affect+placentation.">How does variability of immune system genes affect placentation.</a> Placenta. 32 (8), 539-545 (2011).</li><li>Pijnenborg, R., Vercruysse, L., Brosens, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+placentation.">Deep placentation.</a> Best Pract Res Clin Obstet Gynaecol. 25 (3), 273-285 (2011).</li><li>Colucci, F., Kieckbusch, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+uterine+natural+killer+cells+nurture+fetal+growth:+in+medio+stat+virtus.">Maternal uterine natural killer cells nurture fetal growth: in medio stat virtus.</a> Trends Mol Med. 21 (2), 60-67 (2015).</li><li>Hanna, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decidual+NK+cells+regulate+key+developmental+processes+at+the+human+fetal-maternal+interface.">Decidual NK cells regulate key developmental processes at the human fetal-maternal interface.</a> Nat Med. 12 (9), 1065-1074 (2006).</li><li>Xiong, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+uterine+NK+cell-activating+receptor+KIR2DS1+enhances+placentation.">Maternal uterine NK cell-activating receptor KIR2DS1 enhances placentation.</a> J Clin Invest. 123 (10), 4264-4272 (2013).</li><li>Croy, B. A., Zhang, J., Tayade, C., Colucci, F., Yadi, H., Yamada, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+uterine+natural+killer+cells+in+mice.">Analysis of uterine natural killer cells in mice.</a> Methods Mol Biol. 612, 465-503 (2010).</li><li>Kieckbusch, J., Gaynor, L. M., Moffett, A., Colucci, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MHC-dependent+inhibition+of+uterine+NK+cells+impedes+fetal+growth+and+decidual+vascular+remodelling.">MHC-dependent inhibition of uterine NK cells impedes fetal growth and decidual vascular remodelling.</a> Nat Commun. 5, (2014).</li><li>Zhang, J., Chen, Z., Smith, G. N., Croy, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+killer+cell-triggered+vascular+transformation:+maternal+care+before+birth.">Natural killer cell-triggered vascular transformation: maternal care before birth.</a> Cell Mol Immunol. 8 (1), 1-11 (2010).</li><li>Adamson, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+between+trophoblast+cells+and+the+maternal+and+fetal+circulation+in+the+mouse+placenta.">Interactions between trophoblast cells and the maternal and fetal circulation in the mouse placenta.</a> Dev Biol. 250 (2), 358-373 (2002).</li><li>Colucci, F., Soudais, C., Rosmaraki, E., Vanes, L., Tybulewicz, V. L. J., Di Santo, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+NK+cell+development+using+a+novel+alymphoid+mouse+model:+Investigating+the+role+of+the+c-abl+proto-oncogene+in+murine+NK+cell+differentiation.">Dissecting NK cell development using a novel alymphoid mouse model: Investigating the role of the c-abl proto-oncogene in murine NK cell differentiation.</a> J Immunol. 162 (5), 2761-2765 (1999).</li><li>Hu, D., Cross, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ablation+of+Tpbpa-positive+trophoblast+precursors+leads+to+defects+in+maternal+spiral+artery+remodeling+in+the+mouse+placenta.">Ablation of Tpbpa-positive trophoblast precursors leads to defects in maternal spiral artery remodeling in the mouse placenta.</a> Dev Biol. 358 (1), 231-239 (2011).</li><li>Zhang, J. H., Croy, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+Ultrasonography+to+Define+Fetal-Maternal+Relationships:+Moving+from+Humans+to+Mice.">Using Ultrasonography to Define Fetal-Maternal Relationships: Moving from Humans to Mice.</a> Comparative Med. 59 (6), 527-533 (2009).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

הפרוטוקול המובא כאן נועד לספק שיטה לשחזור הקשורים ליישום שינויים בכלי הדם הנדרשים להריון מוצלח. קריטי להצלחה של הערכה זו היא האיכות של חלקי רקמות. שניהם קביעה מדויקת של גיל הריון אתרי השתלה וכן באופן מהימן ligating עורקי הרחם הם צעדים חיוניים. שינויים בפרמטרים כגון זמן של קיבעון, פרוטוקול עיבוד רקמות, וכו &#39;עשויים להשפיע גם על התוצאה. להערכה stereological משוחדת, חשוב למדוד את אותו המספר של כלי שיט בכל אתר השתלה. מומלץ למדוד 5 כלי לאתר השתלה וכל אתר השתלה בשלושה עותקים. הממוצע של 15 מדידות אלה מייצג את הגודל הממוצע של 5 כלי הגדולים ביותר. בהמשך לנתונים מRag2 alymphoid - / - IL2rg - / - עכברים שמוצגים כאן, מצאנו prot זהocol שימושי עבור מספר הדגמים של תפקוד מערכת חיסון אימהי לקוי, כולל אחד מתאי NK עכבות 14. פגמים בשיפוץ עורקים גם הוכחו במודלים של פלישת trophoblast לקוי 18 והטכניקות המתוארות כאן עשויות להיות מועילות כדי להעריך את כלי הדם במקרים אלה. אנו מותאמים ומאומתים פרוטוקול זה לחקירת שיפוץ כלי דם decidual באמצע ההריון בעכבר, אבל זה גם מתקבל על הדעת להתאים פרוטוקול זה לעבוד במערכות אחרות מודל (למשל חולדות) או אפילו באיברים אחרים. בעוד אנו מוצאים כי שיפוץ NK-תלוי ניתן להעריך חסונה בgd9.5, זה יכול להיות מתוקן לנקודות זמן אחרות כגון gd12.5, כאשר כלי הדם האימהיים הוא שופץ לחלוטין. בנקודה זו בזמן, פלישת trophoblast endovascular היא עמוקה יותר 16 ונקודת זמן זו עשויה להיות מתאימה יותר לחקירות של התפקיד trophoblast לשינויים בכלי הדם. אם קריאות כמותית נוספות רצויים,חוקרים יכולים גם להגדיל את מספר הסעיפים המוכתמים עבור SMA ולהעריך את אחוז כלי שופצו באופן חלקי בכל אתר השתלה. הגבלה של פרוטוקול זה היא תיאורי הטבע של בדיקות היסטולוגית. מבחני פונקציונליים, לעומת זאת, הם רק הופכים לאט זמינים (כגון אולטרסאונד דופלר 19). טכניקות אלה דורשות מומחיות טכנית והוצאות גבוהות בהרבה לרכישה ותחזוקה של ציוד, אבל יש את היתרון של מתן אורך קריאת נתוני vivo להשפעת השינויים שניתן לצפות בהיסטולוגיה. חסרון אפשרי של כל בדיקות stereological הוא הסובייקטיביות של החוקרים. לשם כך, באמצעות שני בוחנים עצמאיים שלנתח את כל הדגימות באופן עצמאי יכול לעזור כדי למנוע בעיה זו. בעוד הפרוטוקול המתואר כאן נותן תובנה כמה דם יכול להגיע לממשק fetomaternal, זה עשוי להיות יתרון לשלב את זה עם complגישת ementary של בחינת הסכום הכולל של דם בכל זמן נתון בכלי הדם דרך הפלסטיק מטילה 16. כוחו של פרוטוקול זה הוא שהוא משלב שתי גישות עצמאיות. שינוי בכלי דם הוא ראשון להעריך כמותית ידי stereology והתוצאה מכן תוקף איכותי באמצעות אימונוהיסטוכימיה. האמינות של התוצאות ניתן לחזק עוד יותר על ידי באופן אקראי, הדגימות. הדגימות מוכנות לפרוטוקול זה יכול לשמש בקלות גם לחקור פרמטרים אחרים של הריון כגון decidualisation, פיתוח כולל הלימפה mesometrial של הריון (MLAp) או immunodetection של תאים של עניין, כדי להעריך את הפנוטיפ הריון בקפדנות בmidgestation. שיפוץ עורקים הוא שלב קריטי להריונות לא מסובכים בנשים וכישלון של שינויים אלה בבסיס התסמונות הגדולות יילוד (GOS), כלומר רעלת הריון, הגבלה בגדילת העובר ולידת עובר מת. אנו מציגים כאן טכניקות כדי להעריך פנוטיפ הריון במודלים של עכברים המחקים כמה מאפיינים של הפתופיזיולוגיה של GOS בזהירות.

חילופי חומרים מזינים, גזים וחומרי פסולת במהלך הריון eutherian מתווך על ידי השליה. במערכת הרבייה הנשית, עורקי הרחם הם הצינורות העיקריים של דם אל הרחם. לאחר השתלה, סניף אלה לתוך כלי מיוחד הנקרא עורקי ספירלה שסליל דרך basalis decidua ליחידת fetoplacental. קוטר ואלסטיות של עורקי ספירלה אלה, אשר מוקפים בלויקוציטים, בתאים מסוימים רוצח טבעי רחם (אונק), להכתיב נפח ומהירות של דם זמין ל1,2 השליה. שינויים המודינמית נכונים כתוצאה משיפוץ של עורקי הספירלה הם קריטיים להצלחת הריון. בעוד המנגנונים שונים בפירוט בין אדם והריון עכברי, התוצאה הסופית של תהליך שיפוץ בשני המינים הוא כלי דם מורחבים, גבוה מוליכות שמאבדים את שכבת שריר החלק שלה. בעכברים, אונק תא הנגזר אינטרפרון (IFγ N-) הוא הכרחי כדי לגרום לשינויים אלה בסביבות אמצע ההריון-3-5. עכברים שחסרים או תאים או רכיבים של מסלול איתות IFN-γ NK לא מצליחים לעבור שינויים אלה וזה קשור ל6,7 גדילת העובר מופחת, והדגיש את החשיבות של אספקת דם הולמת ליחידת fetoplacental. במהלך ההריון אנושי מוקדם, פלישת ביניים וendovascular של trophoblast extravillous והאינטראקציה שלהם עם תאים אונק חשובות לגרימת שינויים בכלי הדם וקידום 8-10 גדילת העובר. תאים אונק יכולים לתזמר פלישת trophoblast אדם באמצעות כמוקינים 11 וציטוקינים כגון מקרופאג granulocyte - גורם המושבה גירוי (GM-CSF) 12. פלישת trophoblast רדודה קשורה לסיבוכי שיפוץ עורקים והריון מופחתים כגון רעלת הריון 9. פרוטוקול זה מבוסס על עבודתו החלוצית של אנה Croy שתאר חשובתפקידה של מערכת החיסון וIFN-γ במיוחד נגזר NK לשיפוץ מוצלח של כלי דם באמצעות ניסויי אימונוהיסטוכימיה והעברה אלגנטית 5,13. כאן אנו מתארים את דרך מהירה וחסכונית כדי להעריך את מצב שיפוץ של עורקי ספירלה. למרות שהמעבדה שלנו מעריכה באופן שגרתי הזה באמצע ההריון (יום הריון (ה &#39;) 9.5) 14, תהליך שיפוץ מתקיים בין gd8.5 ו12.5 15. כניסתו של סורקי שקופיות אוטומטיים יש להקל באופן משמעותי את ההערכה של אזורי כלי ולומן מסעיפים ומצאנו את זה כדי להיות גישה לשחזור יותר מאשר מדידת קטרי כלי. התוספת של זיהוי immunohistochemical של SMA מאפשרת לאימות ישירה של התוצאות שהתקבלו מהערכת stereological. כמו בכל טכניקות stereological, מומלץ לבצע ההערכה כניסוי מסונוור לפחות שני בוחנים. לשם כך, ניתן הציג צעד אקראי כאשר סדרתי לחתוךטינג הדגימות כך שהחוקרים להעריך את השקופיות לא יודעים שמקבוצת ניסוי הדגימות לבוא. המטרה הכללית של פרוטוקול זה היא לספק כלי אמין כדי להעריך בזהירות את שיפוץ של עורקים סליליים בעכברים עם גנוטיפים אימהיים ואבהיים מוגדרים, בהקשר של מודלים עכבר לסיבוכים הקשורים להריון. התוצאות מדגישות את התלות בתאים אונק של תהליך זה, שהוא חיוני לצמיחה תקינה של העובר.

<table><tbody><tr><td>C57BL/6 mice (8-12 weeks old)</td><td>Charles River</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dental floss</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polystyrene</td><td></td><td></td><td>Used for holding tissue in place</td></tr><tr><td>Straight dissection scissors</td><td>EMS</td><td>72940</td><td></td></tr><tr><td>25 G needles</td><td>BD&amp;nbsp;</td><td>300600</td><td>Used for holding tissue in place</td></tr><tr><td>50 ml conical tubes</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Formalin solution, neutral buffered, 10%</td><td>Sigma</td><td>HT501128-4L</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline</td><td>Sigma</td><td>P3813-10PAK</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sigma</td><td>32221-2.5L</td><td></td></tr><tr><td>Paraffin</td><td>Sigma</td><td>327204-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>Fisher Scientific</td><td>X/0250/17</td><td></td></tr><tr><td>Automated tissue processor</td><td>Sakura</td><td>6032</td><td></td></tr><tr><td>Microtome</td><td>Leica</td><td>RM2245</td><td></td></tr><tr><td>Slide rack</td><td>Sigma</td><td>Z710989</td><td></td></tr><tr><td>Coplin jar</td><td>Sigma</td><td>S5891</td><td></td></tr><tr><td>Purified water</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hematoxylin solution, Gill No. 3</td><td>Sigma</td><td>GHS332-1L</td><td></td></tr><tr><td>Eosin Y solution</td><td>Sigma</td><td>HT110116-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Fume hood</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xylene-based mounting media</td><td>VWR</td><td>361254D</td><td></td></tr><tr><td>Slide scanner</td><td>Hamamatsu</td><td>NanoZoomer</td><td></td></tr><tr><td>Slide scanner software</td><td>Hamamatsu</td><td>NDP viewer</td><td></td></tr><tr><td>Sodium citrate tribasic dihydrate</td><td>Sigma</td><td>32320</td><td>Make 10 mM solution and adjust pH to 6</td></tr><tr><td>Pressure cooker</td><td></td><td></td><td>Used for antigen retrieval</td></tr><tr><td>Heating plate</td><td></td><td></td><td>Used for antigen retrieval</td></tr><tr><td>Hydrophobic barrier pen</td><td>Vector</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>Hydrogen peroxide</td><td>Fisher Scientific</td><td>H/1800/15</td><td></td></tr><tr><td>Tris buffered saline</td><td>Sigma</td><td>T6664-10PAK</td><td></td></tr><tr><td>Mouse on mouse kit</td><td>Vector</td><td>BMK-2202</td><td>Significantly reduces background</td></tr><tr><td>Mouse anti-human smooth muscle actin</td><td>DAKO</td><td>M0851</td><td>Cross-reacts with mouse</td></tr><tr><td>IgG2a isotype control</td><td>DAKO</td><td>X0943</td><td></td></tr><tr><td>Humidified chamber</td><td>Sigma</td><td>H6644</td><td></td></tr><tr><td>3,3&amp;rsquo;-Diaminobenzidine solution</td><td>Sigma</td><td>D4293-5SET</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric acid</td><td>Fisher Scientific</td><td>H/1050/PB17</td><td></td></tr></tbody></table>

assessment of maternal vascular remodeling during pregnancy in the mouse uterus

The placenta mediates the exchange of factors such as gases and nutrients between mother and fetus and has specific demands for supply of blood from the maternal circulation. The maternal uterine vasculature needs to adapt to this temporary demand and the success of this arterial remodeling process has implications for fetal growth. Cells of the maternal immune system, especially natural killer (NK) cells, play a critical role in this process. Here we describe a method to assess the degree of remodeling of maternal spiral arteries during mouse pregnancy. Hematoxylin and eosin-stained tissue sections are scanned and the size of the vessels analysed. As a complementary validation method, we also present a qualitative assessment for the success of the remodeling process by immunohistochemical detection of smooth muscle actin (SMA), which normally disappears from within the arterial vascular media at mid-gestation. Together, these methods enable determination of an important parameter of the pregnancy phenotype. These results can be combined with other endpoints of mouse pregnancy to provide insight into the mechanisms underlying pregnancy-related complications.

Rag2 - / - IL2rg - / - עכברים חסרים כל ימפוציטים הבוגרים, כוללים תאי NK 17, ועורקי הרחם שלהם לא מצליחים לעבור את השינויים בכלי הדם ראו בעכברי C57BL / 6 wildtype congenic (WT) סביב אמצע הריון-5,14. כתוצאה מזה Rag2 המופחת שיפוץ - / - IL2rg - / - עכברים מראים אזורים קטנים יותר באופן משמעותי luminal פני השטח, מעידים על כלי הכוללים קטנים יותר שניתן דמיינו על חלקים מוכתמים-E H &amp; ולכמת stereologically (איור 2). יתר על כן, עובי הדופן יחסית (כלי ליחס לומן) הוא גבוה יותר בעורקי הספירלה בעכברים אלה, המצביע על אספקה ​​מופחתת של דם ומהירות גבוהה יותר בדם. הערכה כמותית זו אושרה באמצעות זיהוי immunohistochemical של SMA. זה אופייני לעכברי WT לאבד את רוב SMA בתקשורת וכלי הדםשל עורקי הספירלה באמצע ההריון. אם תהליך מונחה תא NK זה אינו מתקיים, SMA נשאר בתקשורת של כלי השיט וניתן להבחין בקלות immunohistochemically טבעות סביב כלי הדם (איור 3). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/53534/53534fig1.jpg" /> איור 1: רחם העכבר בgd9.5, סקירה סכמטית ציור המראה את מיקומם היחסי של קרנות רחם, צוואר רחם (הכחול) ועורקים ראשיים רחם (אדום).. הצביע הם הציר של קרן הרחם (חיצים) ונקודות קשירה (חיצים מקווקווים) הארוך. החלקים לאימונוהיסטוכימיה נחתכים לאורך מישור הנוף. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/53534/53534fig2.jpg" /> איור 2:. הערכת Stereological של שיפוץ עורקים באמצע ההריון () דוגמא assessment הלומינל ואזורי כלי מוחלט על סעיפי H &amp; E מוכתמות מנקבות WT ב2/4 המרכזי של basalis decidua (מוגדרת על ידי שחור האנכית קווים מקווקווים) בgd9.5. בכלי בהגדלה גבוהה יותר, האדום קו מקווקו תוחם אזור כלי כולל, קו מקווקו צהוב תוחם אזור לומן. בר = 500 מיקרומטר (משמאל), 50 מיקרומטר (מימין). הציר של הרחם הארוך הוא קו אופקי בכיוון זה. כימות (ב) לאזורי luminal (פנל משמאל) ויחס של שטח luminal לאזור ספינה כולל (פנל מימין) מWT (C57BL / 6) וRag2 - / - Il2rg - / - עכברים (על C57BL / 6 רקע). כל נקודת נתונים מייצגת את הממוצע של 15 מדידות (5 מדידות לכל סעיף, 3 חלקים לאתר השתלה). ברים מייצגים ממוצעים של n = 11-13 אתרי השתלה מ4 הריונות לכל קבוצה; p-ערך ממבחן מאן-וויטני שני זנב, מזווג. WT: wildtype. <img alt = &quot;איור 3&quot; src = &quot;/ קבצים / ftp_upload / 53,534 / 53534fig3.jpg&quot; /&gt; איור 3:. גילוי immunohistochemical של אקטין שריר חלק בbasalis decidua מכתים הנציג SMA על WT (למעלה) וRag2 - / - IL2rg - / - עכברים (על רקע C57BL / 6, תחתונה) בgd9.5. בר = 100 מיקרומטר. WT: wildtype.

Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Maternal Vascular Remodeling During Pregnancy in the Mouse Uterus at JoVE.com

Assessment of Maternal Vascular Remodeling During Pregnancy in the Mouse Uterus

This protocol describes a technique to assess changes in the maternal vasculature during pregnancy in mice. Using stereological methods, remodeling of the decidual spiral arteries is assessed quantitatively and the results confirmed qualitatively using immunohistochemistry.

הערכה של כלי דם אימהי שיפוץ במהלך ההריון ברחם העכבר

The placenta mediates the exchange of factors such as gases and nutrients between mother and fetus and has specific demands for supply of blood from the ...

assessment-maternal-vascular-remodeling-during-pregnancy-mouse

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

13.2K Views.  University of Cambridge. This protocol describes a technique to assess changes in the maternal vasculature during pregnancy in mice. Using stereological methods, remodeling of the decidual spiral arteries is assessed quantitatively and the results confirmed qualitatively using immunohistochemistry. 

Video: Assessment of Maternal Vascular Remodeling During Pregnancy in the Mouse Uterus

Murine Spinotrapezius Model to Assess the Impact of Arteriolar Ligation on Microvascular Function and Remodeling

The murine spinotrapezius is a thin, superficial skeletal support muscle that extends from T3 to L4, and is easily accessible via dorsal skin incision. Its unique anatomy makes the spinotrapezius useful for investigation of ischemic injury and subsequent microvascular remodeling. Here, we demonstrate an arteriolar ligation model in the murine spinotrapezius muscle that was developed by our research team and previously published1-3. For certain vulnerable mouse strains, such as the Balb/c mouse, this ligation surgery reliably creates skeletal muscle ischemia and serves as a platform for investigating therapies that stimulate revascularization. Methods of assessment are also demonstrated, including the use of intravital and confocal microscopy. The spinotrapezius is well suited to such imaging studies due to its accessibility (superficial dorsal anatomy) and relative thinness (60-200 &mu;m). The spinotrapezius muscle can be mounted en face, facilitating imaging of whole-muscle microvascular networks without histological sectioning. We describe the use of intravital microscopy to acquire metrics following a functional vasodilation procedure; specifically, the increase in arterilar diameter as a result of muscle contraction. We also demonstrate the procedures for harvesting and fixing the tissues, a necessary precursor to immunostaining studies and the use of confocal microscopy.

We demonstrate a novel arterial ligation model in murine spinotrapezius muscle, including a step-by-step procedure and description of required instrumentation. We describe the surgery and relevant outcome measurements relating to vascular network remodeling and functional vasodilation using intravital and confocal microscopy.

דגם Spinotrapezius Murine כדי להעריך את ההשפעה של קשירת arteriolar על תפקוד כלי דם וRemodeling

The murine spinotrapezius is a thin, superficial skeletal support muscle that extends from T3 to L4, and is easily accessible via dorsal skin incision. ...

Medicine

A Novel Use of Three-dimensional High-frequency Ultrasonography for Early Pregnancy Characterization in the Mouse

High-frequency ultrasonography (HFUS) is a common method to non-invasively monitor the real-time development of the human fetus in utero. The mouse is routinely used as an in vivo model to study embryo implantation and pregnancy progression. Unfortunately, such murine studies require pregnancy interruption to enable follow-up phenotypic analysis. To address this issue, we used three-dimensional (3-D) reconstruction of HFUS imaging data for early detection and characterization of murine embryo implantation sites and their individual developmental progression in utero. Combining HFUS imaging with 3-D reconstruction and modeling, we were able to accurately quantify embryo implantation site number as well as monitor developmental progression in pregnant C57BL6J/129S mice from 5.5 days post coitus (d.p.c.) through to 9.5 d.p.c. with the use of a transducer. Measurements included: number, location, and volume of implantation sites as well as inter-implantation site spacing; embryo viability was assessed by cardiac activity monitoring. In the immediate post-implantation period (5.5 to 8.5 d.p.c.), 3-D reconstruction of the gravid uterus in both mesh and solid overlay format enabled visual representation of the developing pregnancies within each uterine horn. As genetically engineered mice continue to be used to characterize female reproductive phenotypes derived from uterine dysfunction, this method offers a new approach to detect, quantify, and characterize early implantation events in vivo. This novel use of 3-D HFUS imaging demonstrates the ability to successfully detect, visualize, and characterize embryo-implantation sites during early murine pregnancy in a non-invasive manner. The technology offers a significant improvement over current methods, which rely on the interruption of pregnancies for gross tissue and histopathologic characterization. Here we use a video and text format to describe how to successfully perform ultrasounds of early murine pregnancy to generate reliable and reproducible data with reconstruction of the uterine form in mesh and solid 3-D images.

Mice are widely used to study gestational biology. However, pregnancy termination is required for such studies which precludes longitudinal investigations and necessitates the use of large numbers of animals. Therefore, we describe a non-invasive technique of high-frequency ultrasonography for early detection and monitoring of post-implantation events in the pregnant mouse.

שימוש הרומן של בדיקת אולטרה סאונד בתדירות גבוהה תלת מימדי אפיון בתחילת ההריון העכבר

High-frequency ultrasonography (HFUS) is a common method to non-invasively monitor the real-time development of the human fetus in utero. The mouse is ...

Fetal Mouse Cardiovascular Imaging Using a High-frequency Ultrasound (30/45MHZ) System

Congenital heart defects (CHDs) are the most common cause of childhood morbidity and early mortality. Prenatal detection&#160;of the underlying molecular mechanisms of CHDs is&#160;crucial for inventing new preventive and therapeutic strategies. Mutant mouse models are powerful tools to discover new&#160;mechanisms&#160;and environmental stress modifiers that drive cardiac development and their potential&#160;alteration in CHDs. However, efforts to establish the causality of these putative contributors have been limited to histological&#160;and molecular studies&#160;in non-survival animal experiments, in which&#160;monitoring the key physiological and hemodynamic parameters is&#160;often absent. Live imaging technology has become an essential tool to establish the&#160;etiology of CHDs. In particular,&#160;ultrasound imaging can be used prenatally without surgically exposing the fetuses,&#160;allowing maintaining&#160;their baseline physiology while monitoring the impact of environmental stress&#160;on the hemodynamic and structural aspects of cardiac chamber development. Herein, we use the High-Frequency Ultrasound (30/45)&#160;system to examine the cardiovascular system in fetal mice at E18.5 in utero at the baseline and in response to prenatal hypoxia exposure. We demonstrate the feasibility of the system to measure cardiac chamber size, morphology, ventricular function, fetal heart rate, and umbilical artery flow indices, and their alterations in fetal mice exposed to systemic chronic hypoxia in utero in real time.

Fetal Mouse Cardiovascular Imaging Using a High-frequency Ultrasound 30/45MHZ System

High-frequency ultrasound imaging of the fetal mouse has improved imaging resolution and can provide precise non-invasive characterization of cardiac development and structural defects. The protocol outlined herein is designed to perform real-time fetal mice echocardiography in vivo.

הדמיה באמצעות מערכת סאונד בתדירות גבוהה (30 / 45MHZ) וכלי דם עוברי העכבר

Congenital heart defects (CHDs) are the most common cause of childhood morbidity and early mortality. Prenatal detection&#160;of the underlying molecular ...

High Frequency Ultrasound for the Analysis of Fetal and Placental Development In Vivo

Ultrasound imaging is a widespread method used to detect organ anomalies and tumors in human and animal tissues. The method is non-invasive, harmless, and painless, and the application is easy, fast, and can be done anywhere, even with mobile devices. During pregnancy, ultrasound imaging is standardly used to closely monitor fetal development. The technique is important to assess intrauterine growth restriction (IUGR), a pregnancy complication with short- and long-term health consequences for both the mother and fetus. Understanding the process of IUGR is indispensable for developing effective therapeutic strategies. 
The ultrasound system used in this manuscript is an ultrasound device produced for the analysis of small animals and can be used in various research fields, including pregnancy research. Here we describe the usage of the system for in vivo analysis of fetuses from natural killer (NK) cell/mast cell (MC)-deficient mothers that give birth to growth-restricted pups. The protocol includes preparation of the system, handling of the mice before and during measurements, and the usage of the B-mode, color doppler mode, and pulse-wave doppler mode. Fetal size, placental size, and blood supply to the fetus were analyzed. We found reduced implantation sizes and smaller placentas in NK/MC-deficient mice from mid-gestation onwards. In addition, MC/NK-deficiency was associated with absent and reversed end diastolic flow in the fetal Arteria umbilicalis(UmA) and an elevated resistance index. The methods described in the protocol can easily be used for related and non-related research topics.

High Frequency Ultrasound for the Analysis of Fetal and Placental Development In Vivo

Here we describe the technique of high frequency ultrasound for in vivo analysis of fetuses in mice. This method allows the follow-up of fetuses and the analysis of placental parameters as well as maternal and fetal blood flow throughout pregnancy.

אולטרסאונד בתדירות גבוהה לניתוח של התפתחות עוברית היפרדות In Vivo

Ultrasound imaging is a widespread method used to detect organ anomalies and tumors in human and animal tissues. The method is non-invasive, harmless, and ...

Is My Mouse Pregnant? High-Frequency Ultrasound Assessment

The mouse is the mammalian animal model of choice for many human diseases and biological processes. Developmental biology often requires staged-pregnant mice to determine evolving processes at various timepoints. Moreover, optimal and efficient breeding of model mice requires an assessment of timed pregnancies. Most commonly, mice are mated overnight, and the presence of a vaginal plug is determined; however, the positive predictive value of this technique is suboptimal, and one needs to wait to know if the mouse is truly pregnant. High-resolution ultrasound biomicroscopy is an effective and efficient tool for imaging: 1) Whether a mouse is pregnant; 2) What gestational stage the mouse has reached; and 3) Whether there are intrauterine losses. In addition to the embryos and fetuses, the investigator must also recognize common artifacts in the abdominal cavity so as not to mistake these for a gravid uterus. This article provides a protocol for imaging along with illustrative examples.

High-resolution ultrasound can help streamline experiments requiring timed-pregnant mice by determining the state of pregnancy, gestational age, and pregnancy losses. Presented here is a protocol to illustrate methods to assess mouse pregnancies as well as potential pitfalls (image artifacts) that may mimic pregnancy.

העכבר שלי בהריון? הערכת אולטראסאונד בתדר גבוה

The mouse is the mammalian animal model of choice for many human diseases and biological processes. Developmental biology often requires staged-pregnant ...

Methods for Studying Uterine Contributions to Pregnancy Establishment in an Ovariectomized Mouse Model

For pregnancy to be established, a viable blastocyst must successfully interact with a receptive uterine lining (endometrium) to facilitate implantation and placenta formation and enable ongoing pregnancy. The limitations to pregnancy success caused by embryonic defects are well known and have been largely overcome in recent decades with the rise of in vitro fertilization (IVF) and assisted reproductive technologies. As yet, however, the field has not overcome the limitations caused by an inadequately receptive endometrium, thus resulting in stagnating IVF success rates. Ovarian and endometrial functions are closely intertwined, as hormones produced by the ovary are responsible for the endometrium's menstrual cyclicity. As such, when using rodent models of pregnancy, it can be difficult to ascertain whether an observed result is due to an ovarian or uterine deficit. To overcome this, an ovariectomized mouse model was developed with embryo transfer or artificial decidualization to allow the study of uterine-specific contributions to pregnancy. This article will provide instructions on how to perform ovariectomy and offer insights into various techniques for supplying exogenous hormones to support successful artificial decidualization or pregnancy following embryo transfer from healthy donors. These techniques include subcutaneous injection, slow-release pellets, and osmotic mini pumps. The key advantages and disadvantages of each method will be discussed, enabling researchers to choose the best study design for their specific research question.

Pregnancy establishment is a dynamic process involving complex embryo and uterine crosstalk. The precise contributions of the maternal uterine environment to these processes remain an active area of investigation. Here, detailed protocols are provided to aid in designing in vivo animal models to address these research questions.

שיטות לחקר תרומות הרחם לביסוס הריון במודל עכבר לכריתת שחלות

For pregnancy to be established, a viable blastocyst must successfully interact with a receptive uterine lining (endometrium) to facilitate implantation ...

<meta charset="utf8"></head><body>ניתוח אנגיוגנזה: בדיקת מבחנה להיווצרות צינורות על מטריצת BM

Trophoblast Cell Recovery from Angiogenesis-Tube Formation Assay for Differentiation Marker Expression Analysis

During placenta development, extravillous trophoblast (EVT) cells invade the maternal decidua to remodel the uterine spiral arteries by a process of mesenchymal to endothelial-like transition. Traditionally, this process is evaluated by an in vitro tube-formation assay, where the cells organize themselves into tube-like structures when seeded over a polymerized basement membrane preparation. Although several structural features can be measured in photomicrographs of the structures, to assess the real commitment of EVT to the endothelial-type phenotype, biochemical analysis of cell extracts is required. Scraping the cells from the culture dish to obtain RNA and/or protein extracts is not an alternative since the tube-like structures are severely contaminated by the bulk of proteins from the polymerized basement membrane. Thus, a strategy to separate the cells from the basement membrane proteins prior to the preparation of cell extracts is needed. Here, a simple, fast, and cost-effective method to recover the tube-like structures from the in vitro tube-formation assay and the subsequent analysis by biochemical techniques is presented. Tube-like structures formed by HTR8/SVneo cells, an EVT cell line, were liberated from the polymerized basement membrane by a short incubation with PBS supplemented with ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA). After serial washes, a ready-to-use pellet of purified tube-like structures can be obtained. This pellet can be subsequently processed to obtain RNA and protein extracts. qPCR analysis evidenced the induced expression of VE-cadherin and alphav-integrin, two endothelial cell markers, in EVT-derived tube-like structures compared to control cells, which was consistent with the induction of the endothelial cell marker, CD31, evaluated by immunofluorescence. Western blot analysis of the tube-like structures' protein extracts revealed the overexpression of RECK in transfected HTR8/SVneo cells. Thus, this simple method allows to obtain cell extracts from the in vitro tube-formation assay for the subsequent analysis of RNAs and protein expression.

<meta charset="utf8"></head><body>התאוששות תאי טרופובלסט מבדיקת היווצרות צינורות אנגיוגנזה לניתוח ביטוי סמן התמיינות

The present protocol allows the recovery of tube-like structures formed in the classical in vitro angiogenesis-tube formation assay where cells, such as trophoblast cells, organize in capillary-like structures over a layer of extracellular basement membrane matrix. The recovered structures are used for RNA and protein isolation for various biochemical analyses.

התאוששות תאי טרופובלסט מבדיקת היווצרות צינורות אנגיוגנזה לניתוח ביטוי סמן התמיינות

During placenta development, extravillous trophoblast (EVT) cells invade the maternal decidua to remodel the uterine spiral arteries by a process of ...

Biaxial Basal Tone and Passive Testing of the Murine Reproductive System Using a Pressure Myograph

The female reproductive organs, specifically the vagina and cervix, are composed of various cellular components and a unique extracellular matrix (ECM). Smooth muscle cells exhibit a contractile function within the vaginal and cervical walls. Depending on the biochemical environment and the mechanical distension of the organ walls, the smooth muscle cells alter the contractile conditions. The contribution of the smooth muscle cells under baseline physiological conditions is classified as a basal tone. More specifically, a basal tone is the baseline partial constriction of smooth muscle cells in the absence of hormonal and neural stimulation. Furthermore, the ECM provides structural support for the organ walls and functions as a reservoir for biochemical cues. These biochemical cues are vital to various organ functions, such as inciting growth and maintaining homeostasis. The ECM of each organ is composed primarily of collagen fibers (mostly collagen types I, III, and V), elastic fibers, and glycosaminoglycans/proteoglycans. The composition and organization of the ECM dictate the mechanical properties of each organ. A change in ECM composition may lead to the development of reproductive pathologies, such as pelvic organ prolapse or premature cervical remodeling. Furthermore, changes in ECM microstructure and stiffness may alter smooth muscle cell activity and phenotype, thus resulting in the loss of the contractile force.
In this work, the reported protocols are used to assess the basal tone and passive mechanical properties of the nonpregnant murine vagina and cervix at 4-6 months of age in estrus. The organs were mounted in a commercially available pressure myograph and both pressure-diameter and force-length tests were performed. Sample data and data analysis techniques for the mechanical characterization of the reproductive organs are included. Such information may be useful for constructing mathematical models and rationally designing therapeutic interventions for women&#8217;s health pathologies.

This protocol utilized a commercially available pressure myograph system to perform pressure myograph testing on the murine vagina and cervix. Utilizing media with and without calcium, the contributions of the smooth muscle cells (SMC) basal tone and passive extracellular matrix (ECM) were isolated for the organs under estimated physiological conditions.

בציר הטונים הבזליים ובדיקות פסיביות של מערכת הרבייה מורנה באמצעות לחץ מיוגרף

The female reproductive organs, specifically the vagina and cervix, are composed of various cellular components and a unique extracellular matrix (ECM). ...

הערכה של כלי דם אימהי שיפוץ במהלך ההריון ברחם העכבר

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

דגם Spinotrapezius Murine כדי להעריך את ההשפעה של קשירת arteriolar על תפקוד כלי דם וRemodeling

שימוש הרומן של בדיקת אולטרה סאונד בתדירות גבוהה תלת מימדי אפיון בתחילת ההריון העכבר

הדמיה באמצעות מערכת סאונד בתדירות גבוהה (30 / 45MHZ) וכלי דם עוברי העכבר

אולטרסאונד בתדירות גבוהה לניתוח של התפתחות עוברית היפרדות In Vivo

העכבר שלי בהריון? הערכת אולטראסאונד בתדר גבוה

שיטות לחקר תרומות הרחם לביסוס הריון במודל עכבר לכריתת שחלות

התאוששות תאי טרופובלסט מבדיקת היווצרות צינורות אנגיוגנזה לניתוח ביטוי סמן התמיינות

התאוששות תאי טרופובלסט מבדיקת היווצרות צינורות אנגיוגנזה לניתוח ביטוי סמן התמיינות

התאוששות תאי טרופובלסט מבדיקת היווצרות צינורות אנגיוגנזה לניתוח ביטוי סמן התמיינות

בציר הטונים הבזליים ובדיקות פסיביות של מערכת הרבייה מורנה באמצעות לחץ מיוגרף