The authors would like to thank all members of the Colucci lab for helpful discussions. This work was funded by The Wellcome Trust [094073/Z/10/Z], The Centre for Trophoblast Research and The British Heart Foundation.

Bu yazıda ele alınan tüm prosedürler İngiltere Home Office yönetmeliklerine uygun olarak ve Cambridge Etik İnceleme Heyeti tarafından onaylanmıştır. 1. Numune Toplama <ol><li> Öğleden sonra (erkek başına 2 kadın kadar) yetişkin erkekler ile 8-12 haftalık dişi C57BL / 6 fareler kullanarak zamanlanmış çiftleşmesi ayarlayın. Erken ertesi günlerde sabah çiftleşme işareti olarak vajinal fişler varlığını kontrol edin. Sabah işaretleri gd0.5 bir tamponun varlığı. </li><li> Gd9.5 günü, servikal dislokasyon ile hayvan euthanize ve karın boşluğunu açın. Vazodilatasyon neden olabilir CO 2 ile o ötenazi unutmayın. </li><li> Yavaşça rahim atardamarları (Şekil 1, kesikli oklar) bağlanması için diş ipi kullanın. Serviks etrafında yanı sıra yumurtalıklarda her uterin boynuz, proksimal ucundaki arterlerin etrafında ipi bağla. Not: Bu çökmüş arterlerde yol açabileceği damarları rüptürü etmeyin. </li> &lt;li&gt; rahim boynuzları ve serviks ucunda üç ligasyon noktalarına distalde tüm uterusu eksize, diseksiyon makas kullanarak hızlı rahim parçalara ayır. </li><li> Her iki boynuz serviksten karşıt yönlerde aynı uzun eksen boyunca hizalanır, böylece hazırlanmış bir polistiren parça rahim yerleştirin. Yavaşça germek ve 2-3 25 G iğneler kullanılarak yerine pin. </li><li> Bir hazırlanan 50 ml konik tüp içine polistiren daldırın. % 10 formalin ile 50 ml&#39;ye tamamlayın. Oda sıcaklığında 5-6 saat için düzelt. </li><li> Formalin çözeltisi atın ve 5 dakika boyunca 50 ml 1 x fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ile değiştirin. </li><li> , Merkezde servikse proksimale her bir ucunda ligasyonu noktasına ve proksimale iki rahim boynuzları tüketim implantasyon siteleri etrafında herhangi bir aşırı yağ uzak trim ve formalin izlerini silmek için 5 dakika boyunca PBS içinde iki kez yıkayın. </li><li> Işlenene kadar (iki hafta), 4 ° C &#39;de% 70 etanol içinde örnekleri saklayın. DİKKAT: EthAnole oldukça yanıcı. </li><li> . Tablo 1 &#39;de belirtilen parametreler kullanılarak otomatik bir işleme sistemine kullanarak rahim uzun eksenine dik bir düzlem boyunca kesilebilir ve böylece parafin içinde tek tek boynuz gömün. Bu, her bir implantasyon yeri maksimum alan blok (Şekil 2A) ortasına analizi için maruz garanti eder. İSTEĞE BAĞLI: istenirse, bu blok rasgele dağıtım için uygun bir zaman noktasıdır. </li><li> Bir mikrotom kullanarak, bloklar 7 mikron kalınlığında seri kesitler halinde kesilmiştir. Hematoksilen ve eozin ile her 49 mikron aralıklarla bir bölüm Leke (H &amp; E, bölüm 2.1). SMA boyama ve diğer downstream uygulamalar için oda sıcaklığında kalan bölümleri saklayın. </li></ol><table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:99px;"> Çözüm </td><td style="width:43px;"> Zaman<html></td><td style="width:97px;"> Isı </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> % 70 Etanol </td><td> 1 saat </td><td> 40 ° C </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> % 100 Etanol </td><td> 1 saat </td><td> 40 ° C </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> % 100 Etanol </td><td> 1 saat </td><td> 40 ° C </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> % 100 Etanol </td><td> 1 saat </td><td> 40 ° C </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> % 100 Etanol </td><td> 1 saat </td><td> 40 ° C </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> % 100 Etanol </td><td> 1 saat </td><td> 40 ° C </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> % 100 Etanol </td><td> 1 saat </td><td> 40 ° C </td></tr><tr height="21">: 21px; &quot;&gt; Ksilen </td><td> 1 saat </td><td> 40 ° C </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> Ksilen </td><td> 1 saat </td><td> 40 ° C </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> Ksilen </td><td> 1 saat </td><td> 40 ° C </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> Parafin </td><td> 1 saat </td><td> 63 ° C </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> Parafin </td><td> 1 saat </td><td> 63 ° C </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> Parafin </td><td> 1 saat </td><td> 63 ° C </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;"> Parafin </td><td> 1 saat </td><td> 63 ° C </td></tr></tbody></table> Tablo 1:. Rahim dokusunun işlenmesi için kullanılan ayar otomatik doku işleme Ayarlar Genel Bakış 2. Stereological Değerlendirme <ol><li> H &amp; E Boyama <ol><li> Oda sıcaklığında 10 dakika için% 100 iksilen banyosuna bir slayt rafa monte slaytlar daldırılması ile Deparaffinize bölümleri. DİKKAT: Ksilen yanıcı ve temas ve solunması yoluyla toksik bir şüpheli kanserojen olduğunu. Bu çalışma kişisel koruyucu donanım (KKD) kullanarak, bir davlumbaz yapılmalıdır. </li><li> Bir 10 dakika daha temiz bir ksilen içeren banyosunda slaytlar bırakın. </li><li> Sırayla 5 dakika her biri için,% 100 etanol,% 95 etanol,% 70 etanol ve arı su içeren banyolarında slaytlar bırakın. </li><li> 5 dakika boyunca, saflaştırılmış su ile seyreltilmiş,% 50 Gill Resim 3 hematoksilin çözeltisi slaytlar bırakın. DİKKAT: Hematoxylin yenmesi ve gözlere temas ederek zararlıdır. Işlerken uygun KKE giyin. </li><li> 10 dakika boyunca akan musluk suyu altında bir boyama teknesine slaytlar yıkayın. </li><li> 10 sn için (% 70 etanol içinde% 1 10 M hidroklorik asit),% 1 asit / alkol çözeltisi slaytlar bırakınve akan musluk suyu altında bir boyama teknesine yıkayın. </li><li> 30 sn eozin çözeltisi içinde slaytlar daldırın ve 10 dakika boyunca akan musluk suyu altında bir boyama teknesine yıkayın. </li><li> Bir çeker ocak içinde, ardışık olarak 5 dakika her biri için% 70 etanol,% 95 etanol ve% 100 etanol içeren banyolarında slaytlar bırakın. </li><li> 10 dakika boyunca ksilen içeren banyosunda slaytlar bırakın. </li><li> Dağı bir ksilen bazlı montaj ortam kullanılarak lamelleri. Mikroskop altında slaytlar görselleştirmek önce davlumbaz yatay ve iyice kurutulur. </li></ol></li><li> Gemi Boyutu ve Tadilat Durumu stereolojik Değerlendirilmesi <ol><li> Her implantasyon site için midsagital noktasına yakın olan bölümleri belirler. Fetus ve gelişmekte olan plasenta arasındaki koriyoallantoik eki midsagital noktada iyi bir göstergesi olarak hizmet vermektedir. </li><li> Analiz için midsagital noktasına yakın 49 mikron aralıklarla 3 bölümden seçiniz. Seçilen slaytlar tarayın. Inc önlemek içinDaha fazla çevresel emplantasyon yeri 16 yer gösterilmiştir luding damarlar, her bir implantasyon bölgesine (Şekil 2A) merkez 2/4 üzerinde analiz kısıtlar. </li><li> Lümen boyutunu değerlendirmek için, damarların iç etrafında çizin ve bu şeklin alanını kaydedin. Toplam damar boyutu için, endotel hücreleri, perisitler ve içi lökositler de dahil olmak üzere, kabın dış duvarı etrafında çizin. Not: lümen toplam damar büyüklüğü oranı bir geminin yeniden şekillenme durumu için bir proxy. Gemi bölümü boyunca kesilmiştir düzlem boyunca bobin olarak, bir slayt aynı arter birden kesitleri olabilir. Aynı arterde birden çok kez ölçüm kaçının. </li><li> En büyük ve roundest lümen her implantasyon sitesinde 5 gemilerden ölçümleri kaydedin. Üç kez, her implantasyon yerinin (üç bölüm birbirinden 49 um aralıklı) ölçün. Bu 15 ölçümleri represe ortalamabüyük gemilerin ortalama çapı NTS. </li><li> Bazı örneklerde büyük damarların overrepresentation önlemek için, her implantasyon yeri damarların aynı sayıda ölçer. </li></ol></li></ol> Immunhistokimya ile 3. Nitel Değerlendirme <ol><li> Parafinden arındırma lamların ve Rehidrasyon <ol><li> Oda sıcaklığında 10 dakika için% 100 iksilen banyosuna ısıya dayanıklı bir slayt raf monte slaytlar daldırılması ile Deparaffinize bölümleri. </li><li> Bir 10 dakika daha temiz bir ksilen içeren banyosunda slaytlar bırakın. </li><li> Sırayla 5 dakika her biri için,% 100 etanol,% 95 etanol ve% 70 ve saflaştırılmış su ihtiva eden banyolarında slaytlar bırakın. </li></ol></li><li> Antijen Alma <ol><li> Saflaştırılmış su içinde bir 10 mM sodyum sitrat tamponu hazırlayın ve 10 M hidroklorik asit kullanılarak pH 6 olana kadar ayarlanır. </li><li> Yeterli wat içeren bir iç düdüklü tencerede 400 ml sodyum sitrat tamponu ve yeri ile 600 ml tutabilecek bir ısıya dayanıklı bir kap dolduruner kabın yarısını sular altında etmek. Gevşek kaynar kadar düdüklü tencere ve ısı kapağını takın. </li><li> Yer slayt sodyum sitrat tamponu içine raf ve sıkı düdüklü tencerenin kapağını sabitleyin. Bir kez basınçlı, 3 dakika için kaynamaya bırakın. </li><li> Düdüklü tencere basıncını düşürün ve iç kabı çıkarın. Slaytlar, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca sodyum sitrat tampon maddesi içinde soğumaya bırakın. </li><li> Yıkama 5 dakika boyunca saflaştırılmış su içeren bir banyo içinde kayar. </li><li> Hidrofobik bir bariyer kalem kullanarak bölümleri kuşatmak. </li><li> 5 dakika boyunca PBS içinde daldırarak slaytlar yıkayın. </li></ol></li><li> Endojen peroksidaz ve spesifik olmayan bağlanma bloke <ol><li> Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca nemlendirilmiş bir odada, saflaştırılmış su ile seyreltilmiş% 3 hidrojen peroksit ile bölümleri inkübe edin. DİKKAT: Hidrojen peroksit, gözleri, deriyi ve sindirim üzerine son derece tahriş edicidir. Uygun PPE giyin. </li><li> Fazla hidrojen peroksit solüsyonu kapalı dokunun ve sli yıkamades kez Tris daldırarak 2 dakika her biri için tuz (TBS) tamponlu. </li><li> Fare immünoglobulin imalatçının talimatlarına göre hazırlanmış fare kiti ile ilgili fare bloke edici ayıracı ile bölümleri inkübe edin. </li><li> Yıkama 2 dakika her biri iki kez TBS içinde kayar. </li></ol></li><li> Düz kas aktin immunodeteksiyon <ol><li> (Kitte sağlanan), antikor bir seyreltici çözeltisi hazırlayın ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca bölümlere inkübe veya üreticinin talimatlarına göre aktifleştirilir. </li><li> 1 seyreltin Antikor Seyreltici çözeltisi içinde 100 fare anti-insan düz kas aktini (DAKO M0851). Nihai immunglobulin konsantrasyonu her iki çözümleri eşdeğer olmasını sağlamak, antikor seyreltici çözeltisi içinde fare IgG2a izotip kontrolü sulandırmak. </li><li> Seyreltilmiş antikor veya izotip kontrol çözümleri ile ya aşırı antikor seyreltici çözüm ve kapak bölümleri kapalı dokunun. Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca nemlendirilmiş bir odacıkta inkübe edin. </li><li> Yıkama için TBS iki kez slaytlar2 dakika her. </li><li> Biyotinile edilmiş anti-fare ikincil antikoru ile seyreltilir ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inkübe bölümleri ya da imalatçının talimatlarına göre yöntem. </li><li> Yıkama sırasıyla 2 dakika boyunca bir kez, her TBS ve PBS ile kayar. </li><li> Üreticinin talimatlarına uygun olarak 3,3&#39;-diaminobenzidin (DAB) çözeltisi hazırlayın. DAB çözümü ile bölümleri örtün ve aşırı renk gelişimini önlemek için bölümleri izlemek için sağlanması kadar 4 dakika inkübe edilir. DİKKAT: DAB yanıcı ve temas ve solunması yoluyla toksik bir şüpheli kanserojen olduğunu. Işlerken uygun KKE giyin. </li><li> Boyanmasının istenilen yoğunluğu ulaşıldığında saf su içinde slaytlar bırakın. </li><li> 20 saniye boyunca% 50 Gill No. 3 hematoksilen ile Counterstain ve su berrak bitene kadar akan musluk suyu altında bir boyama teknesine yıkayın. </li></ol></li><li> Dehidrasyon ve Montaj <ol><li> Davlumbaz içinde sırayla% 70 ETH içeren banyolarında slaytlar batırmayınAnole,% 95 etanol ve 5 dakika her biri için,% 100 etanol. </li><li> 10 dakika boyunca ksilen içeren banyosunda slaytlar bırakın. </li><li> Dağı bir ksilen bazlı montaj ortam kullanılarak lamelleri. Önceden mikroskop altında slaytlar görselleştirmek için bir çeker ocak içinde yatay olarak ve iyice kurutulur </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Burton, G. J., Woods, A. W., Jauniaux, E., Kingdom, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rheological+and+physiological+consequences+of+conversion+of+the+maternal+spiral+arteries+for+uteroplacental+blood+flow+during+human+pregnancy.">Rheological and physiological consequences of conversion of the maternal spiral arteries for uteroplacental blood flow during human pregnancy.</a> Placenta. 30 (6), 473-482 (2009).</li><li>Pijnenborg, R., Vercruysse, L., Hanssens, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+uterine+spiral+arteries+in+human+pregnancy:+facts+and+controversies.">The uterine spiral arteries in human pregnancy: facts and controversies.</a> Placenta. 27 (9-10), 939-958 (2006).</li><li>Ashkar, A. A., Croy, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon-gamma+contributes+to+the+normalcy+of+murine+pregnancy.">Interferon-gamma contributes to the normalcy of murine pregnancy.</a> Biol Reprod. 61 (2), 493-502 (1999).</li><li>Ashkar, A. A., Croy, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functions+of+uterine+natural+killer+cells+are+mediated+by+interferon+gamma+production+during+murine+pregnancy.">Functions of uterine natural killer cells are mediated by interferon gamma production during murine pregnancy.</a> Semin Immunol. 13 (4), 235-241 (2001).</li><li>Ashkar, A. A., Di Santo, J. P., Croy, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon+gamma+contributes+to+initiation+of+uterine+vascular+modification,+decidual+integrity,+and+uterine+natural+killer+cell+maturation+during+normal+murine+pregnancy.">Interferon gamma contributes to initiation of uterine vascular modification, decidual integrity, and uterine natural killer cell maturation during normal murine pregnancy.</a> J Exp Med. 192 (2), 259-270 (2000).</li><li>Ashkar, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+requirements+for+IL-15+and+IFN+regulatory+factors+in+uterine+NK+cell+differentiation+and+function+during+pregnancy.">Assessment of requirements for IL-15 and IFN regulatory factors in uterine NK cell differentiation and function during pregnancy.</a> J Immunol. 171 (6), 2937-2944 (2003).</li><li>Barber, E. M., Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+uterine+NK+cell+population+requires+IL-15+but+these+cells+are+not+required+for+pregnancy+nor+the+resolution+of+a+Listeria+monocytogenes+infection.">The uterine NK cell population requires IL-15 but these cells are not required for pregnancy nor the resolution of a Listeria monocytogenes infection.</a> J Immunol. 171 (1), 37-46 (2003).</li><li>Colucci, F., Boulenouar, S., Kieckbusch, J., Moffett, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+does+variability+of+immune+system+genes+affect+placentation.">How does variability of immune system genes affect placentation.</a> Placenta. 32 (8), 539-545 (2011).</li><li>Pijnenborg, R., Vercruysse, L., Brosens, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+placentation.">Deep placentation.</a> Best Pract Res Clin Obstet Gynaecol. 25 (3), 273-285 (2011).</li><li>Colucci, F., Kieckbusch, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+uterine+natural+killer+cells+nurture+fetal+growth:+in+medio+stat+virtus.">Maternal uterine natural killer cells nurture fetal growth: in medio stat virtus.</a> Trends Mol Med. 21 (2), 60-67 (2015).</li><li>Hanna, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decidual+NK+cells+regulate+key+developmental+processes+at+the+human+fetal-maternal+interface.">Decidual NK cells regulate key developmental processes at the human fetal-maternal interface.</a> Nat Med. 12 (9), 1065-1074 (2006).</li><li>Xiong, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+uterine+NK+cell-activating+receptor+KIR2DS1+enhances+placentation.">Maternal uterine NK cell-activating receptor KIR2DS1 enhances placentation.</a> J Clin Invest. 123 (10), 4264-4272 (2013).</li><li>Croy, B. A., Zhang, J., Tayade, C., Colucci, F., Yadi, H., Yamada, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+uterine+natural+killer+cells+in+mice.">Analysis of uterine natural killer cells in mice.</a> Methods Mol Biol. 612, 465-503 (2010).</li><li>Kieckbusch, J., Gaynor, L. M., Moffett, A., Colucci, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MHC-dependent+inhibition+of+uterine+NK+cells+impedes+fetal+growth+and+decidual+vascular+remodelling.">MHC-dependent inhibition of uterine NK cells impedes fetal growth and decidual vascular remodelling.</a> Nat Commun. 5, (2014).</li><li>Zhang, J., Chen, Z., Smith, G. N., Croy, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+killer+cell-triggered+vascular+transformation:+maternal+care+before+birth.">Natural killer cell-triggered vascular transformation: maternal care before birth.</a> Cell Mol Immunol. 8 (1), 1-11 (2010).</li><li>Adamson, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+between+trophoblast+cells+and+the+maternal+and+fetal+circulation+in+the+mouse+placenta.">Interactions between trophoblast cells and the maternal and fetal circulation in the mouse placenta.</a> Dev Biol. 250 (2), 358-373 (2002).</li><li>Colucci, F., Soudais, C., Rosmaraki, E., Vanes, L., Tybulewicz, V. L. J., Di Santo, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+NK+cell+development+using+a+novel+alymphoid+mouse+model:+Investigating+the+role+of+the+c-abl+proto-oncogene+in+murine+NK+cell+differentiation.">Dissecting NK cell development using a novel alymphoid mouse model: Investigating the role of the c-abl proto-oncogene in murine NK cell differentiation.</a> J Immunol. 162 (5), 2761-2765 (1999).</li><li>Hu, D., Cross, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ablation+of+Tpbpa-positive+trophoblast+precursors+leads+to+defects+in+maternal+spiral+artery+remodeling+in+the+mouse+placenta.">Ablation of Tpbpa-positive trophoblast precursors leads to defects in maternal spiral artery remodeling in the mouse placenta.</a> Dev Biol. 358 (1), 231-239 (2011).</li><li>Zhang, J. H., Croy, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+Ultrasonography+to+Define+Fetal-Maternal+Relationships:+Moving+from+Humans+to+Mice.">Using Ultrasonography to Define Fetal-Maternal Relationships: Moving from Humans to Mice.</a> Comparative Med. 59 (6), 527-533 (2009).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Burada sunulan protokolü başarılı gebelik için gerekli olan damar değişiklikleri değerlendirmek için bir tekrarlanabilir bir yöntem sağlamak üzere tasarlanmıştır. Bu değerlendirme başarısı için kritik doku bölümleri kalitesidir. Her ikisi de doğru güvenilir uterin arterler önemli adımlardır bağlanarak yanı sıra implantasyon sitelerinin gebelik yaşını belirleyen. Vb tespitin zamanında, doku işleme protokolü gibi parametrelerde değişiklikler de sonucu etkileyebilir. Tarafsız bir stereolojik değerlendirme için, her implantasyon sitede gemilerin aynı sayıda ölçmek için önemlidir. Bu implantasyon yeri ve üç kez her implantasyon bölge başına 5 damarları ölçülmesi tavsiye edilir. Bu 15 ölçümün ortalama 5 büyük gemilerin ortalama boyutunu gösterir. / - - IL2rg - Daha fazla alymphoid Rag2 verilerine / - fareler Burada gösterilen, biz bu Prot bulunduinhibe NK hücreleri 14 dahil bir vasat maternal bağışıklık fonksiyonunun bir model, bir dizi için yararlı ocol. Arteryel yeniden bozuklukları da bozulmuş trofoblast invazyonu 18 modellerinde gösterilmiştir ve burada tarif edilen teknikler bu durumlarda damar değerlendirmek için yararlı olabilir. Bu optimize edilmiş ve fare orta-gebelikte desidual vasküler yeniden incelenmesi için bu protokolü geçerliliği, fakat diğer model sistemlerinde (örneğin sıçan) ya da diğer organlarda çalışmak için bu protokolü adapte de düşünülebilir. Biz NK-bağımlı biçimlenme sağlam gd9.5 değerlendirilebilir edilebilir bulurken, bu tür anne damar tamamen yenilenmiş olan gd12.5 gibi diğer zaman noktaları için tadil edilebilir. Bu zaman noktasında, trofoblastik istilası 16 daha derin ve bu zaman noktası, damar değişimlerinin trofoblast rolü araştırmalar için daha uygun olabilir. Ek niceliksel okumalar istenirse,Araştırmacılar ayrıca SMA için boyanan kesitler sayısını artırmak ve her implantasyon site içinde kısmen yenilenmiş damarların yüzdesini değerlendirmek olabilir. Bu protokolün bir sınırlama histolojik muayene açıklayıcı doğasıdır. Fonksiyonel tahliller, ancak, sadece yavaş yavaş (örneğin Doppler ultrasonografi 19 gibi) kullanılabilir hale gelmektedir. Bu teknikler, teknik uzmanlık ve edinme ve ekipmanları korumak için çok daha yüksek masraflar gerektirir, ancak histolojik olarak görülebilir değişikliklerin etkisi için in vivo okuma bir Boyuna sağlama avantajına sahiptir. Tüm stereolojik sınavlar olası bir dezavantajı araştırmacıların öznellik olduğunu. Bu amaçla, bağımsız tüm numuneleri analiz iki bağımsız denetçilerini kullanarak bu sorunu önlemek için yardımcı olabilir. Burada özetlenen protokol fazla kan Fetomaternal arayüzü ulaşabilir nasıl fikir verir iken, bunu compl ile birleştirmek avantajlı olabilirplastik üzerinden damar herhangi bir zamanda kan miktarını değerlendirmek ementary yaklaşımı 16 düşürdü. Bu protokolün gücü, bağımsız iki yaklaşım birleştirmesidir. Vasküler değişim ilk olarak niceliksel stereology tarafından değerlendirilir ve sonuç daha sonra immünohistokimya kullanılarak nitel doğrulanır. Sonuçların güvenilirliği daha da örnekleri rastgele güçlenmiştir edilebilir. Bu protokol için hazırlanan numuneler de kolayca titizlikle midgestation bir hamilelik fenotip değerlendirmek için, bu tür decidualisation, gebelik (MLAp) veya ilgi hücrelerin İmmuno mesometrial lenfoid agrega gelişme olarak gebeliğin diğer parametreleri incelemek için kullanılabilir. Arter remodeling kadın ve bu değişikliklerin başarısızlık komplike gebeliklerde önemli bir adımdır harika obstetrik sendromlar (GOS), yani pre-eklampsi, fetal büyüme kısıtlaması ve temelini iseölü doğum. Biz dikkatle GOS patofizyolojisi bazı özelliklerini taklit fare modellerinde bir hamilelik fenotip değerlendirmek için burada teknikleri sunuyoruz.

Eutherian Gebelikte besin, gaz ve atık ürünlerin değişimi plasenta aracılık eder. Kadın üreme sisteminde, uterin arterler rahim kan ana kanallar vardır. Yerleştirildikten sonra özel gemiler içine bu şube fetoplasental üniteye doğru desidua bazalisin aracılığıyla kangal spiral arterler denir. Çap ve özellikle rahim doğal öldürücü (UNK) hücrelerinde, lökositler çevrili olan bu spiral arterlerin, esnekliği, plasenta 1,2 hacim ve mevcut kan hızını dikte. Spiral arterlerin yeniden bir sonucu olarak doğru hemodinamik değişiklikler gebelik başarısı için kritik öneme sahiptir. Altında yatan mekanizmalar insan ve fare gebelik arasındaki detaylı farklılık olsa da, her iki türün de yeniden şekillenme sürecinin nihai sonucu kendi düz kas tabakasını kaybeder dilate, yüksek iletkenlik damar olduğunu. Farelerde, Unk (IF interferon hücresinden türetilmişN-) γ yaklaşık orta gebelik 3-5, bu değişiklikler uyarması gereklidir. NK hücreleri veya IFN-γ sinyal yolunun bileşenlerini ya yoksun fareler bu değişiklikleri geçmesi başarısız ve bu fetoplasental üniteye yeterli kan akımının önemini vurgulayarak, azalmış fetal büyüme 6,7 ile ilişkilidir. Erken insan Gebelik sırasında, interstisyel ve endovasküler trofoblast extravillous işgali ve Unk hücreleri ile etkileşimi damar değişiklikleri uyaran ve fetal büyüme 8-10 teşvik etmek için önemlidir. Unk hücreleri, granülosit makrofaj gibi kemokinler ve sitokinler 11 aracılığıyla insan trofoblast invazyonu orkestra olabilir - koloni uyarıcı faktör (GM-CSF) 12. Sığ trofoblast invazyonu gibi pre-eklampsi 9 olarak azaltılmış arter remodeling ve gebelik komplikasyonları ile ilişkilidir. Bu protokol önemli açıklanan Anne Croy öncü çalışmalar dayanmaktadırimmunhistokimya ve zarif transfer deneyleri 5,13 ile başarılı vasküler remodeling için bağışıklık sistemi ve özellikle NK-türevli IFN-y rolü. Burada spiral arterlerin yeniden şekillenme durumunu değerlendirmek için hızlı ve ekonomik bir şekilde açıklayın. Bizim laboratuvar rutin orta gebelik (gebelik gününde (gd) 9.5) 14 bu değerlendirmektedir rağmen, yeniden şekillenme süreci gd8.5 12,5 15 arasında yer alır. Otomatik slayt tarayıcıları gelişiyle büyük ölçüde kesimlerinden damar ve lümen alanlarının değerlendirilmesi kolaylaştırmıştır ve bu damar çaplarını ölçmek daha tekrarlanabilir bir yaklaşım olarak bulundu. SMA immünohistokimyasal tespiti eklenmesi stereolojik değerlendirmesinden elde edilen sonuçların basit bir doğrulama için izin verir. Tüm Stereolojik tekniklerin olduğu gibi, en az iki sınav görevlisi tarafından bir kör deney olarak değerlendirmeyi gerçekleştirmek için tavsiye edilir. Seri kesme, bu amaçla, bir rastgele adımı dahil edilebilirting örnekleri slaytları değerlendiren araştırmacılar örneklerin geldiği deney grubu arasından bilmiyorum ki. Bu protokolün genel amacı dikkatle gebelikle ilgili komplikasyonlar için fare modelleri bağlamında tanımlanmış anne ve baba genotipleri ile farelerde spiral arterlerin biçimlenme değerlendirmek için güvenilir bir araç sağlamaktır. Sonuçları normal fetal büyüme için gerekli olan bu sürecin Unk hücreleri bağımlılığı stres.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="704">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:212px;">C57BL/6 mice (8-12 weeks old)</td>
			<td style="width:99px;">Charles River</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:283px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Dental floss</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Polystyrene</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td>Used for holding tissue in place</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Straight dissection scissors</td>
			<td style="width:99px;">EMS</td>
			<td style="width:111px;">72940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">25G needles</td>
			<td style="width:99px;">BD&#160;</td>
			<td style="width:111px;">300600</td>
			<td>Used for holding tissue in place</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">50 ml conical tubes</td>
			<td style="width:99px;">Falcon</td>
			<td style="width:111px;">352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:212px;">Formalin solution, neutral buffered, 10%</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">HT501128-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Phosphate buffered saline</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">P3813-10PAK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Ethanol</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">32221-2.5L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Paraffin</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">327204-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:212px;">Xylene</td>
			<td style="width:99px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:111px;">X/0250/17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Automated tissue processor</td>
			<td style="width:99px;">Sakura</td>
			<td style="width:111px;">6032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Microtome</td>
			<td style="width:99px;">Leica</td>
			<td style="width:111px;">RM2245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Slide rack</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">Z710989</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Coplin jar</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">S5891</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Purified water</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:212px;">Hematoxylin solution, Gill No. 3</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">GHS332-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:212px;">Eosin Y solution</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">HT110116-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Fume hood</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Xylene-based mounting media</td>
			<td style="width:99px;">VWR</td>
			<td style="width:111px;">361254D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Slide scanner</td>
			<td style="width:99px;">Hamamatsu</td>
			<td style="width:111px;">NanoZoomer</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Slide scanner software</td>
			<td style="width:99px;">Hamamatsu</td>
			<td style="width:111px;">NDP viewer</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:212px;">Sodium citrate tribasic dihydrate</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">32320</td>
			<td>Make 10 mM solution and adjust pH to 6</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Pressure cooker</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td>Used for antigen retrieval</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Heating plate</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td>Used for antigen retrieval</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Hydrophobic barrier pen</td>
			<td style="width:99px;">Vector</td>
			<td style="width:111px;">H-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:212px;">Hydrogen peroxide</td>
			<td style="width:99px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:111px;">H/1800/15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Tris buffered saline</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">T6664-10PAK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Mouse on mouse kit</td>
			<td style="width:99px;">Vector</td>
			<td style="width:111px;">BMK-2202</td>
			<td>Significantly reduces background</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:212px;">Mouse anti-human smooth muscle actin</td>
			<td style="width:99px;">DAKO</td>
			<td style="width:111px;">M0851</td>
			<td>Cross-reacts with mouse</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">IgG2a isotype control</td>
			<td style="width:99px;">DAKO</td>
			<td style="width:111px;">X0943</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Humidified chamber</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">H6644</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:212px;">3,3&#8217;-Diaminobenzidine solution</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">D4293-5SET</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:212px;">Hydrochloric acid</td>
			<td style="width:99px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:111px;">H/1050/PB17</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of maternal vascular remodeling during pregnancy in the mouse uterus

The placenta mediates the exchange of factors such as gases and nutrients between mother and fetus and has specific demands for supply of blood from the maternal circulation. The maternal uterine vasculature needs to adapt to this temporary demand and the success of this arterial remodeling process has implications for fetal growth. Cells of the maternal immune system, especially natural killer (NK) cells, play a critical role in this process. Here we describe a method to assess the degree of remodeling of maternal spiral arteries during mouse pregnancy. Hematoxylin and eosin-stained tissue sections are scanned and the size of the vessels analysed. As a complementary validation method, we also present a qualitative assessment for the success of the remodeling process by immunohistochemical detection of smooth muscle actin (SMA), which normally disappears from within the arterial vascular media at mid-gestation. Together, these methods enable determination of an important parameter of the pregnancy phenotype. These results can be combined with other endpoints of mouse pregnancy to provide insight into the mechanisms underlying pregnancy-related complications.

Rag2 - / - IL2rg - / - fareler, NK hücreleri 17 dahil olmak üzere tüm olgun lenfositler, eksikliği ve uterin arterler orta gebelik 5,14 yaklaşık konjenik vahşi tipli C57BL / 6 (WT) farelerinde görülen vasküler değişimler geçirirler başarısız. Farenin stereolojik H &amp; E boyalı bölümler görsel ve sayısal olabilir genel olarak daha küçük damarların gösterge önemli ölçüde daha küçük lümen yüzey alanları (Şekil 2) gösteren - / - / - - IL2rg bu azaltılmış remodeling Rag2 bir sonucu olarak. Bundan başka, (lümen oranı damar) göreceli duvar kalınlığı azaltılmış kan temini ve yüksek kan hızının öne bu farelerde, spiral arterler daha yüksektir. Bu nicel değerlendirme SMA immünohistokimyasal algılama kullanarak teyit edildi. WT fareler damar medyanın içinde SMA en kaybetmek için bu karakteristikortalarında gebelik ile spiral arterlerin. Bu NK hücresi dayalı süreç yer almaz ise, SMA damarların ortam kalır ve kolaylıkla kan damarları (Şekil 3) etrafında halkalar olarak immünohistokimyasal tespit edilebilir. <img alt="figür 1" src="/files/ftp_upload/53534/53534fig1.jpg" /> Şekil 1: gd9.5 at Fare rahim, rahim boynuzları, serviks (mavi) göreli konumlarını gösteren şematik genel Çizim ve ana uterin arterler (kırmızı).. Rahim boynuzları (oklar) ve ligasyon noktaları (kesikli oklar) uzun ekseni vardır belirtti. Immünohistokimya için bölümler görüş düzlemi boyunca kesilir. <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/53534/53534fig2.jpg" /> Şekil 2:. Ikinci trimesterde arteriyel biçimlenme Stereolojik değerlendirilmesi (A) Örnek assedesidua bazalisin merkezi 2/4 yılında luminal ve WT kadınlardan H &amp; E boyanan kesitler toplam damar alanlarının ssment gd9.5 de (dikey siyah ile çizilmiş kesik çizgiler). Yüksek büyütmede damarlarda, kırmızı çizgi, toplam damar alanı, sarı kesikli çizgi lümen alanı demarcates demarcates kesik. Çubuk = 500 um (sol), 50 um (sağ). Rahim uzun ekseni bu yönde yatay bir çizgidir. WT (C57BL / 6) ve Rag2 toplam damar alanı (sağ panel) luminal alanları (sol panel) ve luminal alanına oranının (B) tayini - / - Il2rg - / - fareler (C57BL / 6 arka plan üzerine). Her veri noktası 15 ölçümlerden (bölüm başına 5 ölçümleri, implantasyon site başına 3 bölüm) ortalamasını temsil etmektedir. Barlar n = grup başına 4 gebelikten 11-13 implantasyon siteleri demek temsil ettiği; iki kuyruklu, eşleştirilmemiş Mann-Whitney testi p-değer. WT: vahşi tip. <img alt = &quot;Şekil 3&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 53534 / 53534fig3.jpg&quot; /&gt; Şekil 3:. Decidua basalis düz kas aktin immünohistokimyasal algılama WT (üst) ve Rag2 ilgili Örnek SMA boyama - / - IL2rg - / - gd9.5 de (C57BL / 6 arka plan üzerinde, alt) fareler. Çubuk = 100 um. WT: vahşi tip.

Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Maternal Vascular Remodeling During Pregnancy in the Mouse Uterus at JoVE.com

Assessment of Maternal Vascular Remodeling During Pregnancy in the Mouse Uterus

This protocol describes a technique to assess changes in the maternal vasculature during pregnancy in mice. Using stereological methods, remodeling of the decidual spiral arteries is assessed quantitatively and the results confirmed qualitatively using immunohistochemistry.

Fare Uterus içinde Gebelikte maternal Vasküler Yaptırma Değerlendirilmesi

The placenta mediates the exchange of factors such as gases and nutrients between mother and fetus and has specific demands for supply of blood from the ...

assessment-maternal-vascular-remodeling-during-pregnancy-mouse

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

13.2K Görüntüleme.  University of Cambridge. This protocol describes a technique to assess changes in the maternal vasculature during pregnancy in mice. Using stereological methods, remodeling of the decidual spiral arteries is assessed quantitatively and the results confirmed qualitatively using immunohistochemistry. 

Video: Assessment of Maternal Vascular Remodeling During Pregnancy in the Mouse Uterus

Functional Manipulation of Maternal Gene Products Using In Vitro Oocyte Maturation in Zebrafish

Cellular events that take place during the earliest stages of animal embryonic development are driven by maternally derived gene products deposited into the developing oocyte. Because these events rely on maternal products which typically act very soon after fertilization-that preexist inside the egg, standard approaches for expression and functional reduction involving the injection of reagents into the fertilized egg are typically ineffective. Instead, such manipulations must be performed during oogenesis, prior to or during the accumulation of maternal products. This article describes in detail a protocol for the in vitro maturation of immature zebrafish oocytes and their subsequent in vitro fertilization, yielding viable embryos that survive to adulthood. This method allows the functional manipulation of maternal products during oogenesis, such as the expression of products for phenotypic rescue and tagged construct visualization, as well as the reduction of gene function through reverse-genetics agents.

Functional Manipulation of Maternal Gene Products Using In Vitro Oocyte Maturation in Zebrafish

An optimized protocol for the in vitro maturation of zebrafish oocytes used for the manipulation of maternal gene products is presented here.

Kullanılması Anne Gen Ürünlerinin Fonksiyonel Manipülasyonu<em&gt; İn Vitro</emZebra balığı&gt; Oosit Olgunlaştırma

Cellular events that take place during the earliest stages of animal embryonic development are driven by maternally derived gene products deposited into ...

Gelişim Biyolojisi

Analysis of Retinoic Acid-induced Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Two and Three-dimensional Embryoid Bodies

Mouse embryonic stem cells (ESCs) isolated from the inner mass of the blastocyst (typically at day E3.5), can be used as in vitro model system for studying early embryonic development. In the absence of leukemia inhibitory factor (LIF), ESCs differentiate by default into neural precursor cells. They can be amassed into a three dimensional (3D) spherical aggregate termed embryoid body (EB) due to its similarity to the early stage embryo. EBs can be seeded on fibronectin-coated coverslips, where they expand by growing two dimensional (2D) extensions, or implanted in 3D collagen matrices where they continue growing as spheroids, and differentiate into the three germ layers: endodermal, mesodermal, and ectodermal. The 3D collagen culture mimics the in vivo environment more closely than the 2D EBs. The 2D EB culture facilitates analysis by immunofluorescence and immunoblotting to track differentiation. We have developed a two-step neural differentiation protocol. In the first step, EBs are generated by the hanging-drop technique, and, simultaneously, are induced to differentiate by exposure to retinoic acid (RA). In the second step, neural differentiation proceeds in a 2D or 3D format in the absence of RA.

We describe a technique for using murine embryonic stem cells for generating two or three dimensional embryoid bodies. We then explain how to induce neural differentiation of the embryoid body cells by retinoic acid, and how to analyze their state of differentiation by progenitor cell marker immunofluorescence and immunoblotting.

İki ve Üç boyutlu Embriyoid Oluşumu Fare Embriyonik Kök Hücreler Retinoik Asit kaynaklı sinir Farklılaşma analizi

Mouse embryonic stem cells (ESCs) isolated from the inner mass of the blastocyst (typically at day E3.5), can be used as in vitro model system for ...

A Novel Mammary Fat Pad Transplantation Technique to Visualize the Vessel Generation of Vascular Endothelial Stem Cells

Endothelial cells (ECs) are the fundamental building blocks of the vascular architecture and mediate vascular growth and remodeling to ensure proper vessel development and homeostasis. However, studies on endothelial lineage hierarchy remain elusive due to the lack of tools to gain access as well as to directly evaluate their behavior in vivo. To address this shortcoming, a new tissue model to study angiogenesis using the mammary fat pad has been developed. The mammary gland develops mostly in the postnatal stages, including puberty and pregnancy, during which robust epithelium proliferation is accompanied by extensive vascular remodeling. Mammary fat pads provide space, matrix, and rich angiogenic stimuli from the growing mammary epithelium. Furthermore, mammary fat pads are located outside the peritoneal cavity, making them an easily accessible grafting site for assessing the angiogenic potential of exogenous cells. This work also describes an efficient tracing approach using fluorescent reporter mice to specifically label the targeted population of vascular endothelial stem cells (VESCs) in vivo. This lineage tracing method, coupled with subsequent tissue whole-mount microscopy, enable the direct visualization of targeted cells and their descendants, through which the proliferation capability can be quantified and the differentiation commitment can be fate-mapped. Using these methods, a population of bipotent protein C receptor (Procr) expressing VESCs has recently been identified in multiple vascular systems. Procr+ VESCs, giving rise to both new ECs and pericytes, actively contribute to angiogenesis during development, homeostasis, and injury repair. Overall, this manuscript describes a new mammary fat pad transplantation and in vivo lineage tracing techniques that can be used to evaluate the stem cell properties of VESCs.

This work demonstrates a novel approach to assess the proliferation, differentiation, and vessel-forming potential of vascular endothelial stem cells (VESCs) through mammary fat pad transplantation followed by whole-mount tissue preparation for microscopic observation. A lineage tracing strategy to investigate the behavior of VESCs in vivo is also presented.

Vasküler Endotelyal Kök Hücrelerin Damar Oluşumunu Görselleştirmek İçin Yeni Bir Göğüs Göğsü Transplantasyon Tekniği

Endothelial cells (ECs) are the fundamental building blocks of the vascular architecture and mediate vascular growth and remodeling to ensure proper ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to cleft secondary palate, a common congenital anomaly in humans. Secondary palate fusion has been extensively studied leading to several proposed cellular mechanisms that may mediate this process. However, these studies have been mostly performed on fixed embryonic tissues at progressive timepoints during development or in fixed explant cultures analyzed at static timepoints. Static analysis is limited for the analysis of dynamic morphogenetic processes such a palate fusion and what types of dynamic cellular behaviors mediate palatal fusion is incompletely understood. Here we describe a protocol for live imaging of ex vivo secondary palate fusion in mouse embryos. To examine cellular behaviors of palate fusion, epithelial-specific Keratin14-cre was used to label palate epithelial cells in ROSA26-mTmGflox reporter embryos. To visualize filamentous actin, Lifeact-mRFPruby reporter mice were used. Live imaging of secondary palate fusion was performed by dissecting recently-adhered secondary palatal shelves of embryonic day (E) 14.5 stage embryos and culturing in agarose-containing media on a glass bottom dish to enable imaging with an inverted confocal microscope. Using this method, we have detected a variety of novel cellular behaviors during secondary palate fusion. An appreciation of how distinct cell behaviors are coordinated in space and time greatly contributes to our understanding of this dynamic morphogenetic process. This protocol can be applied to mutant mouse lines, or cultures treated with pharmacological inhibitors to further advance understanding of how secondary palate fusion is controlled.

Here, we present a protocol for live imaging of mouse secondary palate fusion using confocal microscopy. This protocol can be used in combination with a variety of fluorescent reporter mouse lines, and with pathway inhibitors for mechanistic insight. This protocol can be adapted for live imaging in other developmental systems.

Fare İkincil Palin Füzyonunun Canlı Görüntüsü

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the proteins involved in these pathways are evolutionarily conserved between mammals and other eukaryotes, such as the fruit fly Drosophila melanogaster, suggesting that similar organizing principles exist during the development of these organisms. Importantly, Drosophila has been used extensively to identify cellular and molecular mechanisms regulating processes that are required in mammals including neurogenesis, differentiation, axonal guidance, and synaptogenesis. Flies have also been used successfully to model a variety of human neurodevelopmental diseases. Here we describe a protocol for the step-by-step microdissection, fixation, and immunofluorescent localization of proteins within the adult Drosophila brain. This protocol focuses on two example neuronal populations, mushroom body neurons and retinal photoreceptors, and includes optional steps to trace individual mushroom body neurons using Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM) technique. Example data from both wild-type and mutant brains are shown along with a brief description of a scoring criteria for axonal guidance defects. While this protocol highlights two well-established antibodies for investigating the morphology of mushroom body and photoreceptor neurons, other Drosophila brain regions and the localization of proteins within other brain regions can also be investigated using this protocol.

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

This protocol describes the dissection and immunostaining of adult Drosophila melanogaster brain tissues. Specifically, this protocol highlights the use of Drosophila mushroom body and photoreceptor neurons as example neuronal subsets that can be accurately used to uncover general principles underlying many aspects of neuronal development.

Diseksiyon ve mantar vücut immünfloresan boyama ve yetişkin Drosophila melanogaster beynindeki nöronlar Photoreceptor

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

A Novel Use of Three-dimensional High-frequency Ultrasonography for Early Pregnancy Characterization in the Mouse

High-frequency ultrasonography (HFUS) is a common method to non-invasively monitor the real-time development of the human fetus in utero. The mouse is routinely used as an in vivo model to study embryo implantation and pregnancy progression. Unfortunately, such murine studies require pregnancy interruption to enable follow-up phenotypic analysis. To address this issue, we used three-dimensional (3-D) reconstruction of HFUS imaging data for early detection and characterization of murine embryo implantation sites and their individual developmental progression in utero. Combining HFUS imaging with 3-D reconstruction and modeling, we were able to accurately quantify embryo implantation site number as well as monitor developmental progression in pregnant C57BL6J/129S mice from 5.5 days post coitus (d.p.c.) through to 9.5 d.p.c. with the use of a transducer. Measurements included: number, location, and volume of implantation sites as well as inter-implantation site spacing; embryo viability was assessed by cardiac activity monitoring. In the immediate post-implantation period (5.5 to 8.5 d.p.c.), 3-D reconstruction of the gravid uterus in both mesh and solid overlay format enabled visual representation of the developing pregnancies within each uterine horn. As genetically engineered mice continue to be used to characterize female reproductive phenotypes derived from uterine dysfunction, this method offers a new approach to detect, quantify, and characterize early implantation events in vivo. This novel use of 3-D HFUS imaging demonstrates the ability to successfully detect, visualize, and characterize embryo-implantation sites during early murine pregnancy in a non-invasive manner. The technology offers a significant improvement over current methods, which rely on the interruption of pregnancies for gross tissue and histopathologic characterization. Here we use a video and text format to describe how to successfully perform ultrasounds of early murine pregnancy to generate reliable and reproducible data with reconstruction of the uterine form in mesh and solid 3-D images.

Mice are widely used to study gestational biology. However, pregnancy termination is required for such studies which precludes longitudinal investigations and necessitates the use of large numbers of animals. Therefore, we describe a non-invasive technique of high-frequency ultrasonography for early detection and monitoring of post-implantation events in the pregnant mouse.

Üç boyutlu yüksek frekanslı Ultrasonografi romanı kullanımı için fare erken gebelik karakterizasyonu

High-frequency ultrasonography (HFUS) is a common method to non-invasively monitor the real-time development of the human fetus in utero. The mouse is ...

Ovarian Tissue Culture to Visualize Phenomena in Mouse Ovary

Mammalian females periodically ovulate an almost constant number of oocytes during each estrus cycle. To sustain such regularity and periodicity, regulation occurs at the hypothalamic-pituitary-gonadal axis level and on developing follicles in the ovary. Despite active studies, follicle development mechanisms are not clear because of the several steps involved from the dormant primordial follicle activation to ovulation, and because of the regulation complexity that differs at each follicular stage. To investigate the mechanisms of follicle development, and the dynamics of follicles throughout the estrus cycle, we developed a mouse ovarian tissue culture model that can be used to observe follicle development using a microscope. Systematic follicle development, periodical ovulation, and follicle atresia can all be reproduced in the cultured ovary model, and the culture conditions can be experimentally modulated. Here, we demonstrate the usefulness of this method in the study of the regulatory mechanisms of follicle development and other ovarian phenomena.

Ovarian tissue cultures can be used as models of follicle development, ovulation, and follicle atresia and indicate regulatory mechanisms of dynamic ovarian processes.

Mouse ovarium olayları görselleştirmek için yumurtalık doku kültürü

Mammalian females periodically ovulate an almost constant number of oocytes during each estrus cycle. To sustain such regularity and periodicity, ...

Assessment of Ultrastructural Neuroplasticity Parameters After In Utero Transduction of the Developing Mouse Brain and Spinal Cord

The present study combines in utero transduction with transmission electron microscopy (TEM) aiming at a precise morphometrical analysis of ultrastructural parameters in unambiguously identified topographical structures, affected by a protein of interest that is introduced into the organism via viral transfer. This combined approach allows for a smooth transition from macrostructural to ultrastructural identification by following topographical navigation maps in a tissue atlas. High-resolution electron microscopy of the in-utero-transduced tissue reveals the fine ultrastructure of the neuropil and its plasticity parameters, such as cross-sectioned synaptic bouton areas, the number of synaptic vesicles and mitochondria within a bouton profile, the length of synaptic contacts, cross-sectioned axonal areas, the thickness of myelin sheaths, the number of myelin lamellae, and cross-sectioned areas of mitochondria profiles. The analysis of these parameters reveals essential insights into changes of ultrastructural plasticity in the areas of the nervous system that are affected by the viral transfer of the genetic construct. This combined method can not only be used for studying the direct effect of genetically engineered biomolecules and/or drugs on neuronal plasticity but also opens the possibility to study the in utero rescue of neuronal plasticity (e.g., in the context of neurodegenerative diseases).

The combination of transmission electron microscopy and in utero transduction is a powerful approach for studying morphological changes in the fine ultrastructure of the nervous system during development. This combined method allows deep insights into changes in structural details underlying neuroplasticity with respect to their topographical representation.

Sonra Ultrastructural nöroplastisite parametrelerinde Utero iletim gelişmekte olan fare beyin ve omurilik değerlendirilmesi

The present study combines in utero transduction with transmission electron microscopy (TEM) aiming at a precise morphometrical analysis of ...

Determining Bile Duct Density in the Mouse Liver

Mouse is broadly used as a model organism to study biliary diseases. To evaluate the development and function of the biliary system, various techniques are used, including serum chemistry, histological analysis, and immunostaining for specific markers. Although these techniques can provide important information about the biliary system, they often do not present a full picture of bile duct (BD) developmental defects across the whole liver. This is in part due to the robust ability of the mouse liver to drain the bile even in animals with significant impairment in biliary development. Here we present a simple method to calculate the average number of BDs associated with each portal vein (PV) in sections covering all lobes of mutant/transgenic mice. In this method, livers are mounted and sectioned in a stereotypic manner to facilitate comparison among various genotypes and experimental conditions. BDs are identified via light microscopy of cytokeratin-stained cholangiocytes, and then counted and divided by the total number of PVs present in liver section. As an example, we show how this method can clearly distinguish between wild-type mice and a mouse model of Alagille syndrome. The method presented here cannot substitute for techniques that visualize the three-dimensional structure of the biliary tree. However, it offers an easy and direct way to quantitatively assess BD development and the degree of ductular reaction formation in mice.

We present a rather simple and sensitive method for accurate quantification of bile duct density in the mouse liver. This method can aid in determining the effects of genetic and environmental modifiers and the effectiveness of potential therapies in mouse models of biliary diseases.

Fare karaciğerinde safra kanalı yoğunluğu belirlenmesi

Mouse is broadly used as a model organism to study biliary diseases. To evaluate the development and function of the biliary system, various techniques ...

Vascular Casting of Adult and Early Postnatal Mouse Lungs for Micro-CT Imaging

Blood vessels form intricate networks in 3-dimensional space. Consequently, it is difficult to visually appreciate how vascular networks interact and behave by observing the surface of a tissue. This method provides a means to visualize the complex 3-dimensional vascular architecture of the lung.
To accomplish this, a catheter is inserted into the pulmonary artery and the vasculature is simultaneously flushed of blood and chemically dilated to limit resistance. Lungs are then inflated through the trachea at a standard pressure and the polymer compound is infused into the vascular bed at a standard flow rate. Once the entire arterial network is filled and allowed to cure, the lung vasculature may be visualized directly or imaged on a micro-CT (&#181;CT) scanner.
When performed successfully, one can appreciate the pulmonary arterial network in mice ranging from early postnatal ages to adults. Additionally, while demonstrated in the pulmonary arterial bed, this method can be applied to any vascular bed with optimized catheter placement and endpoints.

The aim of this technique is ex vivo visualization of pulmonary arterial networks of early postnatal and adult mice through lung inflation and injection of a radio-opaque polymer-based compound via the pulmonary artery. Potential applications for casted tissues are also discussed.

Mikro-BT Görüntüleme için Erişkin ve Erken Postnatal Fare Akciğerlerinin Vasküler Döküm

Blood vessels form intricate networks in 3-dimensional space. Consequently, it is difficult to visually appreciate how vascular networks interact and ...