Nous tenons à souligner le soutien de Operational Infrastructure d&#39;appui au programme du gouvernement de Victoria, le schéma de liaison des projets Australian Research Council (avec Agilent Technologies), le Centre de recherche Australian Medical Research Council, la banque du cerveau victorienne, Santé nationale et coopérative pour la santé mentale et la neuroprotéomique établissement.

1. Préparation des tampons et des échantillons <ol><li> Préparer 500 ml de tampon, 200 mM de nitrate d&#39;ammonium pH 7,6 à 7,8 (pH ajusté avec de l&#39; hydroxyde d&#39; ammonium (NH 4 OH)) avec le césium (Cs) et antinomie (Sb) a été ajouté à une concentration finale de 10 parties par milliard. Utilisez le césium et antinomie comme standards internes pour surveiller toute dérive dans la réponse de l&#39;ICP-MS. tampon de filtre avant de l&#39;utiliser à travers un filtre de 0,22 um. </li><li> Préparer l&#39;échantillon en fonction du type d&#39;échantillon: liquide, un tissu ou une culture cellulaire. <ol><li> Pour les échantillons qui ont besoin d&#39; homogénéisation (par exemple, des tissus ou des cellules), veiller à ce qu&#39;elles ne contiennent pas de détergent. Utilisez des tampons Tris pour la préparation des échantillons. Vous pouvez également utiliser des tampons de phosphate , mais ils peuvent avoir une incidence négative sur le metalloproteome au fil du temps ou avec des cycles de gel - dégel 12. </li><li> Homogénéiser les tissus ou de culture de cellules échantillons par Dounce manuel ou sonication pendant 5 minutes en utilisant une solution saline tamponnée au Tris (Tris 50 mM, pH 8,0, chlorure de sodium 150 mM(NaCl) + acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA), les inhibiteurs de protéase libres). </li><li> Clarifier homogénats par centrifugation à 16.000 xg pendant 5 min. Recueillir le surnageant résultant. Conserver les échantillons à 4 ° C. Note: Tous les échantillons doivent être centrifugés avant le chargement dans la chromatographie en phase liquide à haute performance (HPLC) des flacons pour empêcher les particules de bloquer la colonne de chromatographie d&#39;exclusion stérique (SEC). </li></ol></li><li> Normaliser la quantité totale de protéine chargée sur la colonne dans les échantillons. Déterminer les concentrations en protéines à 280 nm en utilisant un micro volume de spectrophotomètre UV 13. Charge comprise entre 20 et 150 pg de protéine. Utiliser des volumes d&#39;injection typiques allant de 2 à 80 pi en fonction de la concentration de l&#39;échantillon. <ol><li> Nettoyer le bras du micro spectrophotomètre UV volume avec de l&#39;eau distillée avant le chargement des échantillons de l&#39;échantillon. Le bras échantillon est l&#39;endroit où les échantillons de protéines sont chargés. </li><li> Blank l&#39;instrument contre 2 pi de the tampon échantillon. Ensuite, la charge 2 pl de chaque échantillon sur le bras et mesurer l&#39;absorbance à 280 nm. </li><li> Déterminer les concentrations. Pour les échantillons bruts de protéines, en utilisant un coefficient d&#39;extinction de 1 Abs = 1 mg / ml. Pour déterminer la concentration de la protéine dans les échantillons, utiliser la loi de Beer-Lambert, A = ε xlxc, où A est l&#39;absorbance, ε est le coefficient d&#39;extinction, l est la longueur de trajet en cm et c est la concentration. </li></ol></li></ol> 2. Analyse en vrac des normes Métalloprotéines Utilisation plasma à couplage inductif - spectrométrie de masse <ol><li> Warm-up et régler l&#39;instrument en utilisant les protocoles du fabricant. </li><li> Une fois que l&#39;instrument est réchauffé et réglé, effectuer vrac ICP-MS. Remarque: Les solutions mères de métalloprotéines purifiées ont généralement besoin d&#39;être dilué avant la mesure. La concentration en métal de la norme peut être estimée à partir de la protéine connue: stochiometries métalliques et la concentra protéine estiméetion. Cette information peut être utilisée pour déterminer la dilution qui sera appropriée pour tomber dans la plage de la courbe standard générée. <ol><li> Diluer normes métalloprotéines, thyroglobuline, ferritine, céruloplasmine, Cu / Zn SOD et de la vitamine B 12, pour qu&#39;ils tombent dans la plage de 0-500 ug / L, utilisant de l&#39; acide nitrique à 1%. Pour atteindre les normes au sein de cette gamme, ne pas utiliser des dilutions supérieures à 1 à 20. Effectuer des dilutions en série dans l&#39;eau pour diluer les actions avant cette si nécessaire. </li><li> Mettre en place l&#39;ordre des injections. Tout d&#39;abord, analyser les niveaux d&#39;étalonnage sept concentrations allant de 0 à 500 ug / L, suivies par les normes de métalloprotéines. Les sept niveaux d&#39;étalonnage sont égaux à 0, 1, 5, 10, 50, 100 et 500 ug / L. </li><li> Sélectionnez des éléments d&#39;intérêt. Ici, utilisez Fe, Cu, Zn, Co et moi, car ils sont les éléments que les normes de protéines sont liés à. Sélectionnez les éléments de la méthode de l&#39;acquisition en ouvrant l&#39;onglet élément de sélection et en ajoutant le eleme<html> nts et leurs masses isotopiques respectifs qui doivent être analysés. </li><li> Effectuer une analyse d&#39;échantillon avec l&#39;instrument et le logiciel de l&#39;appareil crée automatiquement les courbes d&#39;étalonnage pour chacun des éléments d&#39;analyse. Les courbes d&#39;étalonnage sont créés par le logiciel en traçant les comptages / sec du métal détecté contre la quantité de métal que la norme est destinée à contenir, en ug / L. En utilisant les courbes d&#39;étalonnage pour déterminer la concentration du métal dans les échantillons inconnus. Remarque: En utilisant la courbe d&#39;étalonnage, le logiciel détermine la concentration du métal dans chacun des normes de métalloprotéines. </li><li> D&#39;après les résultats d&#39;analyse en vrac, générer un niveau de métalloprotéines qui comprennent les trois oligo-éléments les plus abondants dans les tissus des mammifères en utilisant un mélange de Cu, Zn superoxyde dismutase (SOD) diluée à 200 g / L de cuivre et de zinc et de ferritine (FTN) à une finale concentration de 2,000 mg / L de fer. </li></ol></li></ol>jove_title &quot;&gt; 3. Configuration du système HPLC et Chromatographie d&#39;exclusion stérique Colonne équilibration Remarque: Cette section doit être effectuée en parallèle à la précédente, car ils ont tous deux nécessaires environ 1 à 1,5 heures pour terminer. <ol><li> Les pompes HPLC purge avec du tampon faite à l&#39;étape 1.1 et purger les pompes pendant 5 min à un débit de 5 ml / min de débit. </li><li> Une fois que le système est purgé, régler le débit à 0,1 ml / min et connecter la colonne d&#39;exclusion de taille (4,6 x 300 mm, 3 um, 150 Å). Remarque: Une connexion humide entre le tubage et la colonne évite les bulles d&#39;air étant pris au piège lors de la connexion de la colonne. </li><li> Connectez l&#39;autre extrémité de la colonne au détecteur UV réglé pour mesurer l&#39;absorbance à 280 nm en utilisant un tube de PEEK. </li><li> Augmenter progressivement le débit de la colonne par incréments de de 0,05 à 0,1 ml / min, jusqu&#39;à un débit final de 0,4 ml / min soit atteint. Bien que cela se produit, vérifiez les branchements à la colonne d&#39;éventuelles fuites. Surveiller la pressiondu système pour s&#39;assurer qu&#39;il ne dépasse pas les exigences de colonne en observant la trace de la pression sur le chromatogramme dans le logiciel. </li><li> Laissez la colonne à l&#39;équilibre au débit requis sur 5 - 10 volumes de colonne. Après il est équilibré, relier les instruments pour permettre l&#39;analyse de l&#39;échantillon de se produire. </li><li> Mettre en place la méthode HPLC à pomper le tampon A sur la colonne à 0,4 ml / min pendant 15 min. </li></ol> 4. Configuration et exécution d&#39;exclusion de taille - plasma à couplage inductif - spectrométrie de masse Remarque: les procédures d&#39;exploitation peuvent varier entre les instruments et les modèles. Contactez le spécialiste technique de l&#39;instrument pour en savoir plus sur la façon de configurer l&#39;ICP-MS utilisé. <ol><li> Placez le ICP - MS en mode veille avant de changer le réglage du matériel. <ol><li> Une fois en mode veille, éteignez la communication pour l&#39;échantillonneur automatique et changer l&#39;introduction échantillon à «autre». Remarque: Selon le logiciel et durWare configuration en sélectionnant &quot;HPLC&quot; comme source d&#39;introduction d&#39;échantillon peut être utilisé. Contactez le spécialiste technique de l&#39;instrument pour savoir si cette option est disponible. </li></ol></li><li> Utiliser un tube en PEEK (ID 0,13 mm) pour connecter le flux sortant du détecteur UV directement sur le nébulisateur ICP-MS. </li><li> Puissance sauvegarder l&#39;ICP - MS et laisser l&#39;appareil se réchauffer pendant 10 - 20 min. </li><li> Après le plasma a allumé, connectez le câble à distance de l&#39;ICP - MS à l&#39;arrière de l&#39;échantillonneur automatique de HPLC. Pour ce faire, une fois que le plasma a enflammé; sinon le système HPLC sera automatiquement arrêté depuis le ICP - MS est pas. </li><li> Changer la méthode ICP-MS pour recueillir des données pour LC-ICP-MS. <ol><li> Modifier la méthode de l&#39;acquisition du spectre à l&#39;acquisition de détermination de temps (TRA). </li><li> Sélectionnez les éléments à analyser, Fe, Cu, Zn, Co, I, ainsi que d&#39;autres éléments d&#39;intérêt, et de définir des temps d&#39;intégration (typiquement entre 0,05-0,3 sec). Après les éléments d&#39;intérêt d&#39;unre choisie, régler le temps d&#39;acquisition en fonction du temps d&#39;exécution pour la chromatographie (par exemple, 900 secondes pour une chromatographie run 15 min). </li><li> Réglage manuel du ICP - MS pour l&#39;hélium sensibilité et collision cellulaire (He) des débits de gaz avec le tampon de chromatographie circulant en utilisant Cs et Sb inclus dans le tampon. Les débits sont généralement He ~ 1 ml / min, inférieurs à ceux utilisés pour l&#39;analyse en vrac. Une fois les chiffres d&#39;ions métalliques se sont stabilisés et écart type relatif (RSD) les valeurs sont en dessous de 5%, le système est prêt à l&#39;emploi. </li></ol></li><li> Faire échantillons listes exécuter à la fois des programmes logiciels ICP-MS HPLC et. La liste échantillon d&#39;exécution contient l&#39;ordre dans lequel chacun des échantillons est à injecter ainsi que le nom par lequel les données seront enregistrées. Vérifiez que le nombre total d&#39;échantillons dans le match de la liste entre les deux programmes. </li><li> Démarrez le lot d&#39;échantillons pour l&#39;ICP-MS avant la HPLC, comme l&#39;injection de l&#39;échantillon par la HPLC déclenchera l&#39;ICP - MS pour commencer la collectedonnées. Si cela ne se fait pas dans le bon ordre, il se traduira par des données manquantes. </li><li> Générer des points de courbe d&#39;étalonnage en injectant des volumes variables de la SOD et FTN standard mélangé de 200 ug / L à 6000 ug / L injecté sur colonne pour Cu et Zn et 2000 ug / L à 60 000 ug / L pour Fe. Les volumes d&#39;injection vont de 1 à 30 ul. Note: Ces gammes de concentration comprennent les concentrations de Fe, Cu et Zn, typiquement observés dans des homogénats complexes. Pour les échantillons qui ne contiennent que des protéines purifiées la portée maximale de la courbe doit être ajustée en conséquence. Comme la quantité de métal associée à la protéine peuvent nécessiter une plage inférieure ou supérieure car il y a moins de contamination de l&#39;échantillon d&#39;autres facteurs. </li><li> Analyser chacune de la culture des échantillons inconnus du tissu, du plasma ou de la cellule. </li></ol> 5. Analyse des données, manipulation et visualisation <ol><li> Stocker les données de la valeur séparées par des virgules (csv) format de fichier et charger into Les programmes de traitement selon les besoins. </li><li> Afin de contrôler la dérive de l&#39;instrument, diviser les chiffres par seconde pour chaque élément par les comptes par seconde soit pour Cs ou Sb. </li><li> Générer des courbes d&#39;étalonnage pour chacun des éléments. <ol><li> Déterminer la zone sous le pic de métal qui correspond à la métalloprotéine qu &#39;il est lié à chacun des injections en effectuant une intégration des pics dans le logiciel d&#39;analyse de données préférée. </li><li> Tracer la surface sous le pic de métal contre la quantité totale du métal qui a été injecté sur la colonne dans chaque série, 200 - 6.000 mg / L pour le Cu et Zn et 2000 - 60 000 ug / L pour Fe. Effectuer une analyse de régression linéaire en fonction du protocole logiciel. </li><li> Utiliser les résultats de la pente de l&#39;analyse de régression linéaire comme un facteur pour convertir les chiffres par seconde pg / sec. Divisez chacun des comptes par des seconds points de données à travers le chromatogramme par le gradient de la valeur de la ligne. </li></ol></li><li> Graphiquement les donnéespg / sec contre le temps de chromatogramme. Déterminer l&#39;aire sous les pics d&#39;intérêt. La surface sous le pic représente la quantité totale de métal que la protéine est liée à, en pg. </li><li> Générer un étalonnage sur la base du poids moléculaire des métalloprotéines connus et l&#39;heure à laquelle ils éluent. Utilisez cette option pour estimer la taille des pics de protéines dans des échantillons complexes. </li></ol>

<ol>
	<li>Holm, R. H., Kennepohl, P., Solomon, E. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+Functional+Aspects+of+Metal+Sites+in+Biology.">Structural and Functional Aspects of Metal Sites in Biology.</a> Chem Rev. 96, 2239-2314 (1996).</li><li>Andreini, C., Bertini, I., Cavallaro, G., Holliday, G., Thornton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metal+ions+in+biological+catalysis:+from+enzyme+databases+to+general+principles.">Metal ions in biological catalysis: from enzyme databases to general principles.</a> J Biol Inorg Chem. 13, 1205-1218 (2008).</li><li>Roberts, B. R., Ryan, T. M., Bush, A. I., Masters, C. L., Duce, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+metallobiology+and+amyloid-beta+peptides+in+Alzheimer's+disease.">The role of metallobiology and amyloid-beta peptides in Alzheimer's disease.</a> J Neurosci. 120 (Suppl 1), 149-166 (2012).</li><li>Roberts, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+Treatment+with+CuII+(atsm)+Increases+Mutant+SOD1+In+Vivo+but+Protects+Motor+Neurons+and+Improves+the+Phenotype+of+a+Transgenic+Mouse+Model+of+Amyotrophic+Lateral+Sclerosis.">Oral Treatment with CuII (atsm) Increases Mutant SOD1 In Vivo but Protects Motor Neurons and Improves the Phenotype of a Transgenic Mouse Model of Amyotrophic Lateral Sclerosis.</a> J Neurosci. 34, 8021-8031 (2014).</li><li>Hare, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decreased+plasma+iron+in+Alzheimer's+disease+is+due+to+transferrin+desaturation.">Decreased plasma iron in Alzheimer's disease is due to transferrin desaturation.</a> ACS CHEM NEUROSCI. , (2015).</li><li>Cvetkovic, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+metalloproteomes+are+largely+uncharacterized.">Microbial metalloproteomes are largely uncharacterized.</a> Nature. 466, 779-782 (2010).</li><li>Barnett, J., Scanlan, D., Blindauer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+fractionation+and+detection+for+metalloproteomics:+challenges+and+approaches.">Protein fractionation and detection for metalloproteomics: challenges and approaches.</a> Anal Bioanal Chem. 402, 3311-3322 (2012).</li><li>Fernandez Sanchez, L., Szpunar, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Speciation+analysis+for+iodine+in+milk+by+size-exclusion+chromatography+with+inductively+coupled+plasma+mass+spectrometric+detection(SEC-ICP+MS).">Speciation analysis for iodine in milk by size-exclusion chromatography with inductively coupled plasma mass spectrometric detection(SEC-ICP MS).</a> J. Anal. At. Spectrom. 14, 1697-1702 (1999).</li><li>Manley, S., Byrns, S., Lyon, A., Brown, P., Gailer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+Cu-,+Fe-,+and+Zn-specific+detection+of+metalloproteins+contained+in+rabbit+plasma+by+size-exclusion+chromatography-inductively+coupled+plasma+atomic+emission+spectroscopy.">Simultaneous Cu-, Fe-, and Zn-specific detection of metalloproteins contained in rabbit plasma by size-exclusion chromatography-inductively coupled plasma atomic emission spectroscopy.</a> J Biol Inorg Chem. 14, 61-74 (2009).</li><li>Richarz, A. N., Br&#228;tter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Speciation+analysis+of+trace+elements+in+the+brains+of+individuals+with+Alzheimer's+disease+with+special+emphasis+on+metallothioneins.">Speciation analysis of trace elements in the brains of individuals with Alzheimer's disease with special emphasis on metallothioneins.</a> Anal Bioanal Chem. 372, 412-417 (2002).</li><li>Hare, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+the+iron,+copper+and+zinc+content+in+primary+neuron+and+astrocyte+cultures+by+rapid+online+quantitative+size+exclusion+chromatography-inductively+coupled+plasma-mass+spectrometry.">Profiling the iron, copper and zinc content in primary neuron and astrocyte cultures by rapid online quantitative size exclusion chromatography-inductively coupled plasma-mass spectrometry.</a> Metallomics. 5, 1656-1662 (2013).</li><li>Balkhi, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Plasma+Copper+Proteins+Speciation+by+Size+Exclusion+Chromatography+Coupled+to+Inductively+Coupled+Plasma+Mass+Spectrometry.+Solutions+for+Columns+Calibration+by+Sulfur+Detection.">Human Plasma Copper Proteins Speciation by Size Exclusion Chromatography Coupled to Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry. Solutions for Columns Calibration by Sulfur Detection.</a> Anal Chem. 82, 6904-6910 (2010).</li><li>Desjardins, P., Hansen, J. B., Allen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvolume+Protein+Concentration+Determination+using+the+NanoDrop+2000c+Spectrophotometer.">Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer.</a> J Vis Exp. , e1610 (2009).</li></ol>

The authors have nothing to disclose

Assurer l&#39;état natif de la protéine signifie une attention particulière aux tampons utilisés et le stockage de l&#39;échantillon sont nécessaires. Toutes ces techniques de chromatographie ou des techniques de préparation d&#39;échantillons peuvent être utilisés. Il est important que les tampons utilisés dans la préparation des échantillons et la Chromatographie sont dépourvus de chélateurs de métaux et tampons d&#39;utilisation qui miment le pH et les concentrations salines physiologiques. Autres conditions pour éviter incluent le chauffage de l&#39;échantillon ou l&#39; ajout de dénaturants de protéines (par exemple, l&#39; urée). Il est essentiel de réduire au minimum le nombre de cycles de gel-dégel. La capacité de la mémoire tampon choisie pour lier les métaux divalents est également importante et est une raison pour laquelle les tampons Tris ou d&#39;ammonium, de nitrate sont choisis sur des tampons à base de phosphate. La résolution et le pic à faible capacité de l&#39;exclusion de taille Chromatographie par rapport à d&#39;autres formes de chromatographie est une limitation majeure de cette technique. Cependant, la nature douce de taille exclusion chromaphy est important de maintenir l&#39;état natif de la protéine et ainsi préserver les obligations-protéine de métal relativement faibles. L&#39;exigence de maintenir l&#39;état natif des protéines nécessite une attention particulière au traitement des échantillons , y compris la limitation du nombre de cycles de gel - dégel, ce qui évite des chélateurs de métaux (par exemple, EDTA) ou sels et détergents chaotropiques. Cette faible résolution de cette technique influe sur la capacité de quantifier la quantité de métal associée à une protéine spécifique si elle est dans un échantillon complexe que les pics observés contiendra plus d&#39;une protéine. Par conséquent, la quantité de métal déterminée au moyen de l&#39;intégration du pic serait une indication de la quantité totale de métal associé à la totalité des protéines en éluant à ce point dans le temps et non pas seulement une protéine spécifique. Afin de pallier cette limitation de la protéine d&#39;intérêt devrait être davantage purifié dans des conditions natives. Cela permettrait la quantification dele métal associé à cette protéine pour être signalé avec un degré plus élevé de certainity. Une autre limitation potentielle de cette technique serait la perte de protéines due à une liaison non réversible à la colonne. Afin de déterminer si cela se produit une expérience de récupération doit être effectuée de sorte que la quantité de protéine éluant de la colonne est analysée pour déterminer si cela correspond à la quantité injectée. La même chose peut être faite en mesurant la teneur en métal du matériau d&#39;élution et la matière de départ en vrac par ICP-MS. La récupération de la colonne peut varier en fonction des conditions utilisées, mais il a été montré que le rétablissement complet des protéines provenant d&#39; une colonne d&#39;exclusion de taille est possible 9. Ainsi, il est important de vérifier si oui ou non il y a une perte dans les conditions d&#39;exploitation utilisé. Les modifications apportées au protocole peuvent être liés aux normes de métalloprotéines qui sont utilisés, ainsi que les éléments analysés. Le type de metalloprotein nous normeed différera en fonction des éléments qui sont d&#39;intérêt. Pour les éléments tels que Cu, Fe et Zn protéines, SOD et la ferritine sont employés. Toute autre metalloprotein ayant stoichometries connus peuvent également être utilisés et des exemples ont été représentés ici. Une complication majeure qui peut résulter de l&#39;utilisation de cette technique est l&#39;accumulation de cristaux de sel dans la torche de l&#39;ICP-MS. Afin d&#39;éviter l&#39;accumulation de cristaux de sel, la torche est lavée avec de l&#39;eau distillée après chaque tranche de 500 - 1 000 ml de tampon qui a été transmis à travers le système ou, lorsqu&#39;il est déterminé par inspection visuelle que la torche doit être lavée. Un autre problème qui peut se poser est une baisse plus rapide de la propreté de l&#39;échantillon et d&#39;extraction des cônes. Celles-ci doivent être nettoyés régulièrement en suivant les protocoles du fabricant. La préparation de l&#39;échantillon initial est l&#39;étape la plus critique dans le protocole. S&#39;il y a des changements à la protéine - complexe métallique l&#39;information généré ne sera pas valide. C&#39;est l&#39;une des principales limitations de la technique; En outre, l&#39;utilisation de la basse résolution, une colonne d&#39;exclusion stérique donne une vue détaillée limitée de la complexité réelle de métalloprotéines en biologie. La technique décrite ici permet l&#39;expansion de la connaissance de la metalloproteome d&#39;un organisme. analyse en vrac ne donne qu&#39;une indication grossière de modifications à la quantité de métal dans un échantillon. Outre les considérations générales qui doivent être pris en compte, cette technique fournit un outil qui peut être utilisé pour quantifier la quantité de métal associée à des protéines ainsi que l&#39;identification des métalloprotéines qui diffèrent en comparant les traces obtenues. L&#39;utilisation de cette technique peut être utilisée pour identifier les différences entre les états pathologiques. Les métalloprotéines identifiés peuvent ensuite être étudiés pour aider à déterminer le rôle qu&#39;ils jouent dans les processus de la maladie. L&#39;application de césure ICP-MS a une croissanceavenir afin de déterminer le rôle des médicaments qui ont un hétéroatome tel que le platine, l&#39;iode ou le cuivre comme ICP-MS peut être utilisée pour identifier les protéines qui se lie au médicament.

métaux essentiels jouent un rôle vital dans les fonctions biologiques normales, y compris les voies de messagers secondaires, les voies du métabolisme et les fonctions des organites. 30% de toutes les protéines sont considérées comme métallo - 1 et 50% de toutes les enzymes 2. Métalloenzymes utilisent ces métaux traces en tant que cofacteurs pour catalyser des réactions chimiques, stabilisent la structure des protéines, ainsi que pour des rôles régulateurs tels que des messagers secondaires. Certains des éléments de traces les plus étudiés en ce qui concerne la neurodégénérescence sont le cuivre, le fer et le zinc 3. Ils sont considérés comme étant impliqués dans de nombreuses voies de la maladie où par dyshomeostasis peut avoir des effets néfastes. Par exemple , l&#39;état du métal de la superoxyde dismutase (SOD) influe directement sur ​​la durée de vie et le phénotype des modèles de souris transgéniques de type familial de la sclérose latérale amyotrophique (SLA) 4. Dans la maladie d&#39;Alzheimer, metalloproteomics techniques ont été utilisées pour découvrir une diminution de l&#39;état du métal de la transferrine dans la pLasma 5. Ces études mettent en évidence les importants métalloprotéines de rôle peuvent jouer dans la maladie. L&#39;étude de métalloprotéines directement à partir de tissus biologiques est un champ de développement. Bien que certaines métalloenzymes ont été caractérisés, la majorité reste encore non caractérisé ou inconnue 6. L&#39; un des principaux défis dans métalloprotéines de mesure est la nécessité de maintenir l&#39;état natif de la protéine 7. Classical bottom-up techniques protéomiques reposent sur la digestion des protéines en peptides. Ce processus perturbe l&#39;interaction non covalente de métaux et de leurs protéines. Ainsi, aucune information sur l&#39;état de métal d&#39;une protéine est acquise. Une façon de surmonter ce problème est d&#39;utiliser la chromatographie d&#39;exclusion stérique associé à plasma à couplage inductif - 8,9 spectrométrie de masse (SEC-ICP-MS). Cela génère des informations sur la taille approximative de la protéine ainsi que tous les métaux qui sont associated 10 avec elle. En outre, l&#39;exclusion de taille est une technique chromatographique douce qui peut préserver l&#39;état natif d&#39;un complexe d&#39;enzyme ou protéine-protéine. Un avantage d&#39;utiliser le plasma à couplage inductif - spectrométrie de masse (ICP-MS) est la nature quantitative de la technologie. L&#39; utilisation d&#39; un ensemble de normes de métalloprotéines il est possible de fournir une quantification absolue de métalloprotéines à partir d&#39; échantillons biologiques 9,11. Ce résultat est obtenu en générant une courbe d&#39;étalonnage en injectant métallo connues sur une plage de concentrations de métaux. Ce protocole montre un exemple de la façon dont cela peut être réalisé pour une variété de normes de métalloprotéines. Dans cet article, nous visons à créer des courbes standard pour les métaux qui sont largement étudiés dans les domaines biologiques, y compris le fer (Fe), le cuivre (Cu), le zinc (Zn), l&#39;iode (I), et le cobalt (Co).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agilent 1290 Infinity Binary Pump</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G4220A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 1290 Infinity Autosampler</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G4226A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 1200 Series Autosampler Thermostat</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G1330B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 1290 Infinity Thermostatted Column Compartment</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G1316C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 1290 Infinity Variable Wavelength Detector</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G1314E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 7700 ICP-MS</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G3282A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Ammonium hydroxide trace metal basis&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>338818</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Ammonium nitrate&#160;</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>256064</td>
			<td>Make fresh 200mM solution on day of experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Antinomy&#160;</td>
			<td>Choice analytical&#160;</td>
			<td>10002-3&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Ceruloplasmin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Cesium&#160;</td>
			<td>Choice analytical&#160;</td>
			<td>100011-1&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Complete, EDTA free protease inhibitors&#160;&#160;</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11873580001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Conalbumin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Concanavalin A from Canavalia ensiformis (Jack bean)&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L7647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Cu, Zn Superoxide dismutase&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9697</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Ferritin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F4503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;ICP-MS multielemental calibration standards&#160;</td>
			<td>AccuStandard</td>
			<td></td>
			<td>Made up to required concentrations in 1% nitric acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Microvolume UV spectrophotometer&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;65% Nitric acid&#160;</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>100441</td>
			<td>Diluted to 1% for use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Peek tubing&#160;&#160;</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5042-6461</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Size exclusion column BioSEC-3 PLC. column, 4.6x300mm, 3&#956;m, 150&#197;&#160;</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5190-2508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Sodium Chloride&#160;</td>
			<td>Chem Supply</td>
			<td>SA046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Tris Hydrochloride&#160;</td>
			<td>ICN Biomedicals inc.&#160;</td>
			<td>103130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Thyroglobulin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Vitamin B12&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>V2876</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

standards for quantitative metalloproteomic analysis using size exclusion icp-ms

Metals are essential for protein function as cofactors to catalyze chemical reactions. Disruption of metal homeostasis is implicated in a number of diseases including Alzheimer's and Parkinson's disease, but the exact role these metals play is yet to be fully elucidated. Identification of metalloproteins encounters many challenges and difficulties. Here we report an approach that allows metalloproteins in complex samples to be quantified. This is achieved using size exclusion chromatography coupled with inductively coupled plasma - mass spectrometry (SEC-ICP-MS). Using six known metalloproteins, the size exclusion column can be calibrated and the respective trace elements (iron, copper, zinc, cobalt, iodine) can be used for quantification. SEC-ICP-MS traces of human brain and plasma are presented. The use of these metalloprotein standards provides the means to quantitatively compare metalloprotein abundances between biological samples. This technique is poised to help shed light on the role of metalloproteins in neurodegenerative disease as well as other diseases where imbalances in trace elements are implicated.

L&#39;utilisation des normes de métalloprotéines permet l&#39;étalonnage de la colonne d&#39;exclusion de taille. La figure 1A montre le profil d&#39;élution pour les normes thyroglobuline, la ferritine, la céruloplasmine, la Cu / Zn SOD et la vitamine B 12 sur la base du métal qu&#39;ils sont liés à (Fe, co, Cu, Zn et I). la figure 1B représente la courbe d&#39;étalonnage pour la colonne d&#39;exclusion de taille sur la base du poids moléculaire des étalons de protéine et de leur temps d&#39;élution, présenté sous la forme du volume d&#39;élution (Ve) , divisé par le volume de vide de la la colonne (Vo). Les protéines utilisées pour générer cette courbe standard sont concanavaline A, conalbumine, céruloplasmine, ferritine, SOD et thyroglobuline. La figure 2A montre l&#39;élution de la ferritine dans une plage de 2000 - 60 000 pg de Fe injecté sur la colonne et la figure 2D est une analyse de régression effectuée en utilisant la pzone de EAK. Les figures 2B et 2C sont les profils d&#39;élution pour Cu / Zn SOD pour Cu et Zn et 2E et 2F sont les analyses de régression générées à l&#39; aide des zones de pointe. Les résultats de l&#39;analyse de régression sont utilisés pour convertir les données brutes en coups / s à pg / s de sorte que la quantité de métal associée à la protéine peut être déterminée quantitativement. La conversion se fait en divisant le compte / sec par la pente de la régression linéaire (par exemple, 334,6 (coups / s) x (s / p) de cuivre). Comme indiqué précédemment, cette technique peut être utilisée pour identifier les métalloprotéines dans des échantillons biologiques complexes. Cerveau humain et de plasma ont été soumis à cette technique et les figures 3 et 4, respectivement, montrent les résultats obtenus. Cerveau humain séparé par SEC-ICP-MS est représenté sur les figures 3A à 3C, dont chacun représente un métal différent de<html> intérêt (Cu, Zn ou Fe). Les figures 4A à 4C montrent les traces obtenues lorsque du plasma humain est soumis à cette technique. La complexité et l&#39;abondance de l&#39;échantillon auront un impact sur le nombre de pics qui sont vus. Comme le plasma attendu est dominé par quelques métalloprotéines dont céruloplasmine et la transferrine. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/53737/53737fig1.jpg" /> Figure 1. Calibration de chromatographie d&#39; exclusion stérique - plasma à couplage inductif - spectrométrie de masse utilisant Connu profil Métalloprotéines (A) Elution pour les normes de métalloprotéines en fonction de leurs métaux respectifs.. (B) poids moléculaire courbe d&#39;étalonnage pour des protéines étalons thyroglobuline (i), la ferritine (ii), la céruloplasmine (iii), conalbumine (iv), SOD Cu / Zn (v) et la concanavaline A (vi).&quot;Target =&quot; _ blank &quot;&gt; S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/53737/53737fig2.jpg" /> Figure 2. Utilisation de ferritine et Cu / Zn SOD en tant que normes Métalloprotéines pour déterminer la quantité de Cu, Fe ou Zn associés à Métalloprotéines dans un échantillon biologique complexe (A) Profil d&#39;élution de ferritine sur la plage d&#39;injection de 2000 -. 60.000 ug / L de fer. (B) et (C) Profil d&#39;élution pour SOD Cu / Zn dans l&#39;intervalle d&#39;injection de 200 - 6000 mg / L de cuivre et de zinc, respectivement. (D), (E) et (F) montrent les résultats de l&#39; analyse de régression pour les métaux fer, le cuivre et le zinc, respectivement. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53737/53737fig2large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> Figure 3. Cu, Fe et Zn Metalloproteome du cerveau humain. (A) trace de cuivre (B) trace de fer (C) Zinc trace. Elution des normes de protéines pour chaque métal est représenté par la trace noire avec leur poids moléculaire indiquée sous le graphique. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53737/53737fig3large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/53737/53737fig4.jpg" /> Figure 4. Cu, Fe et Zn Metalloproteome pour le plasma humain. (A) trace de cuivre (B) trace de fer (C) Zinc trace. L&#39;élution des étalons de protéine pour chaque métal est représentée par la trace noire avec leur poids moléculairedicated sous le graphique. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53737/53737fig4large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Standards for Quantitative Metalloproteomic Analysis Using Size Exclusion ICP-MS at JoVE.com

Standards for Quantitative Metalloproteomic Analysis Using Size Exclusion ICP-MS

Size exclusion chromatography hyphenated with inductively coupled plasma - mass spectrometry (ICP-MS) is a powerful tool to measure changes in the abundance of metalloproteins directly from biological samples. Here we describe a set of metalloprotein standards used to estimate molecular mass and the amount of metal associated with unknown proteins.

Normes pour Quantitative Metalloproteomic Analyse Utilisation Taille Exclusion ICP-MS

Metals are essential for protein function as cofactors to catalyze chemical reactions. Disruption of metal homeostasis is implicated in a number of ...

standards-for-quantitative-metalloproteomic-analysis-using-size

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Analytical Chemistry

Chemistry

Unit 1

Atomic Spectroscopy

SCIENTISTS IN ACTION

15.0K vues.  The Florey Institute of Neuroscience and Mental Health. Size exclusion chromatography hyphenated with inductively coupled plasma - mass spectrometry (ICP-MS) is a powerful tool to measure changes in the abundance of metalloproteins directly from biological samples. Here we describe a set of metalloprotein standards used to estimate molecular mass and the amount of metal associated with unknown proteins. 

Vidéo: Standards for Quantitative Metalloproteomic Analysis Using Size Exclusion ICP-MS

Quantitative Proteomics Using Reductive Dimethylation for Stable Isotope Labeling

Stable isotope labeling of peptides by reductive dimethylation (ReDi labeling) is a method to accurately quantify protein expression differences between samples using mass spectrometry. ReDi labeling is performed using either regular (light) or deuterated (heavy) forms of formaldehyde and sodium cyanoborohydride to add two methyl groups to each free amine. Here we demonstrate a robust protocol for ReDi labeling and quantitative comparison of complex protein mixtures. Protein samples for comparison are digested into peptides, labeled to carry either light or heavy methyl tags, mixed, and co-analyzed by LC-MS/MS. Relative protein abundances are quantified by comparing the ion chromatogram peak areas of heavy and light labeled versions of the constituent peptide extracted from the full MS spectra. The method described here includes sample preparation by reversed-phase solid phase extraction, on-column ReDi labeling of peptides, peptide fractionation by basic pH reversed-phase (BPRP) chromatography, and StageTip peptide purification. We discuss advantages and limitations of ReDi labeling with respect to other methods for stable isotope incorporation. We highlight novel applications using ReDi labeling as a fast, inexpensive, and accurate method to compare protein abundances in nearly any type of sample.

Stable isotope labeling of peptides by reductive dimethylation (ReDi labeling) is a rapid, inexpensive strategy for accurate mass spectrometry-based quantitative proteomics. Here we demonstrate a robust method for preparation and analysis of protein mixtures using the ReDi approach that can be applied to nearly any sample type.

Protéomique quantitative à l&#39;aide réductrice diméthylation pour les isotopes stables étiquetage

Stable isotope labeling of peptides by reductive dimethylation (ReDi labeling) is a method to accurately quantify protein expression differences between ...

Recherche

Chimie

Quantitative and Qualitative Examination of Particle-particle Interactions Using Colloidal Probe Nanoscopy

Colloidal Probe Nanoscopy (CPN), the study of the nano-scale interactive forces between a specifically prepared colloidal probe and any chosen substrate using the Atomic Force Microscope (AFM), can provide key insights into physical interactions present within colloidal systems. Colloidal systems are widely existent in several applications including, pharmaceuticals, foods, paints, paper, soil and minerals, detergents, printing and much more.1-3 Furthermore, colloids can exist in many states such as emulsions, foams and suspensions. Using colloidal probe nanoscopy one can obtain key information on the adhesive properties, binding energies and even gain insight into the physical stability and coagulation kinetics of the colloids present within. Additionally, colloidal probe nanoscopy can be used with biological cells to aid in drug discovery and formulation development. In this paper we describe a method for conducting colloidal probe nanoscopy, discuss key factors that are important to consider during the measurement, and show that both quantitative and qualitative data that can be obtained from such measurements.

Colloidal probe nanoscopy can be used within a variety of fields to gain insight into the physical stability and coagulation kinetics of colloidal systems and aid in drug discovery and formulation sciences using biological systems. The method described within provides a quantitative and qualitative means to study such systems.

Examen quantitative et qualitative des interactions entre particules à l&#39;aide de la sonde colloïdale nanoscopie

Colloidal Probe Nanoscopy (CPN), the study of the nano-scale interactive forces between a specifically prepared colloidal probe and any chosen substrate ...

Au-Interaction of Slp1 Polymers and Monolayer from Lysinibacillus sphaericus JG-B53 - QCM-D, ICP-MS and AFM as Tools for Biomolecule-metal Studies

In this publication the gold sorption behavior of surface layer (S-layer) proteins (Slp1) of Lysinibacillus sphaericus JG-B53 is described. These biomolecules arrange in paracrystalline two-dimensional arrays on surfaces, bind metals, and are thus interesting for several biotechnical applications, such as biosorptive materials for the removal or recovery of different elements from the environment and industrial processes. The deposition of Au(0) nanoparticles on S-layers, either by S-layer directed synthesis 1 or adsorption of nanoparticles, opens new possibilities for diverse sensory applications. Although numerous studies have described the biosorptive properties of S-layers 2-5, a deeper understanding of protein-protein and protein-metal interaction still remains challenging. In the following study, inductively coupled mass spectrometry (ICP-MS) was used for the detection of metal sorption by suspended S-layers. This was correlated to measurements of quartz crystal microbalance with dissipation monitoring (QCM-D), which allows the online detection of proteinaceous monolayer formation and metal deposition, and thus, a more detailed understanding on metal binding.
The ICP-MS results indicated that the binding of Au(III) to the suspended S-layer polymers is pH dependent. The maximum binding of Au(III) was obtained at pH 4.0. The QCM-D investigations enabled the detection of Au(III) sorption as well as the deposition of Au(0)-NPs in real-time during the in situ experiments. Further, this method allowed studying the influence of metal binding on the protein lattice stability of Slp1. Structural properties and protein layer stability could be visualized directly after QCM-D experiment using atomic force microscopy (AFM). In conclusion, the combination of these different methods provides a deeper understanding of metal binding by bacterial S-layer proteins in suspension or as monolayers on either bacterial cells or recrystallized surfaces.

Au-Interaction of Slp1 Polymers and Monolayer from Lysinibacillus sphaericus JG-B53 - QCM-D, ICP-MS and AFM as Tools for Biomolecule-metal Studies

To obtain basic information on the sorption and recycling of gold from aqueous systems the interaction of Au(III) and Au(0) nanoparticles on S-layer proteins were investigated. The sorption of protein polymers was investigated by ICP-MS and that of proteinaceous monolayers by QCM-D. Subsequent AFM enables the imaging of the nanostructures.

Au-Interaction des SLP1 Polymères et monocouche de<em&gt; Lysinibacillus sphaericus</em&gt; JG-B53 - QCM-D, ICP-MS et l&#39;AFM comme outils pour les études de biomolécules-métalliques

In this publication the gold sorption behavior of surface layer (S-layer) proteins (Slp1) of Lysinibacillus sphaericus JG-B53 is described. These ...

Using Capillary Electrophoresis to Quantify Organic Acids from Plant Tissue: A Test Case Examining Coffea arabica Seeds

Carboxylic acids are organic acids containing one or more terminal carboxyl (COOH) functional groups. Short chain carboxylic acids (SCCAs; carboxylic acids containing three to six carbons), such as malate and citrate, are critical to the proper functioning of many biological systems, where they function in cellular respiration and can serve as indicators of cell health. In foods, organic acid content can have significant impact on taste, with increased SCCA levels resulting in a sour or &#34;acid&#34; taste. Because of this, methods for the rapid analysis of organic acid levels are of particular interest to the food and beverage industries. Unfortunately, however, most methods used for SCCA quantification are dependent on time-consuming protocols requiring the derivatization of samples with hazardous reagents, followed by costly chromatographic and/or mass spectrometric analyses. This method details an alternate method for the detection and quantification of organic acids from plant material and food samples using free zonal capillary electrophoresis (CZE), sometimes simply referred to as capillary electrophoresis (CE). CZE provides a cost-effective method for measuring SCCAs with a low limit of detection (0.005 mg/ml). This article details the extraction and quantification of SCCAs from plant samples. While the method provided focuses on measurement of SCCAs from coffee beans, the method provided can be applied to multiple plant-based food materials.

Using Capillary Electrophoresis to Quantify Organic Acids from Plant Tissue: A Test Case Examining Coffea arabica Seeds

This article presents a method for the detection and quantification of organic acids from plant material using free zonal capillary electrophoresis. An example of the potential application of this method, determining the effects of a secondary fermentation on organic acid levels in coffee seeds, is provided.

Utilisation de l&#39;électrophorèse capillaire à Quantifier acides organiques à partir de tissus végétaux: Un cas de test d&#39;examen<em&gt; Coffea Arabica</em&gt; Graines

Carboxylic acids are organic acids containing one or more terminal carboxyl (COOH) functional groups. Short chain carboxylic acids (SCCAs; carboxylic ...

Measurement of Particle Size Distribution in Turbid Solutions by Dynamic Light Scattering Microscopy

A protocol for measuring polydispersity of concentrated polymer solutions using dynamic light scattering is described. Dynamic light scattering is a technique used to measure the size distribution of polymer solutions or colloidal particles. Although this technique is widely used for the assessment of polymer solutions, it is difficult to measure the particle size in concentrated solutions due to the multiple scattering effect or strong light absorption. Therefore, the concentrated solutions should be diluted before measurement. Implementation of the confocal optical component in a dynamic light scattering microscope1 helps to overcome this barrier. Using such a microscopic system, both transparent and turbid systems can be analyzed under the same experimental setup without a dilution. As a representative example, a size distribution measurement of a temperature-responsive polymer solution was performed. The sizes of the polymer chains in an aqueous solution were several tens of nanometers at a temperature below the lower critical solution temperature (LCST). In contrast, the sizes increased to more than 1.0 &#181;m when above the LCST. This result is consistent with the observation that the solution turned turbid above the LCST.

A protocol for the direct measurement of particle size distribution in concentrated solutions using dynamic light scattering microscopy is presented.

Mesure de la distribution granulométrique en turbides Solutions par Dynamic Light Scattering Microscopie

A protocol for measuring polydispersity of concentrated polymer solutions using dynamic light scattering is described. Dynamic light scattering is a ...

Fabrication and Testing of Photonic Thermometers

In recent years, a push for developing novel silicon photonic devices for telecommunications has generated a vast knowledge base that is now being leveraged for developing sophisticated photonic sensors. Silicon photonic sensors seek to exploit the strong confinement of light in nano-waveguides to transduce changes in physical state to changes in resonance frequency. In the case of thermometry, the thermo-optic coefficient, i.e., changes in refractive index due to temperature, causes the resonant frequency of the photonic device such as a Bragg grating to drift with temperature. We are developing a suite of photonic devices that leverage recent advances in telecom compatible light sources to fabricate cost-effective photonic temperature sensors, which can be deployed in a wide variety of settings ranging from controlled laboratory conditions, to the noisy environment of a factory floor or a residence. In this manuscript, we detail our protocol for the fabrication and testing of photonic thermometers.

We describe the process of fabrication and testing of photonic thermometers.

Fabrication et essai de thermomètres photoniques

In recent years, a push for developing novel silicon photonic devices for telecommunications has generated a vast knowledge base that is now being ...

Nanosponge Tunability in Size and Crosslinking Density

We describe a protocol for the synthesis of linear polyesters containing pendant epoxide functionality and their incorporation into a nanosponge with controlled dimensions. This approach begins with synthesis of a functionalized lactone which is key to the pendant functionalization of the resulting polymer. Valerolactone (VL) and allyl-valerolactone (AVL) are then copolymerized using ring-opening polymerization. Post-polymerization modification is then used to install an epoxide moiety on some or all of the pendant allyl groups. Epoxy-amine chemistry is employed to form nanoparticles in a dilute solution of both polymer and small molecule diamine crosslinker based on the desired nanosponge size and crosslinking density. Nanosponge sizes can be characterized by transmission electron microscopy (TEM) imaging to determine the dimension and distribution. This method provides a pathway by which highly tunable polyesters can create tunable nanoparticles, which can be used for small molecule drug encapsulation. Due to the nature of the backbone, these particles are hydrolytically and enzymatically degradable for a controlled release of a wide range of hydrophobic small molecules.

This article describes a process for tuning the size and crosslinking density of covalently crosslinked nanoparticles from linear polyesters containing pendant functionality. By tailoring synthesis parameters (polymer molecular weight, pendant functionality incorporation, and crosslinker equivalents), a desired nanoparticle size and crosslinking density can be achieved for drug delivery applications.

Nanosponge accordabilité en taille et en densité de réticulation

We describe a protocol for the synthesis of linear polyesters containing pendant epoxide functionality and their incorporation into a nanosponge with ...

Disentangling High Strength Copolymer Aramid Fibers to Enable the Determination of Their Mechanical Properties

Traditionally, soft body armor has been made from poly(p-phenylene terephthalamide) (PPTA) and ultra-high molecular weight polyethylene. However, to diversify the fiber choices in the United States body armor market, copolymer fibers based on the combination of 5-amino-2-(p-aminophenyl) benzimidazole (PBIA) and the more conventional PPTA were introduced. Little is known regarding the long-term stability of these fibers, but as condensation polymers, they are expected to have potential sensitivity to moisture and humidity. Therefore, characterizing the strength of the materials and understanding their vulnerability to environmental conditions is important for evaluating their use lifetime in safety applications. Ballistic resistance and other critical structural properties of these fibers are predicated on their strength. To accurately determine the strength of the individual fibers, it is necessary to disentangle them from the yarn without introducing any damage. Three aramid-based copolymer fibers were selected for the study. The fibers were washed with acetone followed by methanol to remove an organic coating that held the individual fibers in each yarn bundle together. This coating makes it difficult to separate single fibers from the yarn bundle for mechanical testing without damaging the fibers and affecting their strength. After washing, fourier transform infrared (FTIR) spectroscopy was performed on both washed and unwashed samples and the results were compared. This experiment has shown that there are no significant variations in the spectra of poly(p-phenylene-benzimidazole-terephthalamide-co-p-phenylene terephthalamide) (PBIA-co-PPTA1) and PBIA-co-PPTA3 after washing, and only a small variation in intensity for PBIA. This indicates that the acetone and methanol rinses are not adversely affecting the fibers and causing chemical degradation. Additionally, single fiber tensile testing was performed on the washed fibers to characterize their initial tensile strength and strain to failure, and compare those to other reported values. Iterative procedural development was necessary to find a successful method for performing tensile testing on these fibers.

The primary goal of the study is to develop a protocol to prepare consistent specimens for accurate mechanical testing of high strength copolymer aramid fibers, by removing a coating and disentangling the individual fiber strands without introducing significant chemical or physical degradation.

Démêler les fibres d’aramide de copolymère haute résistance afin de permettre la détermination de leurs propriétés mécaniques

Traditionally, soft body armor has been made from poly(p-phenylene terephthalamide) (PPTA) and ultra-high molecular weight polyethylene. However, to ...

Application of Voltage in Dynamic Light Scattering Particle Size Analysis

Dynamic light scattering (DLS) is a common method for characterizing the size distribution of polymers, proteins, and other nano- and microparticles. Modern instrumentation permits measurement of particle size as a function of time and/or temperature, but currently there is no simple method for performing DLS particle size distribution measurements in the presence of applied voltage. The ability to perform such measurements would be useful in the development of electroactive, stimuli-responsive polymers for applications such as sensing, soft robotics, and energy storage. Here, a technique using applied voltage coupled with DLS and a temperature ramp to observe changes in aggregation and particle size in thermoresponsive polymers with and without electroactive monomers is presented. The changes in aggregation behavior observed in these experiments were only possible through the combined application of voltage and temperature control. To obtain these results, a potentiostat was connected to a modified cuvette in order to apply voltage to a solution. Changes in polymer particle size were monitored using DLS in the presence of constant voltage. Simultaneously, current data were produced, which could be compared with particle size data, to understand the relationship between current and particle behavior. The polymer poly(N-isopropylacrylamide) (pNIPAM) served as a test polymer for this technique, as pNIPAM's response to temperature is well-studied. Changes in the lower-critical solution temperature (LCST) aggregation behavior of pNIPAM and poly(N-isopropylacrylamide)-block-poly(ferrocenylmethyl methacrylate), an electrochemically active block-copolymer, in the presence of applied voltage are observed. Understanding the mechanisms behind such changes will be important when trying to achieve reversible polymer structures in the presence of applied voltage.

Here, a protocol to apply voltage to solution during dynamic light scattering particle size measurements with the intent to explore the effect of voltage and temperature changes on polymer aggregation is presented.

Application de la tension dans l'analyse dynamique de la taille des particules de diffusion de la lumière

Dynamic light scattering (DLS) is a common method for characterizing the size distribution of polymers, proteins, and other nano- and microparticles. ...

Setup of Capillary Electrophoresis-Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry (CE-ICP-MS) for Quantification of Iron Redox Species (Fe(II), Fe(III))

Dyshomeostasis of iron metabolism is accounted in the pathophysiological framework of numerous diseases, including cancer and several neurodegenerative conditions. Excessive iron results in free redox-active Fe(II) and can cause devastating effects within the cell like oxidative stress (OS) and death by lipid peroxidation known as ferroptosis (FPT). Therefore, quantitative measurements of ferrous (Fe(II)) and ferric (Fe(III)) iron rather than total Fe-determination is the key for closer insight into these detrimental processes. Since Fe(II)/(III) determinations can be hampered by fast redox-state shifts and low concentrations in relevant samples, like cerebrospinal fluid (CSF), methods should be available that analyze quickly and provide low limits of quantification (LOQ). Capillary electrophoresis (CE) offers the advantage of fast Fe(II)/Fe(III) separation and works without a stationary phase, which could interfere with the redox balance or cause analyte sticking. CE combined with inductively coupled plasma mass spectrometry (ICP-MS) as a detector offers further improvement of detection sensitivity and selectivity. The presented method uses 20 mM HCl as a background electrolyte and a voltage of +25 kV. Peak shapes and concentration detection limits are improved by conductivity-pH-stacking. For reduction of 56[ArO]+, ICP-MS was operated in the dynamic reaction cell (DRC) mode with NH3 as a reaction gas. The method achieves a limit of detection (LOD) of 3 &#181;g/L. Due to stacking, higher injection volumes were possible without hampering separation but improving LOD. Calibrations related to peak area were linear up to 150 &#181;g/L. Measurement precision was 2.2% (Fe(III)) to 3.5% (Fe(II)). Migration time precision was &#60;3% for both species, determined in 1:2 diluted lysates of human neuroblastoma (SH-SY5Y) cells. Recovery experiments with standard addition revealed accuracy of 97% Fe(III) and 105 % Fe(II). In real-life bio-samples like CSF, migration time can vary according to varying conductivity (i.e., salinity). Thus, peak identification is confirmed by standard addition.

Setup of Capillary Electrophoresis-Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry CE-ICP-MS for Quantification of Iron Redox Species FeII, FeIII

This iron redox speciation method is based on capillary electrophoresis-inductively coupled plasma mass spectrometry with sample stacking combined with short analysis in one run. The method quickly analyzes and provides low limits of quantification for iron redox species across a diverse range of tissues and biofluid samples.

Configuration de la spectrométrie de masse plasmatique capillaire couplée à l’électrophorèse (CE-ICP-MS) pour la quantification des espèces de redox de fer (Fe(II), Fe(III))

Dyshomeostasis of iron metabolism is accounted in the pathophysiological framework of numerous diseases, including cancer and several neurodegenerative ...