Notre méthode est significative, car elle permet au biochimiste moyen de déterminer rapidement si les échantillons isolés à l’aide de la chromatographie d’affinité métallique immobilisée sont contaminés par des métaux de transition. Le principal avantage est la facilité par laquelle l’analyse peut être effectuée. L’essai utilise l’instrumentation et les techniques communes à la plupart des laboratoires de biochimie, et il peut être facilement et rapidement mis en œuvre.
Alors que dans cet article, nous appliquons cette méthode pour les échantillons isolés avec une colonne nickel-NTA, la méthode peut être utilisée avec toute autre résine d’affinité métallique. Pour la première fois, les utilisateurs devraient essayer cette méthode avec une solution de stock de nickel de concentration connue. Cela les familiarisera avec le flux de travail, les couleurs de l’échantillon et les résines indiquées dans les changements spectraux.
Cole Swain, technicien de mon laboratoire, démontrera la procédure. Pour commencer, allumez et réchauffez le spectrophotomètre UV-Vis. Déterminer les fractions de chromatographie à déterminer à l’aide d’un spectrophotomètre UV-Vis à diodes avec absorption optique à 280 nanomètres pour quantifier la protéine.
Obtenez un tampon d’échantillon de 10 à 100 millimlaires avec un PH entre 7 et 12, comme tris, HEPES, MOPS et tampon phosphaté. Préparer une solution de 12 % en volume de dispersion hnb dans le tampon de l’échantillon à l’aide de 120 milligrammes de réaccente HNB pour chaque millilitre de solution de stock préparé. Réglez le spectrophotomètre pour recueillir des données à 647 nanomètres.
Utilisez une cuvette à quartz remplie du tampon de l’échantillon pour vider le spectrophotomètre. Préparer une solution de contrôle dans une cuvette contenant 50 microlitres de stock HNB par millilitre de volume total d’analyse. Laissez le contrôle couver pendant au moins trois minutes à température ambiante.
Mesurez et enregistrez l’absorption à 647 nanomètres pour l’échantillon de contrôle. Préparer les échantillons d’analyse en mélangeant 150 microlitres de stock HNB avec 2850 microlitres de fractions de protéines correctement diluées avec le tampon de l’échantillon. Laissez l’échantillon couver pendant au moins trois minutes à température ambiante.
Répétez l’enregistrement du spectre pour chaque fraction à mesurer. Dans le cas où une dilution insuffisante est obtenue, toute la bande spectrale à 647 nanomètres a disparu. Bien qu’avec une dilution trop forte, l’échantillon est indiscernable du contrôle.
Pour déterminer la concentration de métal dans chaque échantillon, trouvez d’abord la différence de chaque absorption de l’échantillon à 647 nanomètres du contrôle HNB. Déterminer la concentration de métal en micromolaire en utilisant la formule où DF est le facteur de dilution pour la fraction d’essai, delta A-B-S 647 est le changement d’absorption à 647 nanomètres, 3,65 fois 10 à la négative 2 représente le coefficient d’extinction de HNB, et l est la trajectoire optique de la cuvette en centimètres. Dans cette étude, le spectre de HNB libre à PH neutre dans les spectres représentatifs des fractions analysées pour l’ion de nickel de l’isolement de MSP1E3D1 sont montrés ici.
Une diminution de l’absorption à 647 nanomètres par rapport au contrôle HNB a été observée, ce qui correspondait à la formation de complexes HNB en présence d’un métal de transition. Pour démontrer l’application de cet essai, deux protéines d’échafaudage de membrane sa-marqués, MSP1E3D1, MSP2N2, et un nouveau, trois-heme, c-type cytochrome GSU0105, de geobacter sulfurreducens, ont été analysés. La teneur en protéines et en ions nickel de chaque fraction pour GSU0105 a été sensiblement déplacée les unes des autres, tandis que les fractions pour MSP1E3D1 et MSP2N2 qui contenaient le plus de protéines avaient également la teneur en nickel la plus élevée.
Il est également illustré que la teneur en métal ne peut pas être répartie uniformément entre les fractions recueillies à l’aide d’une chromatographie d’affinité métallique mobilisée. Il est très important de mélanger adéquatement et uniformément le blanc dans tous les échantillons et de permettre des temps d’incubation égaux pour le blanc dans tous les échantillons. Des fractions protéiques d’intérêt particulier pourraient être analysées plus en détail avec la spectrométrie d’absorption atomique ou l’ICPMS pour confirmer la contamination des métaux et pour tester les ions métalliques protéiques chélifiés ou fortement liés.
Outre la détection des lixiviations métalliques de transition, cette technique peut être utilisée pour mesurer les affinités contraignantes dans les ions métalliques de transition vers les protéines. HNB et tout nickel présent dans les échantillons sont des irritants pour les yeux et la peau respectivement. L’EPI standard, y compris les gants et la protection oculaire, doit être utilisé pendant la méthode.
