We thank C.C.R. laboratory members for comments and S. Moskowitz for figure preparation. This work was supported by National Institutes of Health Grants F32GM101761 (A.J.H.) and GM54397 (C.C.R.).

REMARQUE: Suivez tous les règlements institutionnels concernant l&#39;utilisation et l&#39;élimination des matières radioactives, y compris mais sans s&#39;y limiter, l&#39;utilisation des équipements de protection individuelle, comme des gants, des lunettes de sécurité, blouse de laboratoire, et des boucliers acryliques appropriés. NOTE: Le tampon standard est constitué de 40 mM de HEPES-KOH, pH 7,5, 50 mM de glutamate de potassium, 5 mM de DTT, 0,1 mM d&#39;EDTA (ce tampon est préalablement effectué à une concentration de 5x) et 0,3 mM de chaque dNTP. Protéines de replication de T7 sont purifiés comme décrit 8, 9, 10. ADN simple brin contenant une T7 unique de reconnaissance primase place (5 &#39;GGGTC-3&#39;, 5&#39;-GTGTC-3 &#39;, 5&#39;-TGGTC-3&#39;) peut être acheté parmi une variété de sociétés de synthèse d&#39;ADN (la longueur de l&#39;ADNsb peut dépendre de l&#39;enzyme de choix pour la T7 primase, un pentamère est la longueur de gabarit minimal pour synthétiser une amorce de pleine longueur 11, comme le cryptique C est essentiel, cependant, si l&#39;amorce doit être prolongée par polymérase, des nucléotides supplémentaires doivent être présents à l&#39; extrémité 3 &#39;de la matrice. Les réactions sont initiées par l&#39;addition d&#39;une concentration finale de 10 mM MgCl 2 et incubées à 25 ° C. échantillonnage manuel fonctionne bien pour les points de temps de 5 secondes ou plus. Si points de temps plus courts que sont nécessaires, il est recommandé d&#39;utiliser un instrument d&#39;écoulement rapide trempe pour obtenir des données précises. 1. Multiple-CA Primer Synthèse Reaction par échantillonnage manuel <ol><li> Avant de commencer l&#39;expérience, aliquoter 2 ul de tampon de colorant formamide (93% (v / v) de formamide, 50 mM d&#39;EDTA, 0,01% de xylene cyanol et 0,01% de bleu de bromophénol) dans 8 tubes de 1,5 ml en polypropylene. En général, le nombre de tubes est égal au nombre de points temporels analysés. </li><li> Préparer un mélange de 20 ul constitué tampon 1x, 0,1 mM d&#39; ATP et CTP, 0,25 mCi / mL [α- 32 P] CTP, 0,1 uM ssdNA modèle, et 0,1 uM GP4 (exprimée en concentration de hexamère - monomère 0,6 uM). </li><li> Incuber le mélange à température ambiante pendant 5 min. </li><li> Retirer 2 pl du mélange à l&#39;aide d&#39;une pipette et mélanger avec 2 pi de tampon de colorant formamide dans un tube de 1,5 ml préparé à l&#39;étape 1.1 pour le pas de contrôle de réaction (temps zéro). </li><li> Ajouter 2 ul de 0,1 M de MgCl 2 au mélange réactionnel (à une concentration finale de 10 mM). </li><li> retirer manuellement 2 pi des échantillons des mélanges réactionnels à l&#39;aide d&#39;une pipette à intervalles de 10 secondes et mélanger avec un colorant formamide predispensed dans des tubes de 1,5 mL préparés à l&#39;étape 1.1. </li><li> Des échantillons de chaleur à 95 ° C pendant 5 minutes dans un bloc chauffant. </li><li> Charger des aliquotes des échantillons sur un gel dénaturant. Les petits produits d&#39;amorce de tetraribonucleotide synthétisés par la primase T7 sont bien réglées sur une épaisseur de 0,4 mm 25% d&#39;acrylamide: bisacrylamide (19: 1), 3 M d&#39;urée, 1 x TBE (Tris-borate 100, 1 mM d&#39;EDTA). </li><li> Placez tout le gel sur la chromapapier phie et la couverture d&#39;une pellicule plastique. gel sec en utilisant un séchoir à gel. </li><li> Préparer une série de dilutions du reste du mélange réactionnel et détecter le même volume chargé sur le gel sur du papier de Chromatographie, à savoir repèrer 4 ul de la dilution si 4 pi d&#39;échantillon ont été chargés. NOTE: Cela servira de la courbe standard pour déterminer la concentration des produits formés lors de la réaction. Par exemple, des dilutions de cinq fois à l&#39; aide du tampon TE (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, EDTA 1 mM) fonctionnent bien, couvrant une gamme de 1:25 à 1: 15.625 (5 2 -5 6), mais les dilutions devraient être ajustée en fonction du niveau d&#39;activité. </li><li> Exposer gel sec et standard en utilisant un écran de phosphorimager. Quantifier la radioactivité dans la série de dilution et de construire une courbe standard tel que décrit 8, 12 NOTE: L&#39; inclusion de l&#39; ADN polymerase T7 au mélange de réaction permet de Examine de l&#39;utilisation d&#39;amorces tetraribonucleotide par cette enzyme. De manière optimale, la concentration de la polymerase doit être saturante pour simplifier l&#39;interprétation des données. Une concentration de la polymérase de 0,4 uM ou plus donne de bons résultats. En outre, l&#39;effet d&#39;autres protéines, telles que des protéines de liaison simple brin d&#39;ADN, de part et d&#39;amorce de synthèse ou en retard brin d&#39;initiation peut être examiné de cette façon. </li></ol> 2. Multiple-chiffre d&#39;affaires Primer Synthèse Reaction l&#39;aide d&#39;un instrument rapide trempe <ol><li> Préparation des mélanges réactionnels <ol><li> Préparer 400 pi de solution A, contenant un tampon 1x, 0,2 uM GP4 hexamère, 0,2 uM ADNss modèle, mM dNTP 0,6, 0,2 mM ATP et CTP (y compris 0,5 mCi / mL [α- 32 P] CTP. </li><li> Préparer 400 pi de solution B, contenant 1 x tampon et 20 mM de MgCl 2. </li></ol></li><li> Le fonctionnement de l&#39; instrument d&#39;écoulement rapide trempe <ol><li> Allumez le rapinstrument d&#39;écoulement id-trempe; après que le menu principal apparaît, le type 7 sur le clavier de l&#39;instrument pour déplacer le conducteur de la seringue à sa position d&#39;origine. </li><li> tampon Position ouverte de la seringue pour &quot;LOAD&quot;. </li></ol></li><li> Seringues tampon de chargement <ol><li> Fixer une seringue de 10 ml contenant du tampon à l&#39;orifice de la seringue de commande. Changer la position du bouton de la seringue pour &quot;LOAD&quot;. </li><li> En utilisant des seringues de 10 ml, remplir le réservoir tampon de l&#39;appareil A et B avec 10 mM de Tris, pH 7,5, EDTA 1 mM et remplir la seringue C avec une solution de trempe (250 mM d&#39;EDTA et 0,2% de SDS). Retirer les bulles d&#39;air en poussant des plongeurs et sortir. </li><li> Changez la position de bouton pour &quot;FIRE&quot;. Tapez 2 pour ajuster la position de la barre de pilote de seringue. Appuyez sur le bouton &quot;DIMINUER&quot; pour abaisser la seringue jusqu&#39;à ce tampon sort la boucle de sortie: (7 descend en continu; 8-grand pas vers le bas; 9-petit pas vers le bas). Tapez &quot;ESC&quot; pour revenir au menu principal. </li></ol></li><li> Laver les tubes <ol><li> attach ligne de sortie à vide. Changer les boutons échantillons à &quot;FLUSH&quot;. Fermer le tampon seringue en réglant les potentiomètres à la position horizontale. Allumez le vide et tremper les boucles 2 affleurants en H 2 O pendant 10 s, puis tremper dans MeOH pendant 10 s. boucles sèches par aspiration d&#39;air pour ~ 15 s, ou jusqu&#39;à ce que sec. </li></ol></li><li> Échantillons de chargement <ol><li> Changer l&#39;échantillon position du bouton à &quot;LOAD&quot;. Placer la solution A dans 1 ml seringue. Brancher une seringue dans l&#39;un des orifices de charge de l&#39;échantillon. Répétez l&#39;opération pour la solution B, et placer dans un face port de chargement de l&#39;échantillon. </li></ol></li><li> La collecte de points de temps <ol><li> Sur le menu principal, tapez 1 pour la course trempe-débit. Entrez le temps (s) de réaction et appuyez sur &quot;ENTRER&quot;. Le numéro de boucle de réaction à utiliser sera affiché. Passer en boucle de réaction nécessaire. procédure de lavage Répétez l&#39;étape 2.2.4. </li><li> Tournez les boutons échantillons à &quot;LOAD&quot;. réaction de charge se mélange dans des boucles d&#39;échantillons jusqu&#39;à ce que juste à l&#39;extérieur du compartiment de mélange central. Tournez tous les boutons à &quot;FIRE &quot;. Assurez-vous que tous les boutons sont dans la bonne position. </li><li> Placer le tube de 1,5 ml sur l&#39;extrémité de la boucle de sortie. Appuyez sur &quot;GO&quot; pour lancer la réaction. procédure de lavage Répétez l&#39;étape 2.2.4. Recharger seringues tampons A et B jusqu&#39;à ce qu&#39;ils atteignent le pilote. </li><li> Répétez les étapes 2.2.6.2-2.2.6.3 pour chaque point de temps désiré. Exception: Ne chargez pas la solution contenant le réactif de départ (ie, MgCl 2 dans ce cas) lorsque la trempe de la commande à zéro point de temps. </li><li> Lorsque vous avez terminé la collecte des échantillons, entrez &quot;ESC&quot; pour revenir au menu principal. Appuyez sur &quot;7&quot; pour revenir de seringue tampon à sa position d&#39;origine. </li></ol></li><li> Instrument de nettoyage <ol><li> Retirer les seringues du mélange réactionnel. Tournez le chargement des échantillons bouton à la position &quot;LOAD&quot;. Sous vide, lavez chaque boucle d&#39;échantillon avec 0,2 mL NaOH 10 N, puis 10 ml 0,3 NH 3 PO 4 et 10 ml de MeOH. </li><li> Tournez les boutons de la seringue pour la position &quot;LOAD&quot;. Appuyez sur tous les 3 syrpoinçons inge pour récupérer réaction et trempe des tampons. Laver seringues au moins deux fois avec 5 ml H 2 O. </li><li> Remplir les seringues à nouveau avec 5 ml H 2 O et tourner les boutons en position &quot;FIRE&quot;. Changer les positions de bouton et tourner le vide pour éliminer H 2 O. Flush comme à l&#39; étape 2.2.4. Eteignez instrument. REMARQUE: Les produits sont analysés comme décrit dans les étapes 1.7-1.12. En outre, l&#39;ADN polymerase T7 et d&#39;autres protéines de replication peuvent être ajoutés dans le mélange réactionnel pour analyser leur effet sur la synthèse ou l&#39;extension d&#39;amorce. </li></ol></li></ol> 3. Single-CA Primer Synthèse Reaction NOTE: simple rotation des essais primaire synthèse / extension sont effectuées de manière similaire à des réactions multiples chiffre d&#39; affaires, avec quelques différences majeures: ces essais suivent la conversion de radiomarqué ATP dans l&#39; amorce ou d&#39; extension des produits, mais la concentration de substrats et de protéines sont considerablée supérieur. En outre, afin d&#39;atteindre la milliseconde pour permettre une analyse de la réaction de synthèse de l&#39;amorce, on doit utiliser une machine à écoulement rapide trempe. <ol><li> Préparation des mélanges réactionnels. <ol><li> Préparer 400 pi de solution A, contenant un tampon 1x, 3 uM hexamère GP4, 6 uM ADNss modèle, 0,6 mM de dNTP, 1 mM CTP, et 2 nM [γ- 32 P] ATP. Préparer 400 pi de solution B, contenant 1 x tampon et 20 mM de MgCl 2. </li></ol></li><li> Le fonctionnement d&#39;écoulement rapide trempe <ol><li> Effectuer des réactions comme décrit dans l&#39;étape 2.2. Si on le désire, ajouter une ADN polymerase T7 ou une protéine de liaison à l&#39;ADN simple brin T7 à une concentration de 15 uM et 20 uM, respectivement. Dans ce cas, les produits d&#39;extension à l&#39;accumulation d&#39;un régime de temps qui permet le prélèvement manuel de la réaction. </li></ol></li></ol> Analyse 4. Données <ol><li> courbes de progression du produit Fit à MOINS AVANCES non linéairemodèles carrés en utilisant des logiciels disponibles dans le commerce capables de moindres carrés unique et / ou intégration numérique. Les détails de l&#39;opération varient avec le logiciel utilisé, mais au-dessous sont des formes généralisées d&#39;équations utilisées pour le montage des données. </li><li> Déterminer le taux de formation du produit de plusieurs réactions de synthèse d&#39;amorce rotation par ajustement des courbes de progression d&#39;une équation linéaire. S&#39;il y a une courbure importante, l&#39; utilisation de la méthode de la vitesse initiale 13, 14 en ajustant les données à une fonction mono-exponentielle: y = A (e - k t), où y est la concentration du produit, A est l&#39;amplitude de la réaction, k est la constante de vitesse observée, t est le temps, en secondes. La pente de la ligne tangente au temps = 0 est le taux initial. NOTE: Les réactions Fit pré-stables synthèse état d&#39;amorce à une équation linéaire ou à l&#39;équation d&#39;état pré-stable éclater y = A (e - k bupremière t) + taux ss t, où A est l&#39;amplitude de la réaction, k rafale est la constante de vitesse observée pour l&#39;éclatement de pré-état stationnaire, ss taux est l&#39;état stationnaire ss taux = k cat [Enzyme]), t est le temps , en secondes. Fit une seule rotation des réactions de synthèse de l&#39; amorce progressent courbes à une seule fonction exponentielle y = A (e - k t). Dans le cas de GP4, ajuster les données par intégration numérique 15, à un modèle avec trois NTP étapes de condensation, où chaque intermédiaire est en équilibre avec l&#39;enzyme, en utilisant un logiciel disponible dans le commerce. </li></ol>

<ol>
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The authors have nothing to disclose.

Le facteur le plus important dans la réalisation de ces expériences est la disponibilité d&#39;enzyme purifiée très active. Au cours de notre travail avec GP4, par exemple, nous avons constaté que le stockage de l&#39;enzyme purifiée dans un tampon (20 mM de phosphate de potassium, pH 7,4, EDTA 0,1 mM, DTT 1 mM) contenant 50% de glycerol à -20 ° C conduit à une diminution l&#39;activité spécifique de la préparation pendant quelques mois. Par conséquent, nous maintenant flash freeze petites aliquotes de GP4...

La réplication de l&#39;ADN est une caractéristique conservée de toute la vie cellulaire. Si l&#39;identité et le nombre de composants de réplication varient largement, les mécanismes généraux sont partagés entre l&#39; évolution 1. Ici, nous décrivons, des expériences cinétiques discontinues à base de gel, en utilisant des substrats radioactifs, visant à comprendre la cinétique de la synthèse d&#39;ADN calorifugeage brin in vitro par des composants du replisome T7. La machinerie de réplication du bactériophage T7 est très simple, ne comporte que quatre protéines (l&#39;ADN polymérase, GP5 et son facteur de processivité, E. coli , la thiorédoxine, le GP4 de primase-hélicase bifonctionnels, et la protéine de liaison à l&#39; ADN simple brin, GP2. 5) 2. Cette caractéristique en fait un système modèle attractif pour étudier les mécanismes biochimiques conservés impliqués dans la réplication de l&#39;ADN. L&#39;accent est mis sur la formation d&#39;amorces ribonucléotide par T7 DNA primase, un critical étape dans l&#39;initiation de la synthèse d&#39;ADN. En outre, on peut également étudier l&#39;utilisation de ces amorces par l&#39;ADN polymerase T7 ou d&#39;autres protéines de réplication en les incluant dans le mélange réactionnel. T7-primase de l&#39;hélicase, GP4, catalyse la formation d&#39;amorces pour la synthèse d&#39;ADN au niveau des séquences d&#39;ADN spécifiques appelés sites de reconnaissance primase, ou PRS (5&#39;-CG-3 &#39;). La cytosine dans la SRP est cryptique, il est essentiel pour la reconnaissance du site, mais il n&#39;a pas été copié dans le produit 3. La première étape dans la synthèse de l&#39; amorce par GP4 implique la formation du dinucléotide pppAC, qui est ensuite étendue à un trimère, et éventuellement des amorces tétranucléotidiques fonctionnels pppACCC, pppACCA ou pppACAC en fonction de la séquence dans le gabarit 4. Ces amorces peuvent ensuite être utilisées par l&#39; ADN polymerase T7 pour initier la synthèse de l&#39; ADN, qui est également un procédé assisté par GP4-5, 6. A cet égard, la primasedomaine stabilise les tetraribonucleotides extrêmement courts avec le modèle, ce qui empêche leur dissociation, engage l&#39; ADN polymérase d&#39;une manière favorable à la fixation de la amorce / matrice dans la polymérase du site actif 7. Ces étapes (synthèse de l&#39;ARN primaire, transfert intercellulaire primaire à la polymérase, et extension) sont répétées dans plusieurs cycles de reproduire le brin tardif et doivent être coordonnées avec la réplication du brin leader. Les dosages décrits ici sont très sensibles et peuvent être effectuées dans un laps de temps raisonnable. Cependant, ils sont relativement bas-débit et un grand soin doit être exercé dans l&#39;utilisation et l&#39;élimination des matières radioactives. En fonction de la vitesse à laquelle le produit de réaction, on pourrait employer un instrument rapide trempe pour atteindre des échantillons à des échelles de temps qui se prêtent à l&#39;analyse significative des cours de temps de réaction soit dans la constante ou l&#39;état pré-stable. Récemment, nous avons utilisé essais décrits ici pour fournir evidence de l&#39;importance de l&#39;amorce la libération du domaine primase de GP4 dans l&#39;initiation des fragments d&#39;Okazaki. De plus, nous avons trouvé la preuve d&#39;un rôle régulateur pour les protéines, de gp2.5 liant le T7 ADN simple brin, dans la promotion de la formation de l&#39; amorce et l&#39; utilisation efficaces 8.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="584">
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;"> 
			Tris pre-set crystals 
			pH 7.5</td>
			<td style="width:83px;">SIGMA</td>
			<td style="width:119px;">T4128&#160;</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tris base</td>
			<td style="width:83px;">&#160;SIGMA</td>
			<td align="right" style="width:119px;">93362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">L-Glutamic acid potassium salt monohydrate</td>
			<td style="width:83px;">SIGMA</td>
			<td style="width:119px;">G1501&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td style="width:83px;">Mallinckrodt Chemicals</td>
			<td style="width:119px;">5958-04</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">1,4-Dithiothreitol</td>
			<td style="width:83px;">J.T. Baker</td>
			<td style="width:119px;">F780-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Sodium Dodecyl Sulfate</td>
			<td style="width:83px;">MP Biomedicals</td>
			<td align="right" style="width:119px;">811030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">(Ethylenedinitrilo) Tetraacetic acid, disodium salt, dihydrate</td>
			<td style="width:83px;">Mallinckrodt Chemicals</td>
			<td style="width:119px;">4931-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">[&#945;-32P] CTP</td>
			<td style="width:83px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:119px;">BLU508H</td>
			<td>radioactive, take protective measures</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">[&#947;-32P] ATP</td>
			<td style="width:83px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:119px;">BLU502A</td>
			<td>radioactive, take protective measures</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">100 mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP&#160;</td>
			<td style="width:83px;">Affymetrix</td>
			<td align="right" style="width:119px;">77100</td>
			<td>four dNTPs part of set</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">100 mM ATP and CTP</td>
			<td style="width:83px;">Epicentre</td>
			<td style="width:119px;">RN02825</td>
			<td>part of NTP set</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">ssDNA constructs</td>
			<td style="width:83px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>custom sequences&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">methanol&#160;</td>
			<td style="width:83px;">Macron Fine Chemicals</td>
			<td style="width:119px;">3017-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">formamide</td>
			<td style="width:83px;">Thermo Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">17899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">bromophenol blue</td>
			<td style="width:83px;">SIGMA</td>
			<td style="width:119px;">B8026&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">cylene xyanol&#160;</td>
			<td style="width:83px;">SIGMA</td>
			<td style="width:119px;">X4126&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">acrylamide</td>
			<td style="width:83px;">SIGMA</td>
			<td style="width:119px;">A9099</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">N,N&#8242;-Methylenebisacrylamide</td>
			<td style="width:83px;">SIGMA</td>
			<td style="width:119px;">M7279&#160;</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Urea</td>
			<td style="width:83px;">Boston Bioproducts</td>
			<td style="width:119px;">P-940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Boric acid</td>
			<td style="width:83px;">Mallinckrodt Chemicals</td>
			<td align="right" style="width:119px;">2549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Rapid Quench-Flow Instrument&#160;</td>
			<td style="width:83px;">Kintek Corp.</td>
			<td style="width:119px;">RQF-3&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Kintek Explorer</td>
			<td style="width:83px;">Kintek Corp.</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Kaleidagraph&#160;</td>
			<td style="width:83px;">Synergy Software</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

kinetics of lagging-strand dna synthesis in vitro by the bacteriophage t7 replication proteins

Here we provide protocols for the kinetic examination of lagging-strand DNA synthesis in vitro by the replication proteins of bacteriophage T7. The T7 replisome is one of the simplest replication systems known, composed of only four proteins, which is an attractive feature for biochemical experiments. Special emphasis is placed on the synthesis of ribonucleotide primers by the T7 primase-helicase, which are used by DNA polymerase to initiate DNA synthesis. Because the mechanisms of DNA replication are conserved across evolution, these protocols should be applicable, or useful as a conceptual springboard, to investigators using other model systems. The protocols described here are highly sensitive and an experienced investigator can perform these experiments and obtain data for analysis in about a day. The only specialized piece of equipment required is a rapid-quench flow instrument, but this piece of equipment is relatively common and available from various commercial sources. The major drawbacks of these assays, however, include the use of radioactivity and the relative low throughput.

Les résultats présentés dans la figure 1A ont été obtenus comme décrit à l&#39; étape 1 du protocole, à savoir, en échantillonnant manuellement une réaction de synthèse de l&#39; amorce catalysée par GP4 dans des conditions multiples chiffre d&#39; affaires. Ici, une gamme de produits après électrophorèse en gel peut être observée en utilisant le CTP marqué avec 32P à l&#39;α-positionnement dans les réactions de ...

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Kinetics of Lagging-strand DNA Synthesis In Vitro by the Bacteriophage T7 Replication Proteins

We describe sensitive, gel-based discontinuous assays to examine the kinetics of lagging-strand initiation using the replication proteins of bacteriophage T7.

Cinétique de Lagging brin Synthèse de l&#39;ADN<em&gt; In vitro</em&gt; Par les protéines de réplication bactériophage T7

Here we provide protocols for the kinetic examination of lagging-strand DNA synthesis in vitro by the replication proteins of bacteriophage T7. The T7 ...

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Kinetics of Lagging-strand DNA Synthesis In Vitro by the Bacteriophage T7 Replication Proteins

DNA Replication

SCIENTISTS IN ACTION

7.3K vues.  Harvard Medical School. We describe sensitive, gel-based discontinuous assays to examine the kinetics of lagging-strand initiation using the replication proteins of bacteriophage T7. 

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In Vitro Transcription Assays and Their Application in Drug Discovery

In vitro transcription assays have been developed and widely used for many years to study the molecular mechanisms involved in transcription. This process requires multi-subunit DNA-dependent RNA polymerase (RNAP) and a series of transcription factors that act to modulate the activity of RNAP during gene expression. Sequencing gel electrophoresis of radiolabeled transcripts is used to provide detailed mechanistic information on how transcription proceeds and what parameters can affect it. In this paper we describe the protocol to study how the essential elongation factor NusA regulates transcriptional pausing, as well as a method to identify an antibacterial agent targeting transcription initiation through inhibition of RNAP holoenzyme formation. These methods can be used a as platform for the development of additional approaches to explore the mechanism of action of the transcription factors which still remain unclear, as well as new antibacterial agents targeting transcription which is an underutilized drug target in antibiotic research and development.

In Vitro Transcription Assays and Their Application in Drug Discovery

In this manuscript, we describe a protocol to functionally examine transcription and the inhibitory activity of antibacterial agents targeting bacterial transcription.

Dans les dosages transcription in vitro et leur application dans la découverte de médicaments

In vitro transcription assays have been developed and widely used for many years to study the molecular mechanisms involved in transcription. This process ...

Recherche

Génétique

Novel RNA-Binding Proteins Isolation by the RaPID Methodology

RNA-binding proteins (RBPs) play important roles in every aspect of RNA metabolism and regulation. Their identification is a major challenge in modern biology. Only a few in vitro and in vivo methods enable the identification of RBPs associated with a particular target mRNA. However, their main limitations are the identification of RBPs in a non-cellular environment (in vitro) or the low efficiency isolation of RNA of interest (in vivo). An RNA-binding protein purification and identification (RaPID) methodology was designed to overcome these limitations in yeast and enable efficient isolation of proteins that are associated in vivo. To achieve this, the RNA of interest is tagged with MS2 loops, and co-expressed with a fusion protein of an MS2-binding protein and a streptavidin-binding protein (SBP). Cells are then subjected to crosslinking and lysed, and complexes are isolated through streptavidin beads. The proteins that co-purify with the tagged RNA can then be determined by mass spectrometry. We recently used this protocol to identify novel proteins associated with the ER-associated PMP1 mRNA. Here, we provide a detailed protocol of RaPID, and discuss some of its limitations and advantages.

RNA-protein interactions lie at the heart of many cellular processes. Here, we describe an in vivo method to isolate specific RNA and identify novel proteins that are associated with it. This could shed new light on how RNAs are regulated in the cell.

Novel protéines __gVirt_NP_NN_NNPS&lt;__ ARN-Binding Isolation par la méthodologie RaPID

RNA-binding proteins (RBPs) play important roles in every aspect of RNA metabolism and regulation. Their identification is a major challenge in modern ...

In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

The mitochondrial genome is inherited exclusively through the maternal line. Understanding of how the mitochondrion and its genome are proliferated and transmitted from one generation to the next through the female oocyte is of fundamental importance. Because of the genetic tractability, and the elegant, ordered simplicity by which oocyte development proceeds, Drosophila oogenesis has become an invaluable system for mitochondrial study. An EdU (5-ethynyl-2&#180;-deoxyuridine) labeling method was utilized to detect mitochondrial DNA (mtDNA) replication in Drosophila ovaries. This method is superior to the BrdU (5-bromo-2'-deoxyuridine) labeling method in that it allows for good structural preservation and efficient fluorescent dye penetration of whole-mount tissues.
Here we describe a detailed protocol for labeling replicating mitochondrial DNA in Drosophila adult ovaries with EdU. Some technical solutions are offered to improve the viability of the ovaries, maintain their health during preparation, and ensure high-quality imaging. Visualization of newly synthesized mtDNA in the ovaries not only reveals the striking temporal and spatial pattern of mtDNA replication through oogenesis, but also allows for simple quantification of mtDNA replication under various genetic and pharmacological perturbations.

In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

Drosophila oogenesis continues to be exceptionally useful in the study of mitochondrial proliferation and inheritance. This manuscript describes a detailed protocol used to label the replicating mitochondrial DNA (mtDNA) in Drosophila adult ovaries with 5-ethynyl-2&#180;-deoxyuridine (EdU), which facilitates uncovering mechanisms associated with mitochondrial inheritance that were previously debatable.

In Situ Étiquetage de l&#39; ADN mitochondrial de réplication chez la drosophile adulte Ovaires par EdU Coloration

The mitochondrial genome is inherited exclusively through the maternal line. Understanding of how the mitochondrion and its genome are proliferated and ...

Genome-wide Determination of Mammalian Replication Timing by DNA Content Measurement

Replication of the genome occurs during S phase of the cell cycle in a highly regulated process that ensures the fidelity of DNA duplication. Each genomic region is replicated at a distinct time during S phase through the simultaneous activation of multiple origins of replication. Time of replication (ToR) correlates with many genomic and epigenetic features and is linked to mutation rates and cancer. Comprehending the full genomic view of the replication program, in health and disease is a major future goal and challenge.
This article describes in detail the &#34;Copy Number Ratio of S/G1 for mapping genomic Time of Replication&#34; method (herein called: CNR-ToR), a simple approach to map the genome wide ToR of mammalian cells. The method is based on the copy number differences between S phase cells and G1 phase cells. The CNR-ToR method is performed in 6 steps: 1. Preparation of cells and staining with propidium iodide (PI); 2. Sorting G1 and S phase cells using fluorescence-activated cell sorting (FACS); 3. DNA purification; 4. Sonication; 5. Library preparation and sequencing; and 6. Bioinformatic analysis. The CNR-ToR method is a fast and easy approach that results in detailed replication maps.

We describe here a relatively fast and simple approach for mapping genome-wide mammalian replication timing, from cell isolation to the basic analysis of the sequencing results. A genomic map of a representative replication program will be provided following the protocol.

Détermination de l&#39;échelle du génome de Timing de réplication mammalienne par l&#39;ADN Mesure Contenu

Replication of the genome occurs during S phase of the cell cycle in a highly regulated process that ensures the fidelity of DNA duplication. Each genomic ...

Inducible T7 RNA Polymerase-mediated Multigene Expression System, pMGX

Co-expression of multiple proteins is increasingly essential for synthetic biology, studying protein-protein complexes, and characterizing and harnessing biosynthetic pathways. In this manuscript, the use of a highly effective system for the construction of multigene synthetic operons under the control of an inducible T7 RNA polymerase is described. This system allows many genes to be expressed simultaneously from one plasmid. Here, a set of four related vectors, pMGX-A, pMGX-hisA, pMGX-K, and pMGX-hisK, with either the ampicillin or kanamycin resistance selectable marker (A and K) and either possessing or lacking an N-terminal hexahistidine tag (his) are disclosed. Detailed protocols for the construction of synthetic operons using this vector system are provided along with the corresponding data, showing that a pMGX-based system containing five genes can be readily constructed and used to produce all five encoded proteins in Escherichia coli. This system and protocol enables researchers to routinely express complex multi-component modules and pathways in E. coli.

This study describes methods for the T7-mediated co-expression of multiple genes from a single plasmid in Escherichia coli using the pMGX plasmid system.

Système d&#39;expression multigène médié par l&#39;ARN T7 à ADN polymère induible, pMGX

Co-expression of multiple proteins is increasingly essential for synthetic biology, studying protein-protein complexes, and characterizing and harnessing ...

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

DNA replication timing is an important cellular characteristic, exhibiting significant relationships with chromatin structure, transcription, and DNA mutation rates. Changes in replication timing occur during development and in cancer, but the role replication timing plays in development and disease is not known. Zebrafish were recently established as an in vivo model system to study replication timing. Here is detailed the protocols for using the zebrafish to determine DNA replication timing. After sorting cells from embryos and adult zebrafish, high-resolution genome-wide DNA replication timing patterns can be constructed by determining changes in DNA copy number through analysis of next generation sequencing data. The zebrafish model system allows for evaluation of the replication timing changes that occur in vivo throughout development, and can also be used to assess changes in individual cell types, disease models, or mutant lines. These methods will enable studies investigating the mechanisms and determinants of replication timing establishment and maintenance during development, the role replication timing plays in mutations and tumorigenesis, and the effects of perturbing replication timing on development and disease.

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

Zebrafish were recently used as an in vivo model system to study DNA replication timing during development. Here is detailed the protocols for using zebrafish embryos to profile replication timing. This protocol can be easily adapted to study replication timing in mutants, individual cell types, disease models, and other species.

Profilage ADN calendrier de réplication à l’aide de poisson-zèbre comme un système de modèle In Vivo

DNA replication timing is an important cellular characteristic, exhibiting significant relationships with chromatin structure, transcription, and DNA ...

Methodology for Accurate Detection of Mitochondrial DNA Methylation

Quantification of DNA methylation can be achieved using bisulfite sequencing, which takes advantage of the property of sodium bisulfite to convert unmethylated cytosine into uracil, in a single-stranded DNA context. Bisulfite sequencing can be targeted (using PCR) or performed on the whole genome and provides absolute quantification of cytosine methylation at the single base-resolution. Given the distinct nature of nuclear- and mitochondrial DNA, notably in the secondary structure, adaptions of bisulfite sequencing methods for investigating cytosine methylation in mtDNA should be made. Secondary and tertiary structure of mtDNA can indeed lead to bisulfite sequencing artifacts leading to false-positives due to incomplete denaturation poor access of bisulfite to single-stranded DNA. Here, we describe a protocol using an enzymatic digestion of DNA with BamHI coupled with bioinformatic analysis pipeline to allow accurate quantification of cytosine methylation levels in mtDNA. In addition, we provide guidelines for designing the bisulfite sequencing primers specific to mtDNA, in order to avoid targeting undesirable NUclear MiTochondrial segments (NUMTs) inserted into the nuclear genome.

Here, we present a protocol to allow accurate quantification of mitochondrial DNA (mtDNA) methylation. In this protocol, we describe an enzymatic digestion of DNA with BamHI coupled with a bioinformatic analysis pipeline which can be used to avoid overestimation of mtDNA methylation levels caused by the secondary structure of mtDNA.

Méthodologie pour une détection précise de la méthylation de l’ADN Mitochondrial

Quantification of DNA methylation can be achieved using bisulfite sequencing, which takes advantage of the property of sodium bisulfite to convert ...

Using In Vitro and In-cell SHAPE to Investigate Small Molecule Induced Pre-mRNA Structural Changes

In the process of drug development of RNA-targeting small molecules, elucidating the structural changes upon their interactions with target RNA sequences is desired. We herein provide a detailed in vitro and in-cell selective 2&#39;-hydroxyl acylation analyzed by primer extension (SHAPE) protocol to study the RNA structural change in the presence of an experimental drug for spinal muscular atrophy (SMA), survival of motor neuron (SMN)-C2, and in exon 7 of the pre-mRNA of the SMN2 gene. In in vitro SHAPE, an RNA sequence of 140 nucleotides containing SMN2 exon 7 is transcribed by T7 RNA polymerase, folded in the presence of SMN-C2, and subsequently modified by a mild 2&#39;-OH acylation reagent, 2-methylnicotinic acid imidazolide (NAI). This 2&#39;-OH-NAI adduct is further probed by a 32P-labeled primer extension and resolved by polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE). Conversely, 2&#39;-OH acylation in in-cell SHAPE takes place in situ with SMN-C2 bound cellular RNA in living cells. The pre-mRNA sequence of exon 7 in the SMN2 gene, along with SHAPE-induced mutations in the primer extension, was then amplified by PCR and subject to next-generation sequencing. Comparing the two methodologies, in vitro SHAPE is a more cost-effective method and does not require computational power to visualize results. However, the in vitro SHAPE-derived RNA model sometimes deviates from the secondary structure in a cellular context, likely due to the loss of all interactions with RNA-binding proteins. In-cell SHAPE does not need a radioactive material workplace and yields a more accurate RNA secondary structure in the cellular context. Furthermore, in-cell SHAPE is usually applicable for a larger range of RNA sequences (~1,000 nucleotides) by utilizing next-generation sequencing, compared to in vitro SHAPE (~200 nucleotides) that usually relies on PAGE analysis. In case of exon 7 in SMN2 pre-mRNA, the in vitro and in-cell SHAPE derived RNA models are similar to each other.

Detailed protocols for both in vitro and in-cell selective 2&#39;-hydroxyl acylation analyzed by primer extension (SHAPE) experiments to determine the secondary structure of pre-mRNA sequences of interest in the presence of an RNA-targeting small molecule are presented in this article.

En utilisant en forme in Vitro et dans les cellules d’enquêter sur petites molécules a induit des changements structurels de l’ARN pré-messager

In the process of drug development of RNA-targeting small molecules, elucidating the structural changes upon their interactions with target RNA sequences ...

High-Density DNA and RNA microarrays - Photolithographic Synthesis, Hybridization and Preparation of Large Nucleic Acid Libraries

Photolithography is a powerful technique for the synthesis of DNA oligonucleotides on glass slides, as it combines the efficiency of phosphoramidite coupling reactions with the precision and density of UV light reflected from micrometer-sized mirrors. Photolithography yields microarrays that can accommodate from hundreds of thousands up to several million different DNA sequences, 100-nt or longer, in only a few hours. With this very large sequence space, microarrays are ideal platforms for exploring the mechanisms of nucleic acid&#183;ligand interactions, which are particularly relevant in the case of RNA. We recently reported on the preparation of a new set of RNA phosphoramidites compatible with in situ photolithography and which were subsequently used to grow RNA oligonucleotides, homopolymers as well as mixed-base sequences. Here, we illustrate in detail the process of RNA microarray fabrication, from the experimental design, to instrumental setup, array synthesis, deprotection and final hybridization assay using a template 25mer sequence containing all four bases as an example. In parallel, we go beyond hybridization-based experiments and exploit microarray photolithography as an inexpensive gateway to complex nucleic acid libraries. To do so, high-density DNA microarrays are fabricated on a base-sensitive monomer that allows the DNA to be conveniently cleaved and retrieved after synthesis and deprotection. The fabrication protocol is optimized so as to limit the number of synthetic errors and to that effect, a layer of &#946;-carotene solution is introduced to absorb UV photons that may otherwise reflect back onto the synthesis substrates. We describe in a step-by-step manner the complete process of library preparation, from design to cleavage and quantification.

In this article, we present and discuss new developments in the synthesis and applications of nucleic acid microarrays fabricated in situ. Specifically, we show how the protocols for DNA synthesis can be extended to RNA and how microarrays can be used to create retrievable nucleic acid libraries.

Microréseaux d'ADN et d'ARN à haute densité - Synthèse photolithographique, hybridation et préparation des grandes bibliothèques d'acide nucléique

Photolithography is a powerful technique for the synthesis of DNA oligonucleotides on glass slides, as it combines the efficiency of phosphoramidite ...

Use of Frozen Tissue in the Comet Assay for the Evaluation of DNA Damage

The comet assay is gaining popularity as a means to assess DNA damage in cultured cells and tissues, particularly following exposure to chemicals or other environmental stressors. Use of the comet assay in regulatory testing for genotoxic potential in rodents has been driven by adoption of an Organisation for Economic Co-operation and Development (OECD) test guideline in 2014. Comet assay slides are typically prepared from fresh tissue at the time of necropsy; however, freezing tissue samples can avoid logistical challenges associated with simultaneous preparation of slides from multiple organs per animal and from many animals per study. Freezing also enables shipping samples from the exposure facility to a different laboratory for analysis, and storage of frozen tissue facilitates deferring a decision to generate DNA damage data for a given organ. The alkaline comet assay is useful for detecting exposure-related DNA double- and single-strand breaks, alkali-labile lesions, and strand breaks associated with incomplete DNA excision repair. However, DNA damage can also result from mechanical shearing or improper sample processing procedures, confounding the results of the assay. Reproducibility in collection and processing of tissue samples during necropsies may be difficult to control due to fluctuating laboratory personnel with varying levels of experience in harvesting tissues for the comet assay. Enhancing consistency through refresher training or deployment of mobile units staffed with experienced laboratory personnel is costly and may not always be feasible. To optimize consistent generation of high quality samples for comet assay analysis, a method for homogenizing flash frozen cubes of tissue using a customized tissue mincing device was evaluated. Samples prepared for the comet assay by this method compared favorably in quality to fresh and frozen tissue samples prepared by mincing during necropsy. Moreover, low baseline DNA damage was measured in cells from frozen cubes of tissue following prolonged storage.

This protocol describes several procedures for preparing high quality frozen tissue samples at the time of necropsy for use in the comet assay to assess DNA damage: 1) minced tissue, 2) scraped epithelial cells from the gastrointestinal tract, and 3) cubed tissue samples, requiring homogenization using a tissue mincing device.

Utilisation de tissus congelés dans l’analyse de la comète pour l’évaluation des dommages à l’ADN

The comet assay is gaining popularity as a means to assess DNA damage in cultured cells and tissues, particularly following exposure to chemicals or other ...