Ce protocole est important parce que l’utilisation de tissus congelés simplifie la logistique lors de l’évaluation de plusieurs tissus, permet le transfert d’échantillons à un laboratoire éloigné pour analyse, et permet de reporter une décision d’analyser un tissu pendant des mois. Le principal avantage de cette technique est que l’utilisation de tissu cube congelé ne nécessite pas de personnel formé à l’essai de comète à l’autopsie, et minimise les possibilités d’erreurs techniques et de dommages mécaniques à l’ADN introduits lors de la manipulation de l’échantillon. Cette technique s’est utilisée dans le développement de médicaments précliniques, l’évaluation de l’innocuité des produits chimiques entrant dans l’environnement et les additifs alimentaires.
Les tissus congelés peuvent être utilisés dans l’analyse de la comète pour évaluer le potentiel génotoxique, la réparation de l’ADN, les effets protecteurs contre les dommages causés par l’ADN induits par la chimiothérapie ou la radiothérapie, et pour la biosurveillance environnementale. Idéalement, les expériences devraient être conçues pour permettre le traitement de chaque échantillon de tissu jusqu’à l’étape de congélation avant que les organes prélevés sur le prochain animal ne soient disponibles pour le traitement. Les tissus congelés peuvent être poursuivis dans l’analyse de la comète pour évaluer le potentiel génotoxique, la réparation de l’ADN, les effets protecteurs contre les dommages causés par l’ADN induits par la chimiothérapie ou la radiothérapie, et pour la biosurveillance environnementale.
Carole Bobbitt, formatrice technique, et Eileen Gilas, directrice du laboratoire de toxicologie d’investigation, serviront aujourd’hui de prosectors. Lincoln Martin, associé de recherche, et Amélie Ladesseur, technicienne en histologie, feront la démonstration de la manipulation des échantillons. Pour commencer cette procédure, retirez tout tissu, organe et débris de connexion attaché d’un organe d’intérêt.
Swish immédiatement l’organe vigoureusement dans un bateau de pesage de taille moyenne contenant environ sept millilitres de froid, solution de hachage fraîchement préparé pour enlever le sang résiduel et les débris. Transférez l’organe dans un autre bateau de pesage propre contenant une solution de hachage à froid suffisante pour garder le tissu immergé et le maintenir sur la glace jusqu’à ce qu’il soit traité plus avant. Pour le foie, couper une section longitudinale de cinq millimètres du lobe gauche et swish doucement dans environ sept millilitres de solution de hachage froid.
Placez ensuite la bande de tissu dans un bateau de pesage propre de taille moyenne contenant environ sept millilitres de solution de hachage froid et maintenez sur la glace jusqu’à ce qu’ils soient prêts à traiter davantage. Retirez une section du foie et placez-la dans une cassette d’intégration. Effectuer la fixation, la coupe et l’intégration de paraffine selon les procédures standard de laboratoire pour l’évaluation future possible d’histopathologie.
Pour le dudénome, couper une partie de 10 millimètres du dudénodum proximal à l’estomac. Insérez une aiguille de calibre 21 à 25 dans une extrémité du dudénon et rincez-la avec un millilitre de solution de hachage à froid pour éliminer les débris et les bactéries. Retournez le dudénocumum, rincez-le à nouveau avec un millilitre de solution de hachage et jetez l’aiguille.
Couper le dudénodum ouvert et le rincer en environ sept millilitres de solution de hachage. Rincez ensuite le dudénocumum et maintenez-le en solution de hachage sur la glace jusqu’à ce qu’il soit prêt à traiter davantage. Couper et fixer une partie du dudénodène restant pour l’évaluation future possible d’histopathologie comme précédemment décrit pour le foie.
Pour le cerveau, il peut être utile de diviser d’abord le cerveau en deux hémisphères, avec un hémisphère étant sauvé pour l’histopathologie possible. Disséquer les régions cérébrales d’intérêt, puis les rincer doucement, et de maintenir sur la glace dans la solution de hachage jusqu’à ce que prêt à traiter plus loin, comme décrit précédemment pour le foie et le dudénodum. Pour l’estomac, enlever et jeter le forestomach.
Coupez l’estomac glandulaire et lavez-le à l’aide de nourriture en le swishing dans un bateau de pesage de taille moyenne contenant environ sept millilitres de tampon de hachage froid. Enlevez une bande de cinq millimètres de proximal glandulaire d’estomac au dudénon pour la fixation pour l’évaluation possible d’histopathologie comme décrit précédemment. Placez le reste de l’estomac dans un bateau de pesage de taille moyenne contenant environ sept millilitres de tampon de hachage froid et incubez sur la glace pendant 15 à 30 minutes.
Après cela, transférez l’estomac dans un morceau propre de paraffine et utilisez une lame de scalpel ou un grattoir à cellules en plastique pour gratter doucement l’épithélium de surface au moins deux fois pour enlever les débris. Ramasser la muqueuse gastrique avec des forceps et utiliser une pipette pour le rincer avec un millilitre de tampon de hachage froid. Transférer le tissu de l’estomac rincé sur une surface ou un plat propre et ajouter une solution de hachage à froid.
Utilisez l’arrière d’une lame de scalpel ou d’un grattoir à cellules en plastique pour gratter soigneusement l’épithélium de l’estomac quatre à cinq fois pour libérer les cellules. Ensuite, utilisez une pipette pour recueillir la solution de hachage contenant les cellules libérées, et transférez-la dans un tube de microcentrifugeuse sur la glace. Pour les échantillons de tissus de hachage, coupez une section de foie, de cerveau ou de dudénodenum et transférez-la dans un tube de microcentrifugeuse étiqueté contenant un millilitre de solution de hachage à froid.
Utilisez des ciseaux hachants pour hacher rapidement l’échantillon jusqu’à ce qu’il soit finalement dispersé, tout en veillant à ce que l’échantillon reste froid. L’échantillon devrait avoir l’air légèrement nuageux. Cependant, il est courant que certaines pièces restent qui se déposent au fond du tube.
Pour utiliser le tissu pendant qu’il est frais, maintenez les tubes contenant les échantillons sur la glace. Pour congeler les échantillons de tissus, fixez le couvercle du tube immédiatement après le hachage ou la collecte et déposez le tube dans un flacon de Dewar contenant de l’azote liquide. À la fin de la récolte des tissus, utilisez une louche pour récupérer les tubes de l’échantillon et placez-les sur de la glace sèche pour trier.
Transférer les tubes dans une boîte de congélation sur de la glace sèche et conserver la boîte dans un congélateur à moins 80 degrés Celsius. Pour préparer des cubes congelés de tissu, coupez plusieurs petits morceaux de tissu et déposez-les individuellement directement dans un bateau de pesage de taille moyenne ou un autre récipient approprié contenant de l’azote liquide pendant quelques secondes. Une fois les morceaux complètement congelés, transférer les cubes de tissu congelés individuellement dans des tubes de microcentrifugeuse étiquetés, ou cryo-tubes, sur de la glace sèche.
À la fin de la récolte des tissus, transférer les tubes dans une boîte de congélation sur de la glace sèche et conserver la boîte dans un congélateur à moins 800 degrés Celsius. Lorsque vous utilisez des tissus fraîchement hachés ou grattés maintenus sur de la glace mouillée, préparez des diapositives de comète dans l’heure qui suit la récolte. Lorsque vous utilisez du tissu haché ou gratté congelé, placez des tubes de tissu congelé dans un bain d’eau à température ambiante jusqu’à ce que les échantillons soient complètement décongelés tout en veillant à ce qu’ils soient maintenus au froid.
Une fois les échantillons décongelés, transférez immédiatement les tubes sur la glace. Pour les tissus en cubes, récupérer les tubes contenant les cubes du congélateur et les conserver sur la glace sèche jusqu’à la préparation de la glissade. Aliquot un millilitre de milieu marchand ou une solution de hachage dans un tube de microcentrifugeuse de 1,7 millilitre étiqueté pour chaque échantillon et maintenir sur la glace.
En travaillant rapidement pour éviter la décongélation, placez un cube de tissu dans l’extrémité ouverte d’un dispositif de hachage des tissus à température ambiante. Insérez rapidement un piston de seringue assorti de taille dans l’appareil pour pousser le tissu dans l’extrémité de maille, qui devrait alors être placée dans le tube de microcentrifugeuse contenant la solution de hachage froid. Immerger l’extrémité en maille de l’appareil pendant environ cinq à dix secondes dans la solution de hachage à froid pour permettre au tissu de décongeler complètement.
Déprimez complètement le piston jusqu’à ce que les cellules soient vues extruder à travers les pores de maille. Puis tirez le piston vers le haut d’environ 2,5 centimètres et appuyez à nouveau complètement vers le bas. Répétez plusieurs fois, jusqu’à ce que la solution de hachage devienne trouble.
Pour préparer les glissières, mélanger délicatement une suspension cellulaire et transférer 50 microlitres dans un tube contenant 450 microlitres de 0,5 % de faible point de fusion à 37 degrés Celsius. Préparez et marquez les diapositives telles qu’décrites dans le protocole de texte. Dans la première étude, le foie a été récolté à partir de deux cohortes de rats mâles sprague dawley véhicule de contrôle décalé d’une semaine.
Les diapositives ont été préparées à partir de tissus fraîchement hachés, de tissus hachés congelés et de tissus congelés en cubes. Étant donné que l’OCDE a recommandé une limite supérieure pour l’ADN de la queue en pourcentage dans le foie de rat frais est de 6 %, ces résultats démontrent que l’une ou l’autre des méthodes de congélation peut bien fonctionner pour évaluer les tissus. Dans l’ensemble, les hérissons en pourcentage étaient parallèles à l’ADN de la queue en pourcentage, bien que les tissus congelés présentent une plus grande variabilité.
Dans la deuxième étude, des souris femelles de B6C3F1 ont été administrées véhicule ou le méthane d’éthyle mutagenulfonate. Les résultats d’ADN de queue de pourcentage indiquent que le tissu de foie congelé comme cubes et plus tard traité utilisant le dispositif de hachage de tissu a donné des résultats très semblables à ceux obtenus pour le tissu fraîchement haché. Une augmentation statistiquement significative des dommages causés par l’ADN induit par le SME a été mesurée dans des échantillons de tissus traités par les trois méthodes.
Dans la troisième étude, des échantillons de foie prélevés sur des souris femelles B6C3F1 dans une étude de toxicité chimique de 90 jours ont été analysés. Les dommages causés par l’ADN dans les tissus hachés congelés étaient élevés dans tous les groupes de doses, avec une variabilité importante entre les animaux et les animaux. Les résultats de l’ADN de la queue en pourcentage étaient corrélés avec les hérissons en pourcentage, ce qui indique que les hérissons ont contribué de façon substantielle au niveau élevé de dommages causés par l’ADN observé dans ces échantillons.
En revanche, l’ADN endommagé et les hérissons en pourcentage étaient très bas dans le tissu en cubes congelé flash qui avait été préparé en parallèle avec les échantillons de tissus hachés. Ainsi, les cellules fortement endommagées se sont manifestées sous forme de hérissons dans les échantillons de tissus hachés n’étaient manifestement pas le résultat d’un processus biologique, mais ont probablement été introduites par perturbation mécanique, et, ou réchauffement des tissus pendant la procédure de hachage avant d’être congelés flash. Par conséquent, les données sur les tissus hachés ont été considérées comme peu fiables.
En comparaison, des données de haute qualité ont été obtenues à partir du tissu congelé en cubes, même après un stockage prolongé. Il est essentiel de garder les tissus récoltés froids et humides, et de travailler rapidement pour congeler les échantillons. En outre, le tissu cube congelé doit être décongelé immédiatement avant l’étape d’homogénéisation.
Les échantillons de tissus congelés conviennent à d’autres applications en aval, y compris, par exemple, les modifications de l’analyse de la comète pour détecter les dommages oxydatifs ou les liaisons croisées, et l’évaluation des changements dans l’expression des gènes. La prudence doit être de mise lors de la manipulation des lames de scalpel pour couper ou gratter les tissus, et lors de la manipulation de l’azote liquide pendant le processus de congélation.
