Dieses Protokoll erfordert die Verwendung eines einzigen Dichtegradienten, der es im Vergleich zu komplexeren konventionellen Islet-Isolationsmethoden deutlich arbeitsintensiver und kostengünstiger macht. Der Hauptvorteil dieses Protokolls ist, dass das Enzym direkt an die Bauchspeicheldrüse abgegeben wird, was zu einer verbesserten Gewebeverdauung und einer erhöhten Islet-Ausbeute führt. Beginnen Sie, indem Sie die Gliedmaßen der Maus in der Supine-Position kleben und den Körper mit 70% Ethanol besprühen.
Mit CoverglassZangen und gekrümmten chirurgischen Scheren, machen Sie einen etwa drei Zentimeter horizontalen Bauchhautschnitt und ziehen Sie die Haut auf, um die Bauchwand freizulegen. Machen Sie einen vertikalen Schnitt von drei bis vier Zentimetern am Bauchperitoneum, um die Bauchspeicheldrüse vollständig freizulegen und die Maus unter ein Sezierendes Mikroskop zu stellen. Drücken Sie den Leberlappen überlegen, um den Gallengang freizulegen, der als blassrosa Röhre erscheint, und bewegen Sie den Darm sanft von der rechten Lenden- und Iliasregion nach rechts von der Bauchhöhle, um den Gallengang und die Leberarterie freizulegen.
Verwenden Sie Schwartz micro serrefines, um den gemeinsamen Gallengang so nah wie möglich an der Leber zu klemmen und die Ampulla von Vater zu identifizieren, die sich an der Zwölffingerdarmpapille befindet und durch die Vereinigung des Bauchspeicheldrüsenkanals und des gemeinsamen Gallengangs gebildet wird. Mit Mikro-Adson-Zangen, um den gemeinsamen Gallengang zu ziehen, legen Sie eine 30-Spur-Halb-Zoll-Nadel, die an einer Drei-Milliliter-Spritze befestigt ist, die drei Milliliter frisch zubereitete Kollagennase P-Lösung enthält, in die Ampulla von Vater, die die Nadel parallel zum Gefäß für etwa ein Viertel der Gefäßlänge in den Kanal drückt. Sobald die Nadel an Ort und Stelle ist, stabilisieren Sie die Nadel mit Mikro Adson Zange und langsam und stetig injizieren drei Milliliter Kollagenase P Lösung in den Kanal.
Die Injektion gilt als erfolgreich, wenn die Kopf-, Nacken-, Körper- und Schwanzbereiche der Bauchspeicheldrüse vollständig aufgeblasen sind. Der richtige Einstieg in die Ampulla und die Cannulation des gemeinsamen Gallengangs sind entscheidend für eine erfolgreiche Verdauungsernte. Das Durchstechen der duktalen Wände reduziert die Wirksamkeit der Isolierung.
Mit gekrümmten und mikroadon Zangen, ziehen Sie vorsichtig die aufgeblasene Bauchspeicheldrüse beginnend an der Milz und weiter in Richtung des Magens und entlang des Zwölffingerdarms. Dann legen Sie die Bauchspeicheldrüse in eine 50 Milliliter Verdauungsröhre mit drei Millilitere eiskalte Kollagenase P-Lösung. Um die Inselchen zu ernten, verwenden Sie zuerst eine feine chirurgische Schere, um die Bauchspeicheldrüse für drei bis fünf Sekunden zu hacken, bevor Sie das Rohr in einem 37 Grad Celsius Wasserbad bei 100 bis 120 Umdrehungen pro Minute für 12 bis 13 Minuten platzieren.
Am Ende der Inkubation schütteln Sie das Rohr vorsichtig für etwa 30 Sekunden, um das Gewebe zu stören, bis die Lösung homogen ist, wie durch feine sandartige Pankreasgewebepartikel bestätigt wird. Sobald das Gewebe verdaut ist, legen Sie die Röhre auf Eis und fügen Sie 40 Milliliter eiskalte Stop-Lösung hinzu, um die enzymatische Reaktion zu beenden. Nach sanftem Stören des Pellets das verdaute Gewebe in einer schwingenden Eimerzentrifuge, gefolgt von zwei Zentrifugationen mit 20 Milliliterfrischer Stop-Lösung pro Wäsche.
Nach der letzten Wäsche das Pellet in 40 Millilitereeisis HBSS für drei zusätzliche Waschungen wieder aufsetzen und das Pellet in fünf Milliliterraum-Temperaturgradientenlösung nach der letzten Wäsche wieder aufhängen. Wirbeln Sie das Rohr kurz bei niedriger Geschwindigkeit, bis die Lösung homogenisiert wird, bevor Sie weitere fünf Milliliter Raumtemperaturgradient in das Rohr einfügen. Verwenden Sie nun eine 10-Milliliter-Pipette, um 10 Milliliter Raumtemperatur-HBSS in tropfenweise in das Rohr zu geben, um die Bildung eines Gradienten zu ermöglichen und eine schwingende Eimerzentrifuge zu verwenden, um die Zellpopulationen durch Dichtegradiententrennung zu isolieren.
Verwenden Sie am Ende der Zentrifugation eine 10 Milliliter Pipette vornass mit kaltem HBSS, um fünf bis zehn Milliliter der Isletschicht zwischen dichtem Gradienten und HBSS zu sammeln. Übertragen Sie die Inselchen in eine neue 50-Milliliter-Röhre mit 20 Milliliterfrischer eiskaltem HBSS und sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation in einer schwingenden Eimerzentrifuge. Alle bis auf die letzten drei Milliliter des Überstandes vorsichtig ansaugen, ohne das Pellet zu stören und die Inselchen mindestens drei weitere Male mit 20 Millilitern frischer HBSS pro Wäsche zu waschen.
Nach der letzten Wäsche, ersetzen Sie den Überstand mit vier Milliliter 37 Grad Celsius RMPI 1640 medium und wirbeln Sie das Rohr sanft, um das Pellet zu lösen. Gießen Sie die Inseln sofort in eine 100-Millimeter-Petrischale und waschen Sie das Rohr mit fünf Millilitern frischem RPMI 1640 Medium, um alle verbleibenden Inselchen zu sammeln, die die Wäsche mit den anderen Inseln bündeln. Dann verwenden Sie ein Seziermikroskop und eine 20 Mikroliter Pipettenspitze, um gesunde kugelförmige oder längliche goldbraune Inselchen mit einer glatten Oberfläche aus der Petrischale für den Transfer in eine neue Petrischale mit 10 Millilitern komplettem RPMI 1640 Medium zu pflücken.
Wenn alle Inseln gesammelt wurden, legen Sie die Inseln in einem sterilen Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid in befeuchteter Luft über Nacht. Gute gesunde Inselchen scheinen eine glatte runde Form zu haben, während schlecht beschädigte Inselchen raue Kanten aufweisen. Unverdautes Exokringewebe ist lichtdurchlässig im Aussehen und zeigt eine unregelmäßige Form.
Eine richtige Konservenierung und Verteilung des Kollagenase-P-Enzyms kann durch eine Inflation des Milzteils der Bauchspeicheldrüse bestätigt werden. Die nächtliche Inkubation in glukosearmen Medien kann die Inselchen am nächsten Tag für einen glukosestimulierten Insulinsekretionstest grundieren, der Einen Einblick in die Insulinsekretorienkapazität der Inseln ermöglicht.
