Le principal avantage de cette technique est qu’elle reflète l’activité de l’ARN polymésase II en mesurant l’ARNm nouvellement synthétisé qui ne sont pas influencés par la dégradation de l’ARN. Ce protocole a été décrit à l’origine utilisant l’hybridation de microarray, mais peut facilement être adopté au séquençage élevé-tout au long de l’ARNm nouvellement transcrit. Tiago Baptista, un ancien diplômé de notre laboratoire, démontrera cette procédure.
Après avoir inoculé les cellules S.cerevisiae, les cultiver pendant la nuit à 30 degrés Celsius avec agitation constante à 150 RPM. Le lendemain, mesurez la densité optique à 600 nanomètres. Diluer la culture à un OD600 d’environ 0,1 dans 100 millilitres de milieu YPD.
Faire grandir les cellules jusqu’à ce que l’OD600 soit d’environ 0,8. Après cela, mesurer l’OD600 de la culture du jour au lendemain S.pombe. Diluer cette culture à un OD600 d’environ 0,1 dans 500 millilitres de milieu YAS et laisser grandir jusqu’à ce que l’OD600 est d’environ 0,8.
Tout d’abord, préparer une nouvelle solution de deux molar quatre thiouracil. Gardez la solution préparée à température ambiante et à l’abri de la lumière. Ajoutez la solution à quatre thiouracils aux cultures S.cerevisiae et S.pombe de telle sorte que la concentration finale soit de cinq millimolaires.
Incuber les cultures S.cerevisiae et S.pombe à 30 degrés Celsius et 32 degrés Celsius respectivement avec agitation constante pendant six minutes. Après cela, retirez un petit aliquot de chaque culture et comptez les cellules à l’aide d’un compteur de cellules automatique ou d’une chambre Neubauer. Centrifugeuse à 2500 fois g et quatre degrés Celsius pendant cinq minutes pour recueillir les cellules.
Jetez le supernatant et lavez les cellules avec de la glace froide une fois PBS. Centrifugeuse à nouveau à 2500 fois g et quatre degrés Celsius pendant cinq minutes. Ensuite, resuspendez les cellules en cinq millilitres de froid glacial une fois PBS.
Mélanger les cellules S.cerevisiae et S.pombe à un rapport de trois pour un. Centrifuger les échantillons mélangés à 2 500 fois g et quatre degrés Celsius pendant cinq minutes. Retirez ensuite le PBS et clignotez les cellules dans de l’azote liquide.
Conserver l’échantillon à 80 degrés Celsius négatif jusqu’à ce qu’il soit prêt à l’emploi. Lorsque vous êtes prêt à procéder, décongeler les cellules sur la glace pendant environ 20 à 30 minutes. Utilisez un kit d’extraction d’ARN de levure adapté pour extraire l’ARN tel que décrit dans le protocole de texte.
Après cela, transférez la cartouche de filtre dans le tube de collecte final. Elute l’ARN avec 50 microlitres d’eau sans RNase traitée par DEPC qui a été préchauffée à 100 degrés Celsius. Centrifugeuse à 16 000 fois g pendant une minute.
Utilisez ensuite 50 microlitres d’eau sans RNase préchauffée traitée par DEPC pour éduuter à nouveau l’ARN dans le même tube. Centrifugeuse à 16 000 fois g pendant une minute pour s’assurer que tout le volume de l’échantillon est passé à travers le filtre. Si ce n’est pas le cas, centrifugez à nouveau pendant une plus longue période de temps.
Une fois terminé, quantifier et vérifier la pureté de l’échantillon à l’aide de l’équipement approprié. Utilisez de l’eau sans nucléase traitée par DEPC pour ajuster la concentration de l’ARN précédemment acquis à deux milligrammes par millilitre. Aliquot 200 microgrammes d’ARN total et le chauffer à 60 degrés Celsius pendant 10 minutes.
Refroidissez-le immédiatement sur la glace pendant deux minutes. Ajouter 600 microlitres d’eau sans RNase traitée par DEPC. Ajouter 100 microlitres de tampon de biotinylation, puis ajouter 200 microlitres de biotine HPDP.
Si la solution HPDP de biotine se précipite hors de la solution, augmentez le volume de DMSO ou de DMF jusqu’à 40% du volume de réaction tel que décrit dans le protocole de texte. Protégez l’échantillon de la lumière et incubez-le à température ambiante avec une agitation douce pendant trois heures. Après cela, ajouter un volume à peu près égal de chloroforme aux tubes et mélanger vigoureusement.
Centrifugeuse à 13 000 fois g et quatre degrés Celsius pendant cinq minutes. Ensuite, transférez soigneusement la phase supérieure dans de nouveaux tubes de deux millilitres. Ajouter une quantité de cinq chlorure de sodium molaire égale à environ 1/10 du volume de l’échantillon.
Ensuite, mélanger l’échantillon. Tout d’abord, chauffer l’ARN biotinylé à 65 degrés Celsius pendant 10 minutes. Réfrigérer ensuite les échantillons sur la glace pendant cinq minutes.
Ajouter 100 microlitres de perles magnétiques enduites de streptavidine à l’ARN biotinylé. Incuber à température ambiante avec une légère secousse pendant 90 minutes. Placez les colonnes fournies avec le kit dans le support magnétique.
Ensuite, ajoutez 900 microlitres de tampon de lavage à température ambiante aux colonnes. Appliquer le mélange de perles et d’ARN de 200 microlitres sur les colonnes. Recueillir le flow-through dans des tubes de 1,5 millilitre, puis l’appliquer à nouveau à la même colonne magnétique.
Gardez ce flux si nécessaire car il représente la fraction arn non étiqueté. Pour commencer la validation RT-qPCR des différentes fractions, synthétisez d’abord cDNA tel que décrit dans le texte. Ensuite, amplifiez l’ADN en temps réel qPCR à l’aide d’un protocole standard.
Les niveaux mesurés de transcriptions en fractions purifiées à partir de cellules de type sauvage cultivés avec et sans quatre thiouracil ont confirmé cette procédure purifie spécifiquement l’ARN étiqueté. L’analyse de la souche delta du spt20 révèle que la quantité totale d’ARN à l’état stable est en grande partie inchangée ou n’est que légèrement réduite pour les gènes testés. Des résultats similaires sont observés pour les souches supprimées pour bre1.
Cependant, l’analyse de l’ARN nouvellement transcrit dans la souche du delta du spt20 révèle une diminution de trois à cinq fois la synthèse de l’ARNm pour tous les gènes testés. Pendant ce temps, la perte de bre1 conduit à une diminution plus discrète mais encore visible. Lors de l’épuisement inductible du spt7, une sous-unité structurelle du complexe saga, les niveaux nouvellement transcrits d’ARNm sont réduits dans une mesure similaire à la souche de suppression.
Lorsque les niveaux totaux d’ARN sont mesurés par analyse à l’échelle du génome, seuls quelques gènes sont considérés comme faisant modifier leurs niveaux d’expression lors de la suppression du spt20, soit par régulation vers le haut, soit par régulation vers le bas. Cependant, l’analyse de l’ARN nouvellement transcrit révèle que les niveaux de plus de 4000 gènes sont significativement réduits au moins deux fois lors de la suppression du spt20, ce qui suggère un effet positif global de la saga sur la transcription de la polymése II arn chez les levures en herbe. Bien que cette méthode puisse fournir un aperçu de la transcription dans Saccharomyces cerevisiae, elle n’a été appliquée qu’avec de légères variations à En utilisant ce protocole, nous avons pu détecter une diminution globale de la synthèse de l’ARNm qui a été compensée par une diminution globale de la dégradation de l’ARNm.
