Les mitochondries sont des organites essentiels des cellules eucaryotes capables de respirer aérobie. Leur dysfonctionnement est une source bien connue de maladie humaine. Les mitochondries de levure de Baker contiennent un génome circulaire codant huit protéines.
Dans cette vidéo, nous avons décrit le protocole utilisé pour l’analyse de la biosynthèse protéique dans les mitochondries de levure au moyen de l’étiquetage radioactif des produits translationnels et de la séparation subséquente par électrophoresis gel. La procédure comprend plusieurs étapes majeures. Streak levure de cultures de bouillon congelés sur des assiettes fraîches avec un milieu approprié.
Mettez les assiettes dans l’incubateur de culture à 30 degrés pendant 24 à 48 heures. Inoculer ces cultures en deux millilitres de milieu de la strie fraîche dans un tube de 15 millilitres et les incuber pendant la nuit agitant à 200 RPM à 30 degrés. Mesurer la densité optique de la culture à la longueur d’onde de 600 nanomètres.
Prenez le volume correspondant à 0,2 unités d’absorption dans les cellules de levure palette tubes stériles à 9000 G pendant 30 secondes à température ambiante. Jetez ce supernatant. Lavez les cellules avec 0,5 millilitres d’eau stérile en tourbillonnant pendant cinq secondes.
Paletter les cellules de levure à 9000 G pendant 30 secondes à température ambiante. Jeter le surnatant. Diluer les cellules en deux millilitres de linge frais moyen d’agar.
Bord d’incubation pris à 200 RPM et 30 degrés jusqu’à ce que la densité optique atteigne de 1,5 à 1,9 de 1,5 à 1,9 valeurs. Transférer le volume de culture équivalent à une unité optique dans un tube de micro centrifugeuse. Faire tourner les tubes à 3000 G pendant une minute.
Jeter le surnatant. Lavez les cellules avec 0,5 millilitres d’eau stérile en tourbillonnant pendant cinq secondes. Paletter les cellules de levure à 9000 G pendant 30 secondes à température ambiante Jeter le supernatant.
Suspendre à nouveau les cellules de levure dans 0,5 millilitres de tampon de traduction stérile. Placer la suspension dans un tube de 15 millilitres. Ajouter le cycloheximide à la suspension cellulaire jusqu’à une concentration finale de 0,2 milligramme par millilitre d’incubation pendant cinq minutes de bord pris à 200 RPM et 30 degrés pour inhiber la traduction cytosolique.
Ajouter de 25 à 30 Ajouter de 25 à 30 microcourards de méthionine S35 de la méthionine S35 à la suspension cellulaire et incuber pendant 30 minutes bord pris à 200 RPM et 30 degrés. Ajouter la méthionine froide non étiquetée et la borymycine pour arrêter l’étiquetage Incubate pendant 10 minutes bord pris à 200 RPM et 30 degrés. Recueillir les cellules de levure par centrifugation à 9000 G pendant 30 secondes.
Lavez les cellules avec 0,5 millilitres d’eau stérile en tourbillonnant pendant cinq secondes. Paletter les cellules de levure à 9000 G pendant 30 secondes à température ambiante. Jeter le surnatant.
Ajouter 75 microlitres de tampon de lyse à la palette et au vortex pendant cinq à dix secondes. Ajouter 500 microlitres de 0,5 molar tris tampon de 0,5 molaire tris tampon avec pH 6,8. Avec pH 6.8.
Vortex brièvement. Ajouter 600 microlitres de méthanol à l’échantillon. Vortex pendant cinq secondes.
Ajouter 150 microlitres de chloroforme à l’échantillon. Vortex pendant cinq secondes. Centrifugeuse les échantillons pendant deux minutes à 12 000 G.Jetez soigneusement l’opaface avec un échantillonneur.
Ajouter 600 microlitres de méthanol à l’échantillon. Mélanger soigneusement en inversant le tube plusieurs fois. Centrifugeuses pendant deux minutes à 12 000 G.Jeter le supernatant.
Sécher à l’air le palettisation pendant deux minutes à 80 degrés. Dissoudre les protéines précipitées dans 60 microlitres de tampon échantillon Laemmli. Chauffer les échantillons pendant 10 minutes à 14 degrés.
Causer le gel polyacrylamide SDS 17,5%Laemmli. Charger 15 microlitres de chaque échantillon dans les poches. Faire fonctionner le gel dans la chambre froide jusqu’à ce que le colorant bleu atteigne environ 65% de la lymphe gel.
Tachez le gel avec kumasi bleu brillant et faire l’analyse ou la photo qui est nécessaire comme contrôle de chargement. Sécher le gel dans le séchoir à gel. Gardez-le dans la cassette avec écran de phosphore de stockage pendant trois à cinq jours.
Numérisez l’écran sur l’imageur de phosphore. Suivant le protocole décrit ci-dessus, nous avons attribué des produits de traduction mitochondrial de deux souches de Cerevisiae de Saccharomyces. Le type sauvage et la suppression de variante mutante du gène Aim23 codant le facteur d’initiation mitochondrique de traduction trois.
Les produits de traduction mitochondrial étaient déjà activement étiquetés et séparés dans le gel de polyacrylamide dénaturant. Les échantillons ont été prélevés toutes les deux minutes et demie avant la saturation pour construire le cours du temps. Le gel a été taché, séché et filtré après l’exposition de cinq jours.
Dans le cas d’une expérience réussie, l’image montre huit bandes assignées selon le modèle standard. Cependant, les intensités des bandes individuelles peuvent être très variables selon la souche et les conditions expérimentales. Chaque bande correspond à un produit de traduction.
Les données suggèrent que la souche mutante est capable de synthèse des protéines mitochondriales parce que tous les produits apparaissant dans le type sauvage sont visibles dans ce mutant. Cependant, les intensités des bandes sont différentes du type sauvage, ce qui signifie que cette suppression d’Aim23 affecte l’expression du gène mitochondrial. Kumasi brassé en tache bleue et sert de contrôle de chargement.
Leur résultat en données peut être quantifié pour identifier les différences entre les souches ou les conditions expérimentales à l’aide du logiciel Image G ou Image Quan. Pour ceux-ci, le rapport du signal correspondant à chaque produit est calculé au signal total. Les valeurs moyennes et les écarts types sont calculés dans au moins trois expériences indépendantes.
La cinétique des protéines synthétisées retournées est étudiée au cours d’une expérience de l’année écoulée. Les échantillons sont prélevés aux points de temps indiqués après l’arrêt de la réaction d’étiquetage par la méthionine froide et la borymycine. Ce contrôle est nécessaire pour estimer la stabilité du produit.
Immuno-coloration avec anti-porine un anticorps est un contrôle de chargement. Nous avons décrit la méthode, qui est souvent utilisée pour étudier la biosynthèse protéique dans les mitochondries de levure. Ce protocole est relativement simple et rapide à exécuter.
Dans le même temps, il permet d’obtenir des informations précieuses sur le taux de traduction de quatre aDRM mitochondriaux de levure, ce qui est très avantageux. Cependant, il a plusieurs limitations nécessitant des expériences supplémentaires et se trouve dans ces niveaux interétatiques de protéines et d’ARNM. Il peut fournir des informations sur ces fonctions dans le système de traduction mitochondrial, mais des techniques plus avancées devraient être utilisées pour découvrir le mécanisme.
