Cette méthode peut aider à répondre aux questions clés concernant le cycle biogéochimique du cadmium et du mercure, comme la façon dont différentes variables environnementales influent sur leur biodisponibilité aux bactéries. Le principal avantage de cette technique est qu’elle offre des données de biodisponibilité en temps quasi réel et des cellules viables indépendamment de la présence d’oxygène. Généralement, les personnes nouvelles à cette méthode auront du mal parce qu’il ya beaucoup de temps étapes sensibles qui nécessitent une attention très méticuleuse aux détails.
La démonstration de la procédure sera Ben, un étudiant diplômé de mon laboratoire. Pour se préparer à l’analyse, récupérez le biocapteur inductible au mercure et le biocapteur exprimé de façon constitutive à partir d’un stock cryo de moins 80 degrés Celsius. Plaquez les cellules sur des plaques de bouillon lysogène contenant 120 microgrammes par millilitre d’ampicilline.
Cultivez les cultures de plaques dans un incubateur à 37 degrés Celsius pendant la nuit. Entre 16 h 30 et 17 h.m. inoculent une culture en dix millilitres de LB avec de l’ampicilline et poussent toute la nuit à 37 degrés Celsius avec des secousses à 220 rpm.
Entre neuf et dix heures .m le lendemain matin, apportez la culture ainsi que le milieu de croissance précédemment préparé dans la chambre anaérobie. Ajouter ensuite huit millilitres de milieu de croissance frais et 210 microgrammes par millilitre d’ampicilline dans un tube de balles stérile.
Maintenant, recueillir deux millilitres de la culture cultivée pendant la nuit et transférer dans un tube de micro centrifugeuse de deux millilitres. Après avoir centrifugé à 10 000 RCF pendant 90 secondes, retirez le supernatant et résépendez en deux millilitres de milieu de croissance frais. Ajoutez ensuite la culture résuspendue au tube de balles contenant huit millilitres de milieu de croissance frais et d’ampicilline.
À l’aide d’une technique stérile, placez soigneusement un bouchon en caoutchouc sur le tube de balles avant de l’enlever de la chambre anaérobie. Placez ensuite le tube dans un incubateur et développez-le anaérobiement à 37 degrés Celsius en secouant à 220 rpm. Entre trois et cinq p.m.
apporter le tube de balch avec la culture, un nouveau tube stérile de balch, et le milieu de croissance dans la chambre anaérobie. Ajouter 100 microlitres de la culture à 10 millilitres de milieu de croissance frais avec de l’ampicilline dans le tube stérile de balch. À l’aide d’une technique stérile, placez soigneusement un bouchon en caoutchouc sur le tube de balles.
Retirez le tube de la chambre anaérobie avant de le faire pousser pendant la nuit à 37 degrés Celsius en secouant à 220 rpm. Entre neuf et dix .m, le lendemain, transférez la culture et le milieu de croissance à la chambre anaérobie.
Ajouter à nouveau huit millilitres de milieu de croissance et d’ampicilline dans un tube stérile de balles. Transférer deux millilitres de la culture cultivée pendant la nuit dans un tube de micro centrifugeuse de deux millilitres. Après centrifugation comme avant, enlever le supernatant et resuspendre les cellules en deux millilitres de milieu de croissance frais.
Ajoutez ensuite la culture résuspendée au tube de balles contenant le milieu de croissance frais et l’ampicilline. À l’aide d’une technique stérile, placez soigneusement un bouchon en caoutchouc sur le tube de balles. Retirez-le de la chambre et cultivez anaérobiement à 37 degrés Celsius en secouant à 220 rpm.
Surveillez la croissance de la culture à l’aide d’un spectrophotomètre en tourbillonnant la culture, puis en mesurant la densité optique à 600 nanomètres ou OD600. Après trois à quatre heures de croissance prévue, la culture devrait atteindre un OD600 de 6. Maintenant, apportez le tube dans la chambre anaérobie et transférez la culture dans deux tubes de micro centrifugeuse de deux millilitres.
Après centrifugation comme avant enlever le supernatant et resuspendre chaque palais cellulaire en deux millilitres de milieu d’exposition frais. Répétez cette étape de lavage une fois pour enlever toute trace du milieu de croissance. Maintenant, combinez les deux tubes de micro centrifugeuse de la culture cellulaire dans un flacon standard PTFE de sept millilitres pour obtenir le stock de biocapteurs pour une utilisation dans l’analyse d’exposition.
Avant de commencer l’expérience, vérifiez le moniteur anaérobie pour s’assurer qu’il n’y a pas d’oxygène dans la chambre anaérobie. Concevoir la disposition de la plaque selon un modèle de puits 96. Pour exécuter des expériences dans des répliques techniques de trois cela permettra de 32 traitements différents, qui est mieux représenté avec une grille de quatre par huit pour mettre en place les flacons.
Configurer la grille quatre par huit en fonction de la disposition des plaques d’essai. Placez ensuite sept flacons ptfe standard millilitres dans le plateau. Les flacons ne doivent être manipulés qu’en manipulant l’extérieur du flacon.
Ajouter le volume moyen d’exposition dans chaque flacon correspondant à chaque traitement. À chaque flacon ajouter le volume correspondant de la variable chimique à tester en fonction de la disposition de la plaque. Maintenant, ajoutez du nitrate à chaque flacon de sorte que la concentration est de 200 micromolaires.
Exclure cette étape pour les blancs constitutifs de traitement des biocapteurs. Pour ajouter du mercure aux flacons, prenez d’abord le stock de quatre à huit micromolaires et secouez bien. Diluer la solution et le milieu d’exposition dans un flacon PTFE de sept millilitres à une concentration de 100 à 250 nanomolaires pour faire une solution de mercure de travail.
À partir de cette solution de travail, ajouter du mercure aux flacons requis en fonction de la disposition des plaques. Après avoir ajouté le mercure ou le cadmium secouer manuellement la plaque dans un mouvement orbital. L’expérience peut être interrompue maintenant en fonction du temps nécessaire pour que le mercure ou le cadmium spéciate dans la solution.
Lorsque l’expérience est reprise, pipette doucement biocapteur stock d’avant en arrière pour assurer l’homogénéité. Ajouter ensuite 100 microlitres du stock de biocapteurs à chaque flacon et secouer manuellement la plaque comme avant. Réchauffez le lecteur de plaque à 37 degrés Celsius et installez une course cinétique pendant dix heures avec des lectures toutes les deux pointes cinq à cinq minutes.
Une orbitale secouant entre les lectures. Mettez en place la course pour prendre des mesures de fluorescence avec une excitation de fluorescence de 440 nanomètres et une émission de 500 nanomètres. Maintenant pipette 200 microlitres de chaque flacon PTFE dans la grille quatre par huit dans les puits correspondants de la plaque de puits 96.
Pipette va-et-vient cinq fois avant de transférer chaque 200 microlitres. Au lieu de jeter la pointe pipette, laissez la pointe pipette dans le flacon PTFE pour garder une trace de la progression de pipetage. Placez la plaque de puits 96 dans le plateau du lecteur de plaque.
Ensuite, placez le couvercle sur la plaque de puits 96 et commencer l’analyse. Voici des résultats représentatifs montrant des données corrigées de fluorescence en fonction du temps. La fluorescence est montrée avec des concentrations croissantes de mercure au biocapteur inductible.
Toutes les valeurs sont vierges au contrôle sans mercure. Les pics fluorescents peuvent être quantifiés pour montrer le signal fluorescent en fonction de la concentration de mercure ou de cadmium. Tant pour les biocapteurs inductibles que pour les biocapteurs constitutifs, la concentration de mercure ou de cadmium au milieu de la plage linéaire des capteurs inductibles devrait être utilisée pour tester les variables.
Voici des exemples d’un résultat non concluant avec le zinc. Et un résultat concluant avec le magnésium et le manganèse sur la biodisponibilité au mercure au biocapteur. Le résultat avec le zinc n’est pas concluant parce que la fluorescence constitutive se décompose avec la fluorescence inductible indiquant la toxicité.
Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler d’entrer dans les concentrations de cadmium ou de mercure car ceux-ci seront utilisés pour calibrer le biocapteur. À la suite de cette procédure, d’autres méthodes comme la modélisation thermodynamique des systèmes aqueux peuvent être effectuées pour répondre à d’autres questions telles que la façon dont des espèces chimiques spécifiques de mercure ou de cadmium affectent leur biodisponibilité. N’oubliez pas que travailler avec du cadmium et du mercure et des acides forts tels que l’acide sulfurique peut être extrêmement dangereux et des précautions telles que le port d’équipement de protection individuelle doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.
Après son développement, cette technique a ouvert la voie à des chercheurs dans le domaine de la microbiologie environnementale pour explorer le mercure anaérobie en temps quasi réel ou la biodisponibilité au cadmium et les microbes génétiquement rétractables.
