Cette méthode peut aider à répondre aux questions clés sur le cycle cellulaire et la dynamique des populations de cellules souches germinales chez C.elegans. Les principaux avantages de cette technique sont qu’elle ne nécessite pas de transgènes, qu’elle est compatible avec la coloration immunofluorescente et qu’elle peut être modifiée pour étudier les cellules dans de nombreuses conditions différentes. J’étais très excité quand j’ai vu cette méthode utilisée pour la première fois dans le laboratoire Scheda.
Bien que cette méthode puisse fournir un aperçu du cycle cellulaire de C.elegans, elle peut également être appliquée à des questions plus larges au sujet du vieillissement, de la nutrition, ou des génotypes modifiés. En général, les laboratoires nouveaux à cette méthode peuvent avoir du mal avec l’idiodisprépation initiale ou la coloration à l’hématoxyline de C.elegans. Commencez par utiliser une technique stérile pour ajouter 200 microlitres de 10 millimolaire EdU dans 100 millilitres de tampon M9 et les suppléments appropriés à quatre millilitres de culture fraîchement cultivée mg 1693 E.coli.
Faire idiodiscious exige un équilibre délicat entre EdU et supplémentation de thymidine. Comme la quantité de thymidine doit être suffisante pour que l’E coli se développe bien, alors que la quantité d’EdU doit être suffisante pour le bouclier robuste contre le nivellement. Après pas plus de 24 heures à 37 degrés Celsius et 200 RPM, utilisez la technique stérile pour diviser la culture entre deux et quatre tubes coniques stériles de 50 millilitres pour la centrifugation.
Resuspendez la pellatine quatre millilitres de tampon M9 frais et utilisez la même pipette pour appliquer environ 8 gouttes de solution E Coli MG1693 étiquetée EdU au centre de la température ambiante individuelle 60 millilitres M9 Une boîte de pétri de garde. Pour nourrir les bactéries étiquetées EdU aux nématodes, utilisez du PBS frais pour laver le C.Elegans d’un plat moyen de croissance nématode dans un tube de 1,5 millilitre et permettre aux animaux de se déposer brièvement par gravité. Lavez les animaux une à deux fois avec un millilitre de PBS et utilisez une pipette pasteur en verre pour transférer les nématodes sur le centre de la pelouse de l’EdU dans une petite goutte de PBS.
Attendez quelques minutes pour que le liquide soit absorbé et incuber la culture pendant au moins 30 minutes à 20 degrés Celsius selon le protocole expérimental. À la fin de l’incubation, utiliser deux millilitres de PBS pour rincer les vers de la plaque de culture EdU dans un plat de dissecting en verre. Après la dissection et la fixation des 9odes nématodes comme décrit précédemment, rincez un petit tube en verre borosilicate d’un millilitre et une longue pipette pasteur en verre avec PBS complétée par 0,1% d’interpolation 20 et utilisez la pipette pour transférer les 9ds fixes au tube dans une petite quantité de interpolation PBS.
Recueillir les 9ades par centrifugation et utiliser une longue pipette de pâturage en verre tiré pour enlever autant supernée que possible sans déranger la pastille de gonad. Pour la détection edu, ajouter 100 microLitres de clic cocktail EdU aux 9ds et couvrir le tube avec un film de laboratoire pour une incubation de 30 à 60 minutes à température ambiante. À la fin de l’incubation, lavez les oisons une fois avec 100 microLitres de tampon de rinçage de réaction, et quatre fois avec un millilitre de préadolescent PBS.
Après le dernier lavage, ajouter 25 microLitres de support anti-fondu complété par DAPI à l’échantillon. Pendant que le milieu s’installe au-dessus des 9ds, placez un grand tampon agarose de 2,5 % sur une lame de microscope en verre standard. Puis aplatir avec une deuxième diapositive.
Ensuite, utilisez une longue pipette pasteur en verre et gardez tout le liquide et les 9ds dans l’extrémité étroite de la pipette pour minimiser la perte d’échantillon lors du transfert des 9ds à la garniture. À l’aide d’un cil collé à un cure-dent, répartir les 9ds sur le tampon d’agarose et enlever les particules de poussière. Puis abaissez lentement un couvercle rectangulaire en verre glisser sur les 9ons, en prenant soin d’éviter les bulles d’air, et en enlevant toute solution excédentaire avec un tissu de laboratoire.
Compter les cellules en trois dimensions prend de façon fiable une certaine pratique. L’utilisation du comptoir cellulaire fidjien plug-in et un script comme marque les cellules pour supprimer les doublons contribue à rendre les comptes reproductibles. Après avoir laissé le glissement de couverture se régler pendant la nuit, utilisez le comptoir cellulaire plug-in et Fidji pour compter manuellement chaque noyau, en étiquetant chaque noyau individuel en fonction de la présence ou l’absence de phosphohistone trois EdU ou prégénérateur zone d’étiquetage cellulaire.
Le signal EdU se co-localisé avec le signal DAPI. Dans certains noyaux, le signal EdU couvre tous les chromosomes, tandis que dans d’autres noyaux, le signal EdU se localise à un à deux punkta lumineux, probablement sur le chromosome X, qui se reproduit tard dans la phase S. Le signal EdU d’un étiquetage réussi de 30 minutes localise à environ la moitié des noyaux dans la zone prégénérateur.
Bien que la technique fonctionne constamment chez les jeunes animaux adultes de type sauvage, une fraction importante des hermaphrodites de 5 jours ne parvient pas à étiqueter dans une impulsion edu de 30 minutes. La durée du G2 peut être estimée en analysant le pourcentage de noyaux dans la phase M qui sont positifs edu au cours du cours du temps, permettant le calcul de la durée médiane et maximale de G2. La durée du G2 et du G1 peut être estimée à partir du pourcentage de tous les noyaux de la zone prégénérateur positifs à l’EdU, ce qui permet de calculer la durée maximale des phases combinées. Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler d’utiliser le même lot de plats EdU pour minimiser la variabilité inter-expérimentale.
Après cette procédure, d’autres méthodes comme la coloration avec des anticorps supplémentaires peuvent être effectuées ou répondre à des questions supplémentaires sur le cycle cellulaire, le destin cellulaire, ou les voies de signalisation. N’oubliez pas que travailler avec des analogues nucléicides et du parafermeldahyde peut être dangereux, et que des précautions, comme le port de gants de nitrol, doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.
