Les auteurs remercient Alex Schier pour avoir bien voulu partager la lignée transgénique Zebrabow-M, Geoffrey Burns, pour le vecteur pDEST et Renee Ethier-Daigle pour l&#39;excellence des soins de la facilité de poissons et de lignes. FINANCEMENT: Nous sommes reconnaissants pour le soutien généreux de financement de NIDCR RO3DE024490 et Hôpitaux Shriners pour enfants (ECL) et des bourses de formation post-doctorants de Hôpitaux Shriners pour enfants (LR et YK).

Comité Massachusetts General Hospital institutionnel animal soin et l&#39;utilisation (IACUC) a approuvé toutes les procédures sous le numéro # 2010N000106 protocole. Ceci est en conformité avec l&#39;Association pour l&#39;évaluation et l&#39;accréditation des animaux de laboratoire Care International (AAALAC) des lignes directrices. 1. Réactifs et matériaux Préparation <ol><li> Préparer 1 L de 50X moyen E3 de l&#39;embryon (voir tableau 1) et de préparer 1 L de milieu d&#39;embryon E3 1X (voir tableau 2). </li><li> Préparer support d&#39;embryon E3 avec du N-phénylthiourée (PTU) en ajoutant 30 mg de PTU à 1 L de 1X E3. Incorporer O / N afin d&#39;assurer que le PTU dissolution complète. Stocker à température ambiante. </li><li> Pour préparer une solution de pronase, diluer 150 ul de la pronase (0,5 mg / ml) avec 15 ml de 1X E3. Cette quantité est suffisante pour 1 plat de Pétri. Utiliser immédiatement. </li><li> Préparer la solution de méthylcellulose. <ol><li> Préparer la solution E3-tricaïne en mélangeant 75 ml de 0,2% tricaïne avec 25 ml1X E3. Faire bouillir 3 g de méthylcellulose dans le 75 ml de solution E3-tricaïne. </li><li> Compléter le volume final à 100 ml avec une solution E3-tricaïne. La solution finale de la méthylcellulose est visqueux et opaque avec une teinte jaunâtre. Stockage: RT abri de la lumière. </li></ol></li><li> Tamoxifen stock et solution d&#39;induction <ol><li> Préparer 5 mM solution stock tamoxifène par dissolution de 4-hydroxytamoxifène dans 100% d&#39;éthanol. Les stocks en magasin à -80 ° C. </li><li> Préparer une dilution fraîche de tamoxifène à la concentration de désir dans 1X E3 pour obtenir la solution d&#39;induction. ATTENTION! S&#39;il vous plaît consulter la fiche signalétique avant l&#39;utilisation. </li></ol></li><li> Préparer 1 L de 0,2% tricaïne selon le Tableau 3. </li><li> Obtenir diapositives confocale. Collez quatre lamelle (18 x 18) pour former un bloc puis placez 2 blocs sur une lamelle de 24 x 60 cm 2 en dehors pour permettre le montage de l&#39;embryon dans le milieu. </li></ol> 2. Préparation d&#39;embryons <ol><li> Les lignées transgéniques. <br/&gt; NOTE: Zebrabow-M était un don généreux du laboratoire de Alex Schier. </li><li> SOX10: Cre-ERT2 REMARQUE: Générer le vecteur de ciblage pDestTol2- SOX10: ERT2-Cre en utilisant des méthodes de clonage moléculaire standard et obtenu commercialement recombinaison technologie du clonage. <ol><li> Mélanger 5 &#39;clone d&#39;entrée (pENTR5&#39;- sox10p) contenant 7.2Kb du promoteur SOX10, une passerelle clone moyenne (PME-ERT2-Cre), et un 3&#39; clone d&#39;entrée (pENTR3&#39;-polyA) dans une réaction LR avec la destination de l&#39;objectif vecteur pDestTol2- α-crystalline: YFP. </li><li> Purifier construction pDestTol2- SOX10: ERT2-Cre. Co-injecter la construction purifié (100 ng / ul) avec Tol2 transposase ARNm (50 ng / ul) dans des embryons WT (F0) au stade d&#39;une cellule. </li><li> Écran fondateurs F0 adultes pour la transmission de la lignée germinale repose sur une forte fluorescence jaune dans des embryons de F1. </li></ol></li><li> SOX10: ERT2-Cre; Zebrabow-M <ol><li> Outcross l&#39;Zebrabow-Mligne (2.1.1) avec le SOX10: lignée transgénique ERT2-Cre. </li><li> Sélectionner des embryons présentant une forte expression de la DP omniprésente et marqueur d&#39;objectif YFP et grandir eux jusqu&#39;à adultes. </li></ol></li></ol> 3. embryon Collection <ol><li> Mettre en place plusieurs paires de SOX10: ERT2-Cre; Zebrabow-M poisson zèbre transgénique 17 heures-18 heures le jour 1. </li><li> Le lendemain, retirez les séparateurs dans la matinée et de recueillir les oeufs autour de midi. </li><li> Les transférer sur des boîtes de Pétri et ajouter 15 ml de la solution de pronase à dechorionate les embryons. </li><li> Incuber les embryons pendant 1 à 5 min jusqu&#39;à environ 60% des embryons ont été dechorionated. Arrêter la réaction par décantation la solution de pronase et laver les embryons 3-4 fois avec le milieu E3 frais. </li><li> Incuber les embryons dechorionated dans E3 à RT O / N et laissez-les développer pour atteindre le stade 10 somites. Incuber 50-60 embryons par l&#39;embrayage pour éviter la croissance de développement différent. </li></ol&gt; 4. Traitement <ol><li> Vérifiez stade de développement de l&#39;embryon au microscope de champ lumineux pour assurer qu&#39;ils sont au stade 10 somites. </li><li> En utilisant un microscope à fluorescence avec une protéine fluorescente (RFP) filtre rouge, isoler les embryons rouge vif. </li><li> Procéder à l&#39;induction de la recombinaison Cre-en ajoutant 10 uM de solution hydroxytamoxifène pour la boîte de Pétri et incuber les embryons isolés à 28,5 ° C pendant 3 heures. </li><li> Décanter la solution tamoxifène et laver les embryons à plusieurs reprises avec l&#39;E3. ATTENTION! jeter la solution tamoxifène dans un conteneur à déchets biologiques spéciaux. </li><li> Incuber les embryons à 28,5 ° CO / N. </li><li> Lorsque les embryons sont approximativement les 28-29 stade de somites (environ 24 heures après la fécondation), incuber les embryons à 28,5 ° C dans E3-PTU solution ci-après. REMARQUE: PTU est ici utilisée pour inhiber la formation de mélanophores dans les embryons en développement. Ce traitement est nécessaire pouréviter la distorsion du signal de fluorescence par mélanophores auto-fluorescent. </li><li> Incuber les embryons à 28,5 ° C </li></ol> Sélection d&#39;embryons 5. <ol><li> Pour visualiser les structures cranio-faciales entièrement développés, sélectionner les embryons à 4 jours après la fécondation de l&#39;intensité du signal Rouge et Cre marqueur d&#39;expression positivité (jaune dans la rétine). </li><li> Anesthésier les embryons avec une solution E3 / 0,015% tricaïne. L&#39;anesthésie est confirmée lorsque aucun des mouvements actifs ou de l&#39;activité nageoire est observée lorsque aiguillonner doucement l&#39;embryon. </li></ol> 6. Montage de l&#39;embryon dans la méthylcellulose <ol><li> Transférer l&#39;embryon sélectionné pour l&#39;imagerie dans une boîte de Pétri contenant une goutte de méthylcellulose et embaumer doucement l&#39;embryon avec la méthylcellulose. </li><li> Sur une lame de confocale propre, placer une goutte de méthylcellulose fraîche et monter votre embryon sein de la goutte en utilisant une pointe microloader. Position embryon dorsale en prenant garde de ne pas toucherl&#39;embryon directement. </li><li> Couvrir l&#39;embryon monté avec une lamelle couvre-objet 25 x 25 et régler la position de l&#39;embryon, si nécessaire par la manipulation de la lamelle. </li><li> L&#39;embryon est maintenant prêt à l&#39;image. </li></ol> 7. L&#39;analyse par microscopie à fluorescence <ol><li> Utilisez l&#39;objectif 20x à sec de l&#39;objectif (ouverture numérique de 0,75, la taille sténopé 2,0 um) pour focaliser l&#39;embryon. </li><li> Appuyez sur le bouton L100 sur le microscope et sélectionner les canaux dans le logiciel. </li><li> Sélectionnez le bouton de configuration confocale et cliquez sur &#39;auto&#39; et sélectionner les canaux suivants avant de fermer la fenêtre: CH1: PCP, CH2: GFP, CH3: DP ou mCherry </li><li> Allumez CH2 et CH3 avant de cliquer sur le bouton &#39;supprimer verrouillage&#39;. Cliquez sur &#39;lecture&#39; pour lancer la numérisation. </li><li> Concentrez-vous sur la structure d&#39;intérêt, qui est le mieux fait en commençant avec ½ image / s et haute tension (HT) 150, puis en ajustant les paramètres en conséquence jusqu&#39;à ce que la qualité d&#39;image souhaitée est achieved. La demande de propositions serait plus brillante que les autres couleurs, donc ajuster la HV. Changez la position de Z à trouver à la fois YFP et les cellules positives DP. </li><li> Une fois réglé avec les paramètres, capturer l&#39;image de votre embryon. Enregistrer votre image dans le format du logiciel d&#39;imagerie et de format TIFF confocale pour le traitement d&#39;image dans chaque canal dédoublé. </li><li> Ensuite, pour l&#39;imagerie de la PCP, éteignez CH2 et CH3 et tourner sur CH1. Re-ajuster les paramètres comme dans l&#39;étape 5 sans changer la zone de mise au point. REMARQUE: PCP peut être vraiment difficile à détecter en raison de signal de fond dans le canal bleu qui peut être contourné en ajustant la taille sténopé. Une taille plus grande sténopé permet une meilleure détection de la fluorescence en réduisant le signal / bruit de fond. Cependant, une plus grande sténopé réduiront effet confocal, compromettre la qualité d&#39;image. Par conséquent, l&#39;ajustement soigneux des paramètres est nécessaire pour obtenir la qualité d&#39;image souhaitée et de l&#39;intensité. </li><li> Capturez l&#39;image et l&#39;enregistrer dans le format à la fois (logiciel confocale et TIFF) pour le traitement de l&#39;image. Les images peuvent alors être traitées en utilisant un logiciel commun de traitement d&#39;image pour fusionner les calques et d&#39;améliorer les paramètres de couleur comme décrit par Pan et ses collègues 8. </li></ol>

<ol>
	<li>Dougherty, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+requirements+for+wnt9a+and+irf6+in+extension+and+integration+mechanisms+during+zebrafish+palate+morphogenesis.">Distinct requirements for wnt9a and irf6 in extension and integration mechanisms during zebrafish palate morphogenesis.</a> Development. 140, 76-81 (2013).</li><li>Dougherty, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+fate+map+of+first+pharyngeal+arch+structures+in+the+sox10:+kaede+zebrafish+transgenic+model.">Embryonic fate map of first pharyngeal arch structures in the sox10: kaede zebrafish transgenic model.</a> The Journal of craniofacial surgery. 23, 1333-1337 (2012).</li><li>Eberhart, J. K., Swartz, M. E., Crump, J. G., Kimmel, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+Hedgehog+signaling+from+neural+to+oral+epithelium+organizes+anterior+craniofacial+development.">Early Hedgehog signaling from neural to oral epithelium organizes anterior craniofacial development.</a> Development. 133, 1069-1077 (2006).</li><li>Dixon, M. J., Marazita, M. L., Beaty, T. H., Murray, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleft+lip+and+palate:+understanding+genetic+and+environmental+influences.">Cleft lip and palate: understanding genetic and environmental influences.</a> Nature reviews Genetics. 12, 167-178 (2011).</li><li>Gfrerer, L., Dougherty, M., Liao, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+craniofacial+development+in+the+sox10:+kaede+transgenic+zebrafish+line+using+time-lapse+confocal+microscopy.">Visualization of craniofacial development in the sox10: kaede transgenic zebrafish line using time-lapse confocal microscopy.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , e50525 (2013).</li><li>McCollum, C. W., Ducharme, N. A., Bondesson, M., Gustafsson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+toxicity+screening+in+zebrafish.+Birth+defects+research.">Developmental toxicity screening in zebrafish. Birth defects research.</a> Part C, Embryo today : reviews. 93, 67-114 (2011).</li><li>Mossey, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dental+education+and+CPD:+are+you+being+served.">Dental education and CPD: are you being served.</a> British dental journal. Suppl, 3-4 (2002).</li><li>Pan, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrabow:+multispectral+cell+labeling+for+cell+tracing+and+lineage+analysis+in+zebrafish.">Zebrabow: multispectral cell labeling for cell tracing and lineage analysis in zebrafish.</a> Development. 140, 2835-2846 (2013).</li><li>Vieira, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Journal of dental research. 87, 119-125 (2008).</li><li>Le Pabic, P., Ng, C., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fat-Dachsous+Signaling+Coordinates+Cartilage+Differentiation+and+Polarity+during+Craniofacial+Development.">Fat-Dachsous Signaling Coordinates Cartilage Differentiation and Polarity during Craniofacial Development.</a> PLoS genetics. 10, e1004726 (2014).</li><li>Ricks, J. E., Ryder, V. M., Bridgewater, L. C., Schaalje, B., Seegmiller, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+mandibular+development+precedes+the+time+of+palate+closure+in+mice+homozygous+for+disproportionate+micromelia:+an+oral+clefting+model+supporting+the+Pierre-Robin+sequence.">Altered mandibular development precedes the time of palate closure in mice homozygous for disproportionate micromelia: an oral clefting model supporting the Pierre-Robin sequence.</a> Teratology. 65, 116-120 (2002).</li><li>Javidan, Y., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+cartilage+and+bone.">Development of cartilage and bone.</a> Methods in cell biology. 76, 415-436 (2004).</li><li>McCarthy, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pdgfra+protects+against+ethanol-induced+craniofacial+defects+in+a+zebrafish+model+of+FASD.">Pdgfra protects against ethanol-induced craniofacial defects in a zebrafish model of FASD.</a> Development. 140, 3254-3265 (2013).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Lignées transgéniques bleu Alcian et photoconvertible que décrit ci-dessus complète les uns aux autres pour définir le processus complexe de cartilage et le développement des os. Cependant, la migration cellulaire en direct et l&#39;organisation pendant l&#39;organogenèse a longtemps été supposé et indirectement démontré mais jamais visualisé. Zebrabow-M lignée transgénique couplé avec un cartilage Cre spécifique permet l&#39;observation en direct simultanée de tous ces événements distincts impliqué...

Développement craniofaciale exige, les interactions cellulaires et tissulaires moléculaires complexes à conduire la prolifération cellulaire, migration et la différenciation 1,2, 3. Ce processus étroitement régulé et complexe est soumis à des perturbations génétiques et environnementaux, tels que des malformations cranio-faciales sont parmi les malformations congénitales les plus courantes 1-9. Bien que les interventions chirurgicales restent le pilier du traitement des anomalies crânio-faciales, la compréhension de la base de développement est essentiel d&#39;innover futures thérapies. Par conséquent, l&#39;étude de la morphogenèse et les mécanismes de la convergence et l&#39;extension et l&#39;intégration de cellules fournit de nouvelles indications sur la formation du squelette cranio-facial 1. Crânienne migration de la crête neurale et remplir le premier arc pharyngien, processus mandibulaires forment alors jumelés qui se prolongent pour former le cartilage de Meckel, qui préfigure la mandibule. Morphogenèse of cartilage de Meckel l&#39;organisation nécessite prolifération des chondrocytes par directionnel, la polarisation et la différenciation cellulaires 1,10. Cependant, la complexité de l&#39;organisation des chondrocytes dans la croissance et l&#39;extension du cartilage de Meckel reste incertaine. Comprendre le comportement dynamique de la cellule est essentielle pour comprendre les malformations congénitales affectant la taille mandibulaire, comme phénotypes mandibule hypoplasie 11. Embryons de poisson zèbre offrent de nombreux avantages développementaux et génétiques pour étude détaillée du cartilage de la morphogenèse de Meckel. Leur traçabilité génétique, la transparence, ex vivo et le développement rapide des avantages puissants de prêt bien pour l&#39;observation du mouvement et de l&#39;organisation cellulaire par l&#39;imagerie en direct 6. Utilisation des outils de la lignée de traçage, comme SOX10: lignée transgénique kaede, nous et d&#39;autres avons délimité les origines de la crête neurale du squelette cranio-facial embryonnaire 1,5. Using l&#39;SOX10: ERT2-Cre avec le ubi: Zebrabow-M lignée transgénique, il est maintenant possible d&#39;explorer les détails des mouvements cellulaires au cours du développement cranio-facial. Le Zebrabow-M, est une lignée transgénique conçu avec le promoteur de l&#39;ubiquitine de conduire l&#39;expression de différents fluorophores, chacun flanqué par des sites Lox 8. Le fluorophore par défaut Zebrabow-M est rouge, exprimant RFP. Après induction de l&#39;expression Cre, l&#39;Zebrabow-M construire recombine et cellules expriment une combinaison de différents fluorophores (DP, CFP et YFP) créant expression multi-spectrale dans l&#39;embryon. Toutes les cellules filles qui divisent des cellules marquées après l&#39;événement de recombinaison par clonage sont ensuite marquées, de sorte que des populations de cellules qui dérivent de progéniteurs différentes sont juxtaposées par clonage étiquetés. En ce marquage cellulaire de clonage, les cellules prolifération et la migration à la résolution peuvent être suivies clonale (figure 1 et 2).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Pronase</td>
			<td>Roche Life Sciences</td>
			<td>10165921001</td>
			<td>Prepare 500 &#956;L stock aliquots at 50mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylcellulose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M0262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTU (N-Phenylthiourea)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7619</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E10521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-HydoxyTamoxifen</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 x 60 coverslips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-548-5P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 x 18 coverslips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-540A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 x 25 coverslips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-540C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pENTR5&#39;-TOPO TA Cloning Kit</td>
			<td>Life technologies&#160;</td>
			<td>K591-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pENTR/D-TOPO Cloning Kit&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>K2400-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pENTR3&#39;-pA</td>
			<td>Tol2Kit</td>
			<td>302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pDEST</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Gift from Geoffrey Burns labs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bright field microscope&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microscope&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image processing software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization of chondrocyte intercalation and directional proliferation via zebrabow clonal cell analysis in the embryonic meckel&#8217;s cartilage

Le développement des structures craniofaciales vertébrés exige une coordination précise de la migration cellulaire, la prolifération, l&#39;adhérence et la différenciation. Modélisation du cartilage de Meckel, un premier pharyngée dérivé de voûte, implique la migration de la crête neurale crânienne (CNC) cellules et le cloisonnement progressif, la prolifération et l&#39;organisation des chondrocytes différenciés. Plusieurs études ont décrit la migration CNC lors de la morphogenèse inférieure de la mâchoire, mais les détails de la façon dont les chondrocytes atteindre organisation dans la croissance et l&#39;extension du cartilage de Meckel reste incertaine. Le SOX10 limitée et induite chimiquement recombinase Cre médiée par recombinaison génère des permutations des protéines fluorescentes distinctes (DP, YFP et CFP), en créant ainsi un marquage multi-spectrale de cellules souches et de leur descendance, ce qui reflète populations clonales distinctes. Utilisation confocale time-lapse photography, il est possible d&#39;observer les chondrocytes behaviou au cours du développement du cartilage de Meckel le poisson zèbre. Marquage cellulaire multispectrale permet aux scientifiques de démontrer extension des chondrocytes de Meckel. Pendant la phase d&#39;extension du cartilage de Meckel, qui préfigure la mandibule, chondrocytes intercalent pour effectuer l&#39;extension comme ils empilent dans une seule rangée de cellules en couches organisée. Échec de ce processus d&#39;intercalation organisée à la médiation extension de cellules fournit l&#39;explication mécanistique cellulaire pour mandibule hypoplasie que nous observons dans les malformations mandibulaires.

Visualisation traditionnel du cartilage par taches bleues toute la montagne Alcian a été inestimable dans l&#39;observation du cartilage de Meckel développement et couramment utilisé pour visualiser finale cellulaire organisation 12 (figure 1A). Pour approfondir l&#39;analyse des chondrocytes développement des heures supplémentaires, en utilisant la lignée de traçage SOX10: Kaede lignées transgéniques nous a permis d&#39;étudier la migration cellulaire, la convergence et l...

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Visualization of Chondrocyte Intercalation and Directional Proliferation via Zebrabow Clonal Cell Analysis in the Embryonic Meckel&amp;#8217;s Cartilage

L&#39;organisation des cellules des os cranio-faciales a longtemps été supposé, mais jamais directement visualisées. Marquage des cellules multi-spectrale et en Live in vivo imagerie permet de visualiser le comportement des cellules dynamique dans la mâchoire inférieure du poisson zèbre. Ici, nous détaillons le protocole de manipuler Zebrabow poissons transgéniques et observons directement intercalation de cellules et les changements morphologiques des chondrocytes dans le cartilage de Meckel.

Visualisation des chondrocytes intercalation et directionnel prolifération clonale via Zebrabow analyse cellulaire dans le cartilage de l&#39;embryonnaire Meckel

Development of the vertebrate craniofacial structures requires precise coordination of cell migration, proliferation, adhesion and differentiation. ...

visualization-chondrocyte-intercalation-directional-proliferation-via

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Visualization of Chondrocyte Intercalation and Directional Proliferation via Zebrabow Clonal Cell Analysis in the Embryonic Meckel&#8217;s Cartilage

9.0K vues.  Harvard Medical School.  L'organisation des cellules des os cranio-faciales a longtemps été supposé, mais jamais directement visualisées. Marquage des cellules multi-spectrale et en Live in vivo imagerie permet de visualiser le comportement des cellules dynamique dans la mâchoire inférieure du poisson zèbre. Ici, nous détaillons le protocole de manipuler Zebrabow poissons transgéniques et observons directement intercalation de cellules et les changements morphologiques des chondrocytes d...

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Analysis of Coronary Vessels in Cleared Embryonic Hearts

Whole mount visualization of the embryonic coronary plexus from which the capillary and arterial networks will form is rendered problematic using standard microscopy techniques, due to the scattering of imaging light by the thick heart tissue, as these vessels are localized deep within the walls of the developing heart. As optical clearing of tissues using organic solvents such as BABB (1 part benzyl alcohol to 2 parts benzyl benzoate) has been shown to greatly improve the optical penetration depth that can be achieved, we combined clearance of whole, PECAM1-immunostained hearts, with laser-scanning confocal microscopy, in order to obtain high-resolution images of vessels throughout the entire heart. BABB clearance of embryonic hearts takes place rapidly and also acts to preserve the fluorescent signal for several weeks; in addition, samples can be imaged multiple times without loss of signal. This straightforward method is also applicable to imaging other types of blood vessels in whole embryos.

We present a protocol for the analysis of coronary vessels in whole embryonic murine hearts up to E15.5, using standard immunological staining methods followed by optical clearance and confocal microscopy. This technique enables visualization of blood vessels throughout the entire heart without the need for time-consuming analysis of serial sections.

Analyse des vaisseaux coronaires dans Coeurs embryonnaires Effacé

Whole mount visualization of the embryonic coronary plexus from which the capillary and arterial networks will form is rendered problematic using standard ...

Recherche

Biologie du développement

A 5-mC Dot Blot Assay Quantifying the DNA Methylation Level of Chondrocyte Dedifferentiation In Vitro

The dedifferentiation of hyaline chondrocytes into fibroblastic chondrocytes often accompanies monolayer expansion of chondrocytes in vitro. The global DNA methylation level of chondrocytes is considered to be a suitable biomarker for the loss of the chondrocyte phenotype. However, results based on different experimental methods can be inconsistent. Therefore, it is important to establish a precise, simple, and rapid method to quantify global DNA methylation levels during chondrocyte dedifferentiation.
Current genome-wide methylation analysis techniques largely rely on bisulfite genomic sequencing. Due to DNA degradation during bisulfite conversion, these methods typically require a large sample volume. Other methods used to quantify global DNA methylation levels include high-performance liquid chromatography (HPLC). However, HPLC requires complete digestion of genomic DNA. Additionally, the prohibitively high cost of HPLC instruments limits HPLC&#39;s wider application.
In this study, genomic DNA (gDNA) was extracted from human chondrocytes cultured with varying number of passages. The gDNA methylation level was detected using a methylation-specific dot blot assay. In this dot blot approach, a gDNA mixture containing the methylated DNA to be detected was spotted directly onto an N+ membrane as a dot inside a previously drawn circular template pattern. Compared with other gel electrophoresis-based blotting approaches and other complex blotting procedures, the dot blot method saves significant time. In addition, dot blots can detect overall DNA methylation level using a commercially available 5-mC antibody. We found that the DNA methylation level differed between the monolayer subcultures, and therefore could play a key role in chondrocyte dedifferentiation. The 5-mC dot blot is a reliable, simple, and rapid method to detect the general DNA methylation level to evaluate chondrocyte phenotype.

A 5-mC Dot Blot Assay Quantifying the DNA Methylation Level of Chondrocyte Dedifferentiation In Vitro

We present a method to quantify DNA methylation based on the 5-methylcytosine (5-mC) dot blot. We determined the 5-mC levels during chondrocyte dedifferentiation. This simple technique could be used to quickly determine the chondrocyte phenotype in ACI treatment.

Un dosage de point à 5 mC Quantification du niveau de méthylation d&#39;ADN de la Dedifférenciation des chondrocytes<em&gt; In Vitro</em

The dedifferentiation of hyaline chondrocytes into fibroblastic chondrocytes often accompanies monolayer expansion of chondrocytes in vitro. The global ...

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The efficient in vivo visualization of blood vessels and the reliable quantification of their complexity are key to understanding the biology and disease of the vascular network. Here, we provide a detailed method to visualize blood vessels with a commercially available fluorescent dye, human plasma acetylated low density lipoprotein DiI complex (DiI-AcLDL), and to quantify their complexity in Xenopus tropicalis. Blood vessels can be labeled by a simple injection of DiI-AcLDL into the beating heart of an embryo, and blood vessels in the entire embryo can be imaged in live or fixed embryos. Combined with gene perturbation by the targeted microinjection of nucleic acids and/or the bath application of pharmacological reagents, the roles of a gene or of a signaling pathway on vascular development can be investigated within one week without resorting to sophisticated genetically engineered animals. Because of the well-defined venous system of Xenopus and its stereotypic angiogenesis, the sprouting of pre-existing vessels, vessel complexity can be quantified efficiently after perturbation experiments. This relatively simple protocol should serve as an easily accessible tool in diverse fields of cardiovascular research.

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

This protocol demonstrates a fluorescence-based method to visualize the vasculature and to quantify its complexity in Xenopus tropicalis. Blood vessels can be imaged minutes after the injection of a fluorescent dye into the beating heart of an embryo after genetic and/or pharmacological manipulations to study cardiovascular development in vivo.

Visualisation et analyse quantitative de l&#39;angiogenèse embryonnaire dans<em&gt; Xenopus tropicalis</em

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The ...

Bioengineering of Humanized Bone Marrow Microenvironments in Mouse and Their Visualization by Live Imaging

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth factors, and extracellular matrix. The ability of HSCs to remain quiescent, self-renew or differentiate, and acquire mutations and become malignant depends upon the complex interactions they establish with different stromal components. To observe the crosstalk between human HSCs and the human BM niche in physiological and pathological conditions, we designed a protocol to ectopically model and image a humanized BM niche in immunodeficient mice. We show that the use of different cellular components allows for the formation of humanized structures and the opportunity to sustain long-term human hematopoietic engraftment. Using two-photon microscopy, we can live-image these structures in situ at the single-cell resolution, providing a powerful new tool for the functional characterization of the human BM microenvironment and its role in regulating normal and malignant hematopoiesis.

A method to create and live-image different humanized bone-marrow niches in mice is presented. Based on the supportive niche created by human mesenchymal cells, the addition of human endothelial cells induces the formation of human vessels, while the addition of rhBMP-2 induces the formation of human-mouse chimeric mature bone tissue.

Bioingénierie des microenvironnements humanisés de la moelle osseuse dans la souris et leur visualisation par imagerie en direct

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth ...

Clonal Analysis of Embryonic Hematopoietic Stem Cell Precursors Using Single Cell Index Sorting Combined with Endothelial Cell Niche Co-culture

The ability to study hematopoietic stem cell (HSC) genesis during embryonic development has been limited by the rarity of HSC precursors in the early embryo and the lack of assays that functionally identify the long-term multilineage engraftment potential of individual putative HSC precursors. Here, we describe methodology that enables the isolation and characterization of functionally validated HSC precursors at the single cell level. First, we utilize index sorting to catalog the precise phenotypic parameter of each individually sorted cell, using a combination of phenotypic markers to enrich for HSC precursors with additional markers for experimental analysis. Second, each index-sorted cell is co-cultured with vascular niche stroma from the aorta-gonad-mesonephros (AGM) region, which supports the maturation of non-engrafting HSC precursors to functional HSC with multilineage, long-term engraftment potential in transplantation assays. This methodology enables correlation of phenotypic properties of clonal hemogenic precursors with their functional engraftment potential or other properties such as transcriptional profile, providing a means for the detailed analysis of HSC precursor development at the single cell level.

Here we present methodology for the clonal analysis of hematopoietic stem cell precursors during murine embryonic development. We combine index sorting of single cells from the embryonic aorta-gonad-mesonephros region with endothelial cell co-culture and transplantation to characterize the phenotypic properties and engraftment potential of single hematopoietic precursors.

Analyse clonale des précurseurs embryonnaires de cellules souches hématopoïétiques à l’aide de cellule unique Index tri combinée avec Niche de cellules endothéliales co-culture

The ability to study hematopoietic stem cell (HSC) genesis during embryonic development has been limited by the rarity of HSC precursors in the early ...

Visualization of Tangential Cell Migration in the Developing Chick Optic Tectum

Time-lapse imaging is a powerful method to analyze migrating cell behavior. After fluorescent cell labeling, the movement of the labeled cells in culture can be recorded under video microscopy. For analyzing cell migration in the developing brain, slice culture is commonly used to observe cell migration parallel to the slice section, such as radial cell migration. However, limited information can be obtained from the slice culture method to analyze cell migration perpendicular to the slice section, such as tangential cell migration. Here, we present the protocols for time-lapse imaging to visualize tangential cell migration in the developing chick optic tectum. A combination of cell labeling by electroporation in ovo and a subsequent flat-mount culture on the cell culture insert enables detection of migrating cell movement in the horizontal plane. Moreover, our method facilitates detection of both individual cell behavior and the collective action of a group of cells in the long term. This method can potentially be applied to detect the sequential change of the fluorescent-labeled micro-structure, including the axonal elongation in the neural tissue or cell displacement in the non-neural tissue.

We describe the methods for fluorescent labeling of tangentially migrating cells by electroporation, and for time-lapse imaging of the labeled cell movement in a flat-mount culture in order to visualize migrating cell behavior in the developing chick optic tectum.

Visualisation de la Migration cellulaire tangentielle dans le Tectum optique de poussin en développement

Time-lapse imaging is a powerful method to analyze migrating cell behavior. After fluorescent cell labeling, the movement of the labeled cells in culture ...

In Vitro Assays to Evaluate the Migration, Invasion, and Proliferation of Immortalized Human First-trimester Trophoblast Cell Lines

Cell movement is a critical property of trophoblasts during placental development and early pregnancy. The significance of proper trophoblast migration and invasion is demonstrated by pregnancy disorders such as pre-eclampsia and intrauterine growth restriction, which are associated with inadequate trophoblast invasion of the maternal vasculature. Unfortunately, our understanding of the mechanisms by which the placenta develops from migrating trophoblasts is limited. In vitro analysis of cell migration via the scratch assay is a useful tool in identifying factors that regulate trophoblast migratory capacity. However, this assay alone does not define the cellular changes that can result in altered cell migration. This protocol describes three different in vitro assays that are used collectively to evaluate trophoblast cell movement: the scratch assay, the invasion assay, and the proliferation assay. The protocols described here may also be modified for use in other cell lines to quantify cell movement in response to stimuli. These methods allow investigators to identify individual factors that contribute to the cell movement and provide a thorough examination of potential mechanisms underlying apparent changes in cell migration.

Here, we present a highly accessible protocol for evaluating the cell movement in human trophoblast cells using three in vitro assays: the scratch assay, the transwell invasion assay, and the cell proliferation assay.

Tests in Vitro pour évaluer la Migration, Invasion et la prolifération de lignées cellulaires immortalisées humaine au premier trimestre trophoblaste

Cell movement is a critical property of trophoblasts during placental development and early pregnancy. The significance of proper trophoblast migration ...

Microinjection-based System for In Vivo Implantation of Embryonic Cardiomyocytes in the Avian Embryo

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a general challenge in developmental biology research. In the embryonic heart, this can be particularly difficult as regional differences in the expression of transcriptional regulators, paracrine/juxtacrine signaling cues, and hemodynamic force are all known to influence cardiomyocyte maturation. A simplified method to alter a developing cardiomyocyte's molecular and biomechanical microenvironment would, therefore, serve as a powerful technique to examine how local conditions influence cell fate and function. To address this, we have optimized a method to physically transplant juvenile cardiomyocytes into ectopic locations in the heart or the surrounding embryonic tissue. This allows us to examine how microenvironmental conditions influence cardiomyocyte fate transitions at single cell resolution within the intact embryo. Here, we describe a protocol in which embryonic myocytes can be isolated from a variety of cardiac sub-domains, dissociated, fluorescently labeled, and microinjected into host embryos with high precision. Cells can then be directly analyzed in situ using a variety of imaging and histological techniques. This protocol is a powerful alternative to traditional grafting experiments that can be prohibitively difficult in a moving tissue such as the heart. The general outline of this method can also be adapted to a variety of donor tissues and host environments, and its ease of use, low cost, and speed make it a potentially useful application for a variety of developmental studies.

In this method, embryonic cardiac tissues are surgically microdissected, dissociated, fluorescently labeled, and implanted into host embryonic tissues. This provides a platform for studying the individual or tissue level developmental organization under ectopic hemodynamic conditions, and/or altered paracrine/juxtacrine environments.

Microinjection-based System for In Vivo l’Implantation des Cardiomyocytes embryonnaires chez l’embryon aviaire

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a ...

A Semi-high-throughput Imaging Method and Data Visualization Toolkit to Analyze C. elegans Embryonic Development

C. elegans is the premier system for the systematic analysis of cell fate specification and morphogenetic events during embryonic development. One challenge is that embryogenesis dynamically unfolds over a period of about 13 h; this half day-long timescale has constrained the scope of experiments by limiting the number of embryos that can be imaged. Here, we describe a semi-high-throughput protocol that allows for the simultaneous 3D time-lapse imaging of development in 80&#8211;100 embryos at moderate time resolution, from up to 14 different conditions, in a single overnight run. The protocol is straightforward and can be implemented by any laboratory with access to a microscope with point visiting capacity. The utility of this protocol is demonstrated by using it to image two custom-built strains expressing fluorescent markers optimized to visualize key aspects of germ-layer specification and morphogenesis. To analyze the data, a custom program that crops individual embryos out of a broader field of view in all channels, z-steps, and timepoints and saves the sequences for each embryo into a separate tiff stack was built. The program, which includes a user-friendly graphical user interface (GUI), streamlines data processing by isolating, pre-processing, and uniformly orienting individual embryos in preparation for visualization or automated analysis. Also supplied is an ImageJ macro that compiles individual embryo data into a multi-panel file that displays maximum intensity fluorescence projection and brightfield images for each embryo at each time point. The protocols and tools described herein were validated by using them to characterize embryonic development following knock-down of 40 previously described developmental genes; this analysis visualized previously annotated developmental phenotypes and revealed new ones. In summary, this work details a semi-high-throughput imaging method coupled with a cropping program and ImageJ visualization tool that, when combined with strains expressing informative fluorescent markers, greatly accelerates experiments to analyze embryonic development.

A Semi-high-throughput Imaging Method and Data Visualization Toolkit to Analyze C. elegans Embryonic Development

This work describes a semi-high-throughput protocol that allows simultaneous 3D time-lapse imaging of embryogenesis in 80&#8211;100 C. elegans embryos in a single overnight run. Additionally, image processing and visualization tools are included to streamline data analysis. The combination of these methods with custom reporter strains enables detailed monitoring of embryogenesis.

Une méthode d'imagerie semi-haut débit et une boîte à outils de visualisation de données pour analyser C. elegans Embryonic Development

C. elegans is the premier system for the systematic analysis of cell fate specification and morphogenetic events during embryonic development. One ...

Laser Capture Microdissection of Mouse Embryonic Cartilage and Bone for Gene Expression Analysis

Laser capture microdissection (LCM) is a powerful tool to isolate specific cell types or regions of interest from heterogeneous tissues. The cellular and molecular complexity of skeletal elements increases with development. Tissue heterogeneity, such as at the interface of cartilaginous and osseous elements with each other or with surrounding tissues, is one obstacle to the study of developing cartilage and bone. Our protocol provides a rapid method of tissue processing and isolation of cartilage and bone that yields high quality RNA for gene expression analysis. Fresh frozen tissues of mouse embryos are sectioned and brief cresyl violet staining is used to visualize cartilage and bone with colors distinct from surrounding tissues. Slides are then rapidly dehydrated, and cartilage and bone are isolated subsequently by LCM. The minimization of exposure to aqueous solutions during this process maintains RNA integrity. Mouse Meckel&rsquo;s cartilage and mandibular bone at E16.5 were successfully collected and gene expression analysis showed differential expression of marker genes for osteoblasts, osteocytes, osteoclasts, and chondrocytes. High quality RNA was also isolated from a range of tissues and embryonic ages. This protocol details sample preparation for LCM including cryoembedding, sectioning, staining and dehydrating fresh frozen tissues, and precise isolation of cartilage and bone by LCM resulting in high quality RNA for transcriptomic analysis.

This protocol describes laser capture microdissection for the isolation of cartilage and bone from fresh frozen sections of the mouse embryo. Cartilage and bone can be rapidly visualized by cresyl violet staining and collected precisely to yield high quality RNA for transcriptomic analysis.

Microdissection de capture laser du cartilage embryonnaire de souris et de l'os pour l'analyse d'expression génique

Laser capture microdissection (LCM) is a powerful tool to isolate specific cell types or regions of interest from heterogeneous tissues. The cellular and ...