La thérapie génique ex vivo et la transplantation cellulaire autologue pour le traitement des erreurs innées du métabolisme dans le foie est une alternative importante à la thérapie pour ces troubles. Et nous permet non seulement de traiter ces troubles, mais de déterminer la biomasse nécessaire pour être en mesure d’atteindre un résultat thérapeutique. Cette approche évite également les conséquences significatives de l’immunosuppression et d’autres conséquences avec différents types de thérapies.
Dans le contexte actuel, nous utilisons cette approche pour traiter la tyrosinémie héréditaire de type 1. Cependant, l’idée est que ce sera une approche plate-forme pour traiter une multitude de maladies hépatiques différentes avec une altération minimale. Il est important d’être en mesure de visualiser cette technique parce qu’il ya une certaine variabilité quand il s’agit de visualiser l’efficacité de la perfusion, ce qui est essentiel pour obtenir des hépatocytes viables pour la transplantation.
Intervention chirurgicale effectuée par Robert Kaiser et Joseph Lillegard. Isolement cellulaire interprété par Zeji Du, Bruce Amiot. La purification cellulaire uau et la transduction ex vivo des cellules ont été faites par Caitlin VanLith.
La préparation des animaux et de la préparation de la SE a été effectuée par Kari Allen et Laurie Hillin. Pour effectuer l’entrée initiale du site portuaire, effectuez une technique hasson ouverte cephalad à l’ombibilicus d’un porc de ferme anesthésié, jusqu’à trois mois, grand, blanc. Introduction d’un trocar de 12 millimètres dans la cavité abdominale, où le péritoine est visible.
Lorsque le trocar est en place, passer une portée de 5 millimètres de 30 degrés à travers le port d’entrée et insuffler l’abdomen avec du dioxyde de carbone à 15 millimètres de mercure. Sous visualisation directe avec la caméra laparoscopique, placez 2 ports supplémentaires de 5 millimètres, triangulant sur le lobe latéral gauche du foie. Et placez le laparoscope dans l’un des nouveaux ports.
Identifier le segment latéral gauche du foie au point de la fissure majeure du lobe gauche qui sépare les segments latéraux médiaux et gauches. Et utilisez une agrafeuse chirurgicale pour fixer les structures vasculaires et la veine hépatique le long de cette fissure. Transectez le parenchyme par cette fissure à l’aide de tirs séquentiels et de charges vasculaires de 60, 45 ou 30 millimètres de long.
Lorsque la résection est terminée, évaluer le foie reste pour assurer une hémostase adéquate et utiliser des saisisseurs endoscopiques et un sac de récupération des tissus endoscopiques pour récupérer la section hépatique. Maintenant, retirez les ports et utilisez une suture de taille zéro interrompue pour le fascia midline. Une suture 2-0 en cours d’exécution pour la couche cutanée profonde.
Et une suture 4-0 pour la couche sous-cuticulaire, pour fermer l’incision bâbord de 12 millimètres dans les trois couches. Ensuite, fermez les ports de cinq millimètres en une seule couche avec des sutures de 2-0. Et placez un pansement stérile sur les incisions.
Pour l’isolement des hépatocytes, connectez d’abord une pompe périssaliste réglée pour fournir les solutions de dispersion, maintenues dans un bain d’eau de 43 degrés Celsius, aux cathéters à placer dans les grands vaisseaux exposés de la section hépatique. Prime la pompe et le tube avec la perfusion deux solution, jusqu’à une position de coq d’arrêt pour passer entre la perfusion un et la perfusion deux livraison de solution au tissu. Et passer la bite d’arrêt à la perfusion une position.
Puis amorce le reste de l’ensemble de tubes. Remplir complètement un piège à bulles en ligne pour empêcher l’introduction de bulles d’air dans le tissu. Ensuite, faire une incision transversale propre, perpendiculaire à la circulation hépatique pour révéler les sections transversales des branches de veine portail et les veines hépatiques pour le cathétérisme.
Et utilisez un cathéter ajusté pour cathétériser les veines exposées disponibles. Lorsque les cathéters sont en place, perfuser le tissu hépatique réséqué avec perfusion chaude une solution à un débit de 100 millimètres par minute. Déplacement du tube de sortie de veine en veine toutes les 30 à 60 secondes.
Et en utilisant un tube d’évacuation pour enlever l’excès de tampon du plateau de tissu. Après avoir traversé toutes les veines disponibles pendant 15 à 20 minutes, passez à la perfusion deux solutions dans les mêmes conditions. Utilisation d’une pompe de retour pour recycler la perfusion deux solutions vers le réservoir, à un débit plus lent, pour la ré-administration dans le tissu.
Vérifiez la température de surface du piège à bulles et, ou le foie environ toutes les cinq minutes pour confirmer que les hépatocytes ne refroidit pas. Lorsque le foie blanchit après environ 30 minutes de perfusion, transférer le tissu dans un récipient stérile, enveloppé avec un drap stérile, et placer le récipient dans un capot de culture cellulaire pour maintenir la stérilité pendant le traitement des hépatocytes. L’isolement collagène des hépatocytes et la dissociation cellulaire doit être fait complètement afin que vous n’obtint pas l’agglutination des cellules qui diminue la viabilité des cellules et la fréquence de transduction.
Submergez le foie avec le milieu de lavage d’hépatocyte et faites glisser des ciseaux sur le dessus du tissu pour perturber la capsule hépatique. Portant des gants stériles, masser doucement le foie pour libérer les hépatocytes dans le milieu. Et filtrer le tissu supernatant, à travers la gaze stérile, en bouteilles de centrifugeuse de 200 millilitres.
Recueillir les hépatocytes filtrés par centrifugation. Mise en commun des cellules en 150 millilitres de milieu de lavage d’hépatocyte frais en une seule bouteille de 200 millilitres pour 2 lavages supplémentaires. Et compter les cellules après la troisième centrifugation.
Ensuite, diluer les cellules à 1 fois 10 à la neuvième concentration d’hépatocytes par millilitre salin. Pour l’autotransplantation des hépatocytes isolés, utilisez un transducteur de deux-cinq mégahertz pour identifier la veine du portail par ultrasons et diriger une aiguille de cinq pouces et de calibre 18 vers la veine principale du portail, env. Chargez les cellules dans une seringue de 60 millilitres, selon le volume total de la cellule et fixez la seringue à l’aiguille, en prenant soin de ne pas introduire de bulles.
Ensuite, déprimez lentement le piston de seringue pour infuser manuellement jusqu’à 1 fois 10 aux neuvièmes hépatocytes à travers la veine portail à l’aide d’un cathéter d’infusion pour surveiller la pression porale pendant la transplantation. Lorsque toutes les cellules ont été livrées, retirez le cathéter et surveillez la veine portail pour la présence d’événements thrombotiques et le flux vers l’avant par ultrasons. Dans une cohorte représentative de cinq porcs, qui ont subi la résection hépatique, la plupart ont eu des rendements de plus de 10 aux neuvièmes hépatocytes avec approximativement 80% viabilité.
Fournir un nombre suffisant de cellules pour tout type de manipulation désirée, y compris la thérapie génique. La culture suivante de la partie non transplantée de ces hépatocytes préparés, a démontré une bonne viabilité et adhérence avec une morphologie typique d’hépatocyte 46 heures après leur transduction et placage initial. Un engraftment initial variera selon le nombre de cellules réintroduites pendant la transplantation.
Ces biopsies représentatives démontrent une chronologie de l’expansion cellulaire gène-corrigée. Unique aux maladies, telles que la tyrosinémie héréditaire de type 1, qui bénéficient d’une pression positive sélectionnée pour les cellules saines. Cette expansion est généralement terminée 12 mois après la transplantation.
Une fois qu’un animal transplanté d’hydrolase d’hydrolase de fumarylace a réalisé environ 20% de re-population des hépatocytes corrigés dans le foie, les niveaux de tyrosine normaliseront comparés aux animaux sauvages-type. Tandis que les animaux non corrigés montrent une élévation significative dans le phosphatase alcalin et la transaminase d’aspartate comparées aux animaux sauvages-type, la thérapie génique ex vivo retourne ces niveaux d’enzymes de sérum à la normale. En outre, la santé métabolique générale du foie est perturbée chez les porcs knock-out non traités, comme indiqué par les élévations dans l’ammoniac circulant qui sont corrigées après la re-population avec les hépatocytes traités.
Il est important de se rappeler avec l’utilisation de cette technique pour manipuler et manipuler le tissu avec soin et aussi peu que possible. Une manipulation ou une manipulation accrue des tissus, conduit à diminuer la viabilité des cellules et diminuer le rendement. Cette approche peut également s’appliquer aux personnes intéressées à étudier la distribution des arcs et les inefficacités graphiques dans les techniques d’étiquetage, en utilisant d’autres techniques en dehors des protocoles de transduction virale.
N’oubliez pas que le travail avec des vecteurs viraux peut être dangereux, donc suivre les procédures de biosécurité appropriées, ainsi que le port d’équipement de protection individuelle est nécessaire lors de l’utilisation de ces techniques.
