Le modèle de boue cecal pour la septicémie polymicrobienne est un outil puissant pour disséquer la pathophysiologie néonatale unique. Il peut être variable, et les critères d’évaluation humains ne sont pas bien décrits. Ici, nous présentons notre procédure hautement standardisée pour préparer une boue cecale et injecter dans les animaux expérimentaux.
De plus, nous utilisons une approche axée sur les données pour identifier les chiots moribonds le plus tôt possible. Commençons par préparer un bouillon de boue cecal congelé. Ceci est fait en mettant en commun concent cécal d’au moins cinq souris adultes, la suspension dans l’eau stérile dextrose, et le stockage à moins 80 pour une utilisation ultérieure.
Vous pouvez utiliser des mâles ou des femelles, mais le sexe, l’âge et le fond des souris pour vos expériences doivent être maintenus constants. Tout d’abord, préparons nos outils pour la dissection. Il s’agit notamment d’un ensemble de ciseaux et de forceps pour la peau et un deuxième ensemble pour les organes internes.
Allumez le stérilisateur de perles chaudes au moins 30 minutes avant l’utilisation. Tremper les outils dans 70% d’éthanol, puis les plonger dans le stérilisateur de perles chaudes pendant au moins une minute. Vaporiser un tapis de serviettes en papier avec 70% d’éthanol, puis retirer les outils du stérilisateur sans toucher la partie stérilisée de l’outil aux poignées non stériles d’autres outils.
Placez-les sur le papier absorbant pour les refroidir. Disséquer les souris dans un cabinet de sécurité biologique. Épinglez les pattes de la souris sur une planche en polystyrène à l’aide d’aiguilles de calibre 23 afin que la souris soit en forme d’abdomen.
Vaporiser l’abdomen avec 70% d’éthanol. À l’aide de forceps et de ciseaux stériles, couper la peau, desserrer la peau de la muqueuse péritonéale avec les ciseaux et ouvrir une région rectangulaire de l’aine au sternum et du côté gauche au côté droit. Retirer toute fourrure autour du péritoine.
Passez à une nouvelle paire d’outils stériles pour couper à travers le péritoine, faisant également une ouverture rectangulaire. Identifiez le cecum, qui devrait être en cours d’exécution côté gauche à droite à travers le corps. Perturber le tissu conjonctif pour identifier les branches de cecum des intestins et couper le cecum loin des intestins.
Placez-le sur une feuille de papier pesé stérilisé. À l’aide d’outils stériles, couper à travers les deux extrémités du cecum. Tenez le milieu du ccum avec des forceps et utilisez une spatule en métal plat pour pousser doucement le contenu cécal hors des extrémités à l’aide d’un mouvement de roulement.
Recueillir le contenu et les placer dans un tube de centrifugeuse pré-pesé de 15 millilitres. Mettre en commun le contenu cécal d’un maximum de cinq souris dans le même tube. Weight le tube à nouveau une fois que tout le contenu a été ajouté.
Pour calculer le volume d’eau dextrose à ajouter au contenu cécal dans chaque tube, divisez le poids du contenu cécal dans le tube par votre concentration désirée en milligrammes par millilitre. Gardez un aliquot d’eau dextrose sur la glace pour la re-suspension du contenu cécal. Ajouter la quantité requise d’eau dextrose au tube de centrifugeuse de 15 millilitres contenant du contenu cécal.
Vortex le tube verticalement et horizontalement pendant environ 30 secondes. Observez la présence de particules de plus de quelques millimètres de diamètre et, si elles sont présentes, continuez à vortexer jusqu’à ce que toutes les particules aient été visiblement disparues. Placez un tube de centrifugeuse de 50 millilitres sur la glace pour recueillir le filtrate et installer une passoire stérile de 70 micromètres sur le dessus.
Pipette quatre millilitres de boue re-suspendue à partir d’un tube de 15 millilitres sur la passoire cellulaire et dans le tube de collecte. Suspendre à nouveau le particulaire en faisant monter et descendre deux à trois fois. Extruder délicatement les bulles pour augmenter la vitesse de filtrage tout en remuant le contenu avec la pointe de la pipette jusqu’à ce qu’il n’y ait plus de liquide filtré.
Cela devrait prendre environ 30 secondes. Changez les passoires cellulaires entre chaque tube de boue cecale, mais mettre en commun tout le contenu dans le même tube de collecte de 50 millilitres. Si votre stock dépasse 40 millilitres, puis vortex pendant 15 secondes, et placer 20 millilitres dans un nouveau tube de centrifugeuse.
Divisez le lisier en flacons cryogéniques de 500 microlitres aliquots chacun. Vortex la boue entre tous les trois flacons. Gardez le stock principal dans des flacons sur la glace.
En stockant des aliquots à moins 80, la colonie aérobie formant une concentration unitaire dans une préparation de boue cecale ne change pas sur une période de six mois. Maintenant que le lisier cecal est préparé, nous pouvons l’utiliser pour contester une portée de souris âgées de sept à huit jours avec une dose ajustée en poids de boue cecale. La létalité du lisier dépend de la dose.
Vous devrez déterminer la dose létale désirée dans votre établissement pour chaque nouveau stock avec une nouvelle titration de dose. Un aliquot d’injection de boue cecal est préparé par portée. Nous normalisons l’inoculum à un volume de 100 microlitres, arrondissant aux 10 microlitres les plus proches pour chaque animal dans la litière.
La préparation du défi aliquot nécessite trois calculs, le volume de stock de boue requis, un volume supplémentaire d’eau dextrose, et le volume arrondi pour chaque chiot dans la litière. Les détails sur la façon d’effectuer chaque calcul peuvent être trouvés dans la section trois du protocole. Effectuer ces calculs à la main pour chaque expérience peut prendre beaucoup de temps et contribuera à l’erreur expérimentale, de sorte qu’une feuille de calcul peut être téléchargée avec le protocole où vous entrez votre concentration de stock, dose désirée, et le poids de votre litière, et la quantité de bouillon de boue, le volume d’eau dextrose, et le volume réel par chiot est automatiquement retourné.
Vous pouvez imprimer cette feuille et l’emmener avec vous lorsque vous êtes prêt à défier vos animaux. Préparez l’injection aliquot dans un coffret de sécurité biologique et gardez-la sur la glace. Avant de charger la seringue, mélanger le tube de microcentrifugeuse en feuilletant 20 fois.
Les chiots sont confrontés à une seringue à insuline de calibre 28. Avant d’élaborer le lisier, mélanger l’aliquot en inspirant et en éjectant 300 à 500 microlitres du défi aliquot dans et hors du tube de microcentrifugeuse. Ensuite, dessinez environ 150 microlitres du défi aliquot.
Ceci devrait être plus grand que le volume d’injection pour n’importe quel chiot de sept à huit jours. Feuilletez la seringue pour déloger les bulles du piston et reculez légèrement sur la seringue pour expulser les bulles d’air. Ne touchez pas l’aiguille ou l’arbre du piston pendant ce processus.
Distribuez l’excès de boue cécale dans le tube de microcentrifugeuse jusqu’à ce que la quantité calculée de boue cecale pour la souris soit chargée dans la seringue. Le lisier cecal est administré avec une injection intraperitoneal. Effectuez-le selon le protocole de votre établissement de soins aux animaux.
Pour minimiser les fuites, inclinez le chiot vers le bas et insérez l’aiguille entre la jambe et les organes génitaux, en gardant l’aiguille peu profonde et sous-cutanée. Après avoir inséré l’aiguille d’environ un centimètre, appuyez vers le bas et vers l’avant jusqu’à ce que vous sentiez l’aiguille percer le péritoine, puis lentement déprimer le piston. Retirez soigneusement l’aiguille en suivant la même route que vous êtes entré, relaxant votre majeur que vous le faites.
Notez les fuites dans votre carnet de laboratoire et envisagez d’omettre les animaux avec des fuites importantes de votre résultat final. Dans cette section, nous exposerons les différents niveaux de santé que nous observons chez les souris atteintes de septicémie polymicrobienne et leur point de terminaison humain correspondant. Pour toutes les procédures impliquant des souris néonatales, nous transférons le matériau de literie dans une nouvelle cage.
Cela transfère l’odeur de la dame sur vos gants et réduit le stress sur la dame de l’entrée répétée dans sa cage. Nous faisons un deuxième nid dans la nouvelle cage pour retenir les chiots surveillés jusqu’à la fin de la procédure ou de surveillance lorsque toute la litière est prête à être retourné à la cage de la dame. Placez une souris sur son dos et surveillez la capacité de droit dans les quatre secondes.
Si c’est le cas, attendez huit secondes de plus pour déterminer le niveau de mobilité. Une souris incontestée ou en convalescence est le plus souvent capable de redresser et d’explorer son environnement en prenant plusieurs étapes d’affilée. Regrouper les souris capables de se redresser et de prendre quelques mesures pour explorer son environnement en tant que léthargiques des droits.
Ces souris peuvent tomber tout en faisant un pas et l’air fragile sur leurs pieds. Une souris qui est incapable de droite et a le mouvement de la hanche qui dépasse 90 degrés de l’horizontale, nous groupons comme ne parviennent pas à droite-mobile. Cette souris finira par droite, mais ne peut pas dans les quatre secondes.
En raison de ses mouvements de hanche, il est groupé comme ne parviennent pas à droite-mobile. Les chiots qui ont été incapables de droite et ont un mouvement de la hanche inférieur à 90 degrés de l’horizontale sont regroupés comme ne parviennent pas à droite léthargique. Il s’agit d’un autre exemple d’une souris dont les hanches ne dépassent pas 90 degrés de l’horizontale et est regroupée comme ne parviennent pas à droite léthargique.
Un chiot qui ne parvient pas à la droite-nonmobile aura des jambes qui peuvent trembler ou vibrer, mais n’ont pas de mouvement de la hanche. Les membres peuvent s’étendre et se rétracter, mais n’auront pas de mouvement latéral. Le chiot est visiblement malade et a atteint le point de terminaison humain.
Il s’agit d’un autre exemple d’échec à droite-non mobile chiot. Ses hanches ne tremblent pas de gauche à droite, mais ses pattes vibrent. Lors de la manipulation de la cage de la dame, les chiots peuvent être traînés hors du nid si la dame infirmière fonctionne.
Nous les remplaçons et vérifions ensuite si d’autres chiots épars sont loin de leurs compagnons de nidification. Si ces chiots dispersés ne parviennent pas à droit-léthargique, ils sont à un point de terminaison humain. Voici une courbe de survie Kaplan-Meier de notre modèle de septicémie.
Les points de temps de surveillance peuvent être trouvés dans le SOP ci-joint. À tout moment le long de la courbe de survie, si une souris ne parvient pas à se démobiliser à droite, elle est à son point de terminaison humain et euthanasié. Entre 12 et 21 heures après le défi, les souris apparaîtront malades et environ la moitié des souris seront en mesure de droite d’un côté, tandis que l’autre moitié ne parviennent pas à droite de l’un ou l’autre de leurs côtés.
C’est le délai où les souris vont commencer à digresser dans le score de santé et d’atteindre le point final humain de ne pas à droite-nonmobile. Il s’agit de résultats représentatifs des scores de santé observés au cours de cette période. Les groupes de survivants et de non-survivants ne peuvent pas être différenciés à ce stade en fonction de leurs scores en matière de santé.
À ce stade de la maladie, 21 à 48 heures après le défi, nous observons la plus forte proportion de critères d’évaluation sans être humain. Nous avons également observé que la grande majorité des souris qui sont incapables de redresser les deux côtés ne finiront pas par se remettre d’une maladie, qui devient donc un nouveau critère pour un critère d’évaluation humain en plus de l’échec des critères de droit non mobiles. Les scores de santé observés à ce stade de la maladie ont entraîné une séparation des survivants des non-survivants.
La grande majorité des souris qui n’ont pas pu se redresser des deux côtés ne se sont pas rétablies de la maladie. Ces données soutiennent qu’un nouveau critère pour le point de terminaison humain commençant à 21 heures après le défi devrait être d’euthanasier toutes les souris qui ne parviennent pas à droite des deux côtés. Plus de 48 heures après le défi de nombreuses souris vont commencer à afficher plus d’activité et un meilleur réflexe de droitage.
Même si la proportion de critères d’évaluation humains est plus faible au cours de cette période, les souris peuvent encore s’écarter et devenir plus malades, et elles nécessitent toujours une surveillance du point de terminaison humain. Au cours de cette période, certaines de ces souris qui ont finalement été regroupées comme non-survivantes avaient montré une activité accrue à un moment donné, mais plus tard ont fait pire et ont atteint un point de terminaison humain. Cela nécessite une surveillance continue des animaux malades avec une fréquence accrue s’ils commencent à afficher de pires résultats pour la santé.
Les expérimentateurs indépendants qui n’ont pas reçu de formation en personne et qui n’observent que cette vidéo pédagogique ont été testés dans leur capacité d’attribuer le même score que les enquêteurs à l’aide de vidéos de test enregistrées. Cette vidéo pédagogique se traduit par une classification comportementale précise. La capacité d’attribuer le score correct pour ne pas tomber aux souris néonatales droit-non mobiles, qui est une mesure du point final humain, a été déterminée à partir de 60 souris néonatales, et une moyenne de 97% des comportements ont été distingués avec précision, avec seulement 3% étant mal identifiés.
Ensuite, la capacité de différencier les souris néonatales qui n’ont pas réussi à droit ou qui ont été en mesure de droit dans les quatre secondes a été testé. Il s’agit d’une autre mesure du point de terminaison humain et a été attribué avec précision chez 97% des souris néonatales, tandis que 3% des chiots ont été incorrectement assignés comme le droitage. Voici des résultats représentatifs pour le changement de poids en pourcentage des souris par rapport à leur temps de défi.
Le changement de poids moyen entre les survivants et les non-survivants a commencé à se séparer 24 heures après le défi, mais il y a beaucoup de chevauchement entre les groupes. Certains survivants ont perdu plus de 20 % de leur poids, mais se sont tout de même remis de la maladie. Le changement de poids n’a pas été aussi efficace pour prédire les résultats que par rapport aux différences dans les scores de santé, c’est pourquoi il n’est pas utilisé comme un critère pour déterminer si les souris sont à un critère d’évaluation humain.
Pour conclure, vous devriez maintenant être en mesure de préparer un stock de boue cécale congelée, calculer la dose ajustée en fonction du poids. Et injecter et surveiller les souris nouveau-nées pour les critères d’évaluation humains. Nous espérons que ce sera une ressource précieuse pour votre recherche sur la souris.
