The authors would like to thank Janelle Ryals, Rachel Supple, and Frank Wang for technical assistance. This work was supported by NIH grants R03 DK080182 (JAC), R01 DK099611 (JAC), R01 DK103872 (JAC), Center of Biomedical Research Excellence (COBRE) grant P20 GM104936 (JAC), start-up funds and core support from the Kansas Institutional Development Award (IDeA) P20 GM103418, core support from the Kansas IDDRC P30 HD002528, and The Madison and Lila Self Fellowship Program (ANP).

Toutes les expériences décrites dans ce protocole sont conformes aux directives du NIH en conformité avec les orientations définies par l&#39;Université du Kansas Medical Center Institutional Animal Care et l&#39;utilisation Comité. 1. Séparation néonatale maternelle (NMS) <ol><li> Surveiller barrages enceintes quotidienne pour les naissances de litière. Remarque: Le jour de la litière est né est considéré P0. </li><li> Sur P1, enlever le barrage de la cage de la maison et placer dans un récipient secondaire propre. </li><li> Frottez une poignée de literie entre les mains propres gantée de maintenir parfum de la cage de la maison. </li><li> Ajouter une profondeur de 1 - 2 cm de la maison de la literie cage dans un endroit propre, marquée de manière appropriée 2 L verre bécher. Ajouter environ la moitié de tout matériel supplémentaire d&#39;enrichissement de literie qui est présent dans la cage d&#39;accueil, par exemple, nestlet, papier froissé, dans le bêcher en verre. </li><li> Placez délicatement tous les chiots à partir d&#39;une seule portée, individuellement, dans le même bécher. </li><li> Placer immédiatementle bêcher dans un incubateur maintenu à 33 ° C et 50% d&#39;humidité pendant 180 min. </li><li> Retirer le barrage de l&#39;emballage secondaire et son retour à la cage de la maison. Retourner la cage à domicile à son lieu d&#39;habitation approprié dans le vivarium. </li><li> Répétez cette procédure pour chaque portée subir NMS, en utilisant des gants propres et des récipients secondaires pour chaque portée / barrage. </li><li> À la fin de la période de séparation de 180 min, retourner les litières à leurs cages à domicile dans le même ordre qu&#39;ils ont été enlevés. </li><li> Récupérer la cage d&#39;accueil de la première portée qui a été séparé plus tôt dans la journée. Retirer le barrage de la cage de la maison et placer dans un récipient secondaire propre. </li><li> Retirer le premier bécher de l&#39;incubateur et frotter une poignée de literie entre les mains gantées propres à maintenir le parfum de la cage de la maison lors de la manipulation des chiots. </li><li> Déplacez doucement les chiots, individuellement, du bécher à la cage de la maison. </li><li> Retour tout enrichissement et de la literie en restant dans le bécher pourla cage de la maison. </li><li> Retour du barrage du conteneur secondaire à la cage de la maison et de le retourner à son lieu d&#39;habitation approprié dans le vivarium. </li><li> Rincer le bécher avec de l&#39;eau et de le retourner à l&#39;incubateur. Utiliser le même bêcher pour chaque portée tout au long de la procédure de séparation. </li><li> Répétez cette procédure pour chaque portée subir NMS dans le même ordre qu&#39;ils ont été placés dans l&#39;incubateur. </li><li> Répétez cette procédure pour chaque ensemble subissant litière NMS chaque jour grâce à la P21. </li><li> Sevrer leur progéniture NMS et naïfs sur P22 en plaçant congénères du même sexe ensemble dans des cages propres complets avec de la nourriture et de l&#39;eau. Naïve chiots doivent être nés et logés dans les mêmes conditions que les souris NMS, mais subissent aucun traitement supplémentaire en dehors des tâches normales d&#39;élevage. </li></ol> 2. péri-Sensibilité mécanique <ol><li> von Frey Appareillage <ol><li> Apportez les souris à la salle d&#39;examen et de leur permettre d&#39;acclimater 30min tout en restant dans leur cage d&#39;origine. </li><li> Préparer la zone de test en plaçant une alèse absorbante sous un fil élevée tableau maille filet (79 cm x 28 cm) qui offre suffisamment d&#39;espace pour permettre à l&#39;enquêteur d&#39;approcher de la face inférieure sans effaroucher les souris, environ 55 cm de hauteur. </li><li> Placez jusqu&#39;à 12 souris, individuellement, sous, les chambres de plastique perforés claires (11 cm x 5 cm x 3,5 cm) sur le dessus de la table de treillis métallique. Placez un objet lourd sur le dessus des chambres pour empêcher les souris de se échapper. </li><li> Acclimater la souris pour un 30 minutes supplémentaires sur l&#39;écran avant l&#39;évaluation de seuil de retrait. </li></ol></li><li> Évaluation périgénitale Sensibilité mécanique <ol><li> Effectuer la méthode de haut en bas en utilisant un ensemble standard de gradués monofilaments von Frey 43. Utilisez les monofilaments suivantes: 1,65 g, 2,36 g, 2,83 g, 3,22 g, 3,61 g, 4,08 g, 4,31 g et 4,74 g. <ol><li> Maintenir la base de la g monofilament 3.22 et exposer le mono rétractéefilament. Remarque: Certains modèles peuvent ne pas avoir un monofilament rétractée. </li><li> Situer la sonde de telle sorte que le monofilament est orienté verticalement et lorsque la souris est alerte, immobile, et son poids du corps est réparti également entre les pattes de derrière l&#39;appliquer soit à la gauche ou à droite du scrotum, en évitant la ligne médiane, jusqu&#39;à ce qu&#39;une légère pli est observé dans le filament. </li><li> Tenez le monofilament en place pendant 10 secondes ou jusqu&#39;à ce que l&#39;animal montre une réponse positive. Remarque: Une réponse positive est considérée comme une secousse rapide ou saut en réponse à la demande de monofilament ou léchage ou de comportement de morsure dirigé vers le monofilament. Si les mouvements de la souris lors de l&#39;application de monofilament de 10 sec sans afficher ces comportements, le monofilament doivent être retestés après une 1 min longue période minimale de repos. Si une souris se déplace ni ni présente l&#39;un des comportements énumérés ci-dessus lors de l&#39;application de monofilament de 10 sec, il est considéré comme une réponse négative. </li><html><li> Enregistrer la réponse, positive ou négative, dans un cahier de laboratoire ou un ordinateur portable et répétez cette procédure sur toutes les souris restantes en utilisant la 3,22 g monofilament. </li><li> Testez toutes les souris de nouveau en utilisant la prochaine monofilament appropriée. Remarque: Si la souris a présenté une réponse négative au monofilament 3,22 g, 3,61 g appliquer le monofilament de la même manière et enregistrer la réponse. Si la souris a montré une réponse positive à la monofilament 3,22 g, 2,83 g appliquer le monofilament et enregistrer la réponse. </li></ol></li><li> Continuer l&#39;essai de chaque souris en utilisant la prochaine monofilament plus ou moins, selon le cas, pour une période supplémentaire de 4 applications après la première réponse positive est observée. </li><li> Souris Retour à cages à domicile. </li><li> Utilisez la valeur de la finale monofilament von Frey appliquée dans la série de procès dans des unités de journaux pour calculer un seuil g de retrait de 50% comme décrit dans Chaplan et al. 43. </li></ol></li></ol>title &quot;&gt; 3. acidifiés Bleu de Toluidine Mast Cell coloration <ol><li> Traitement des tissus <ol><li> On dissèque le tissu de la prostate à partir de 44 souris qui ont été perfuses avec intracardiaque glacée paraformaldehyde à 4% 45. Postfix le tissu dans du paraformaldéhyde 4% pendant 1 heure à température ambiante puis cryoprotect dans 30% de saccharose dans 1 x PBS à 4 ° CO / N. </li><li> Préparer un petit (30 ml) de bain d&#39;heptane et le placer sur la glace sèche. </li><li> Rincez le tissu de la prostate chez 1x PBS et sécher en utilisant un devoir essuyer la lumière. </li><li> Insérez le tissu de la prostate dans l&#39;heptane froid jusqu&#39;à ce qu&#39;il soit congelé. </li><li> Immédiatement placer le tissu de la prostate congelé dans un contenant cryomoule milieux de montage et les placer sur carboglace. </li><li> Magasin cryomoules à -20 ° C. </li><li> Transversalement couper le tissu de la prostate en 7 cryosections um d&#39;épaisseur à l&#39;aide d&#39;un cryostat. </li><li> Passer 8-12 cryosections non-série qui couvrent la longueur du tissu, sur des lames de microscope chargés positivement. </li><li> Magasin terminé diapositives à -20 ° C jusqu&#39;à leur traitement ultérieur. </li></ol></li><li> Préparation acidifiés bleu de toluidine <ol><li> Ajouter 1 g de bleu de toluidine O à 100 ml 70% d&#39;éthanol et de vortex jusqu&#39;à en solution pour préparer une solution mère à 1%. La solution stock peut être conservé à température ambiante pendant jusqu&#39;à trois semaines. </li><li> Ajouter 1 g NaCl à 100 ml d&#39;eau dans un bécher placé sur le dessus d&#39;une plaque d&#39;agitation. </li><li> Ajuster le pH de la solution de NaCl en utilisant du HCl 12 M jusqu&#39;à un pH de 0,5 à 1,0 est atteint. </li><li> Préparer la solution de travail de 0,25% bleu de toluidine en combinant 8 ml de la solution de bleu de toluidine et 32 ​​ml de la solution de NaCl à 1%. Introduire à la pipette de haut en bas pour assurer l&#39;incorporation totale de la solution stock bleu de toluidine et mélanger à l&#39;aide d&#39;un vortex. La solution de travail doit être fait frais et jeté après utilisation. </li></ol></li><li> La coloration de la prostate cryosections <ol><li> Retirez les diapositives à être transformés du congélateur et laisser équilibrer à température ambiante pendant environ 30 mdans. </li><li> Laver les coupes de tissu par immersion individuellement les diapositives pendant environ 1 seconde dans un tube conique de 50 ml contenant une quantité suffisante de PBS 1x faire en sorte que les coupes de tissus montées sur les glissières seront complètement immergés. Laisser les lames sécher à l&#39;air sur une serviette en papier. </li><li> Placer les lames dans un bocal de coloration de verre contenant suffisamment de solution de travail bleu de toluidine 0,25% à veiller à ce que les coupes de tissus les diapositives montées seront complètement submergés et incuber pendant 10 - 15 min tandis que sur une plate-forme rocker fixé à 15 tours par minute. </li><li> Tremper les lames dans du PBS 1X pour environ 1 sec pour laver l&#39;excès de bleu de toluidine. </li><li> Placer les lames dans une boîte à tiroir ou un rack de telle sorte que les coulisseaux se trouvent sur les côtés pour permettre le drainage. </li><li> Sécher les lames dans un four à 37 ° C pendant un minimum de 2 heures ou O / N à température ambiante. </li><li> Déshydrater diapositives rapidement en utilisant de l&#39;alcool, permettant aux diapositives sécher complètement entre les expositions à l&#39;alcool. Diapositives sec, par une vidange sur une serviette en papier unnd dos d&#39;essuyage et les bords avec un devoir essuyer la lumière. <ol><li> Plonger les lames dans EtOH à 95% pendant environ 1 sec et laisser sécher complètement. Répétez cette procédure 1 - 10 fois jusqu&#39;à ce que le tissu sèche plus bleu que la pourpre. </li><li> Plonger les lames dans EtOH à 100% pendant environ 1 sec et laisser sécher complètement. Répétez cette procédure 1 - 10 fois jusqu&#39;à ce que le tissu est foncé au bleu moyen, mais pas violet. </li></ol></li><li> Fixer la tache en incubant les lames dans 100% de xylène pendant 3 min. Laisser sécher. </li><li> Lamelle les diapositives avec du glycérol, PBS, ou supports de montage permanent basé xylène. Égoutter les supports en excès et stocker à température ambiante. </li></ol></li><li> Cellules Quantifier Mast <ol><li> Visualisez les coupes de tissus de toluidine bleui à un grossissement de 20x en utilisant la microscopie optique (figure 2). </li><li> Compter le nombre total des mastocytes présents dans la zone et de visualiser la différence entre les mastocytes et non dégranulés dégranulés. 40X magnification peut être nécessaire de confirmer l&#39;état de granulation dans des mastocytes. Remarque: les mastocytes non-dégranulés présentent métachromasie dense avec pas ou contour faible nucléaire et / ou ne extrusion granulaire autour de la cellule. Mastocytes dégranulés présenter métachromasie moins intense et d&#39;avoir un aperçu clair évidente du noyau et / ou de granules libres dans le cytoplasme et à l&#39;extérieur de la frontière de la cellule. </li><li> Continuer d&#39;évaluer le nombre total de mastocytes non dégranulés dégranulés et dans la totalité de la coupe de tissu en cours. Répétez cette procédure sur au moins 7 sections supplémentaires distincts, couvrant la longueur de chaque tissu. </li><li> Calculer le pourcentage de dégranulés (DG) de mastocytes totaux pour chaque tissu / souris selon l&#39;équation suivante: (DG mastocytes / Total mastocytes) x 100. </li></ol></li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Ce protocole fournit une méthodologie pour utiliser le stress néonatal, sous la forme de NMS, pour induire une symptomatologie indicatif de CP / CPPS chez les souris mâles adultes. Comme les adultes, les souris NEM affichent allodynie mécanique périgénitale importante, ainsi que la preuve de la dégranulation des mastocytes dans le tissu de la prostate. L&#39;utilisation de NMS est une nouvelle approche pour développer un modèle préclinique de CP / CPPS en ce qu&#39;elle reproduit le stress de la vie au début ...

La douleur pelvienne chronique est pas en soi une maladie, mais plutôt un terme associé à la douleur continue spontanée et / ou évoquée vécue par les patients diagnostiqués avec le syndrome du côlon irritable (IBS), la cystite interstitielle / syndrome de la vessie douloureuse (IC / PBS), vulvodynie, ou le syndrome de douleur pelvienne prostatite chronique / chronique (CP / CPPS). Ces syndromes sont souvent des comorbidités et partagent beaucoup de caractéristiques en ce qu&#39;ils présentent aucune pathologie associée ou étiologie identifiée, bien que a été montré un dysfonctionnement dans le système immunitaire, le système nerveux central et le système nerveux périphérique de contribuer à l&#39;entretien et à la progression de ces troubles 1 -3. Les patients souffrant de douleurs pelviennes chroniques sont plus susceptibles de présenter des symptômes de plus, non-pelvienne liée à des troubles fonctionnels de la douleur et des troubles de l&#39;humeur, y compris l&#39;anxiété, la dépression et le trouble panique 4-6, qui a été associée avec le fonctionnement altéré de la hypothalamo hypophysosurrénalien (HHS) 7-10. L&#39;exposition au stress de la vie au début ou à un traumatisme est un facteur de risque important pour le développement des anomalies HPA et les syndromes de douleur chronique associée 10,11 et, comme tel, un sous-ensemble significatif de patients atteints de troubles de douleur pelvienne fonctionnels ont indiqué avoir vécu les événements de l&#39;enfance indésirables tels que l&#39;abus ou la négligence 12-14. des modèles de rongeurs de la séparation maternelle néonatale (SMN), qui consiste à enlever les chiots de leur mère pour une période de temps au cours de la période d&#39;avant le sevrage, ont été utilisées pour les deux dernières décennies pour étudier les résultats de début de stress de la vie. En général, NMS a été montré pour augmenter l&#39;activation de l&#39;axe HPA, et les comportements de type anxieux qui en résultent, en affectant directement l&#39;expression des gènes dans l&#39;hypothalamus, ainsi que de perturber la régulation en aval de structures limbiques 15-18. Perturbation du bon fonctionnement de l&#39;axe HHS a été montré pour contribuer à l&#39;augmentation colorectal 19-22 </sup&gt; Vaginale et 16 sensibilité affichée par les modèles de NMS de rongeurs, mais malgré une caractérisation de l&#39;effet à long terme de 23-25 ​​postnatale inflammation de la vessie, de l&#39;impact de début stress de la vie a largement pas été étudié dans les organes génito-urinaires. Par conséquent, l&#39;étude suivante décrira comment effectuer NMS chez les souris et plus tard d&#39;évaluer la sensibilité mécanique périgénitale et l&#39;infiltration des mastocytes / activation dans la prostate pour valider l&#39;utilisation de souris mâles NMS comme un modèle préclinique pour CP / CPPS. De tous les troubles diagnostiqués de douleurs pelviennes chroniques, CP / CPPS est peut-être le syndrome de moins bien reconnu et caractérisé, en dépit d&#39;une prévalence à vie d&#39;environ 14% 26 et les coûts annuels de patients estimés à $ 4400 (deux fois celle de la lombalgie ou la polyarthrite retour l&#39;arthrite 27). Les patients atteints de CP / CPPS rapport douleurs au niveau du périnée, du rectum, de la prostate, pénis, testicules, et / ou à l&#39;abdomen 28, l&#39;expérience d&#39;un salutgher degré de stress psychologique que les patients témoins 29, et couramment présente avec des symptômes de ou sont diagnostiqués avec la douleur ou les troubles de l&#39;humeur pelviennes chroniques concomitantes 5,29-31. Infection récurrente, l&#39;épithélium qui fuit, une inflammation neurogène, et l&#39;auto-immunité ont tous été supposé que les causes sous-jacentes potentielles de CP / CPPS 2,32,33, ainsi que l&#39;activation des mastocytes et la dégranulation 34. Sécrétions prostatiques exprimé à partir d&#39;hommes atteints de CP / CPPS avaient augmenté tryptase des mastocytes et le facteur de croissance des nerfs (NGF) niveaux 34, et une étude plus récente confirme que la tryptase et la carboxypeptidase A (CPA3), un marqueur de l&#39;activation des mastocytes, ont également été augmenté dans le urine de patients CP / CPPS 35. Le rôle potentiel des mastocytes dans l&#39;apparition et le maintien de CP / CPPS a été une préoccupation majeure de la recherche animale sur ce syndrome jusqu&#39;ici. Le modèle de rongeur le plus couramment employé utilisé pour étudier CP / CPPS est une prostatite auto-immune expérimentale (PAE) modèle gensurvoltage par injection sous-cutanée de l&#39;antigène de la prostate dans de l&#39;adjuvant complet de Freund, qui se traduit par des degrés variés de l&#39;inflammation de la prostate selon l&#39;espèce et la souche utilisée 34,36-39. Il a été démontré infiltration de cellules de mât et l&#39;activation / dégranulation à augmenter après l&#39;induction de l&#39;EAP 34,35,40. Les souris transgéniques déficientes en soit mastocytes 34 ou le récepteur PAR2 tryptase 35 ne développent pas la sensibilité de la prostate tactique suivante EAP, contrairement aux souris de type sauvage du PAE. Bien que ce modèle préclinique reproduit bon nombre des caractéristiques de CP humaine / CPPS, le protocole d&#39;induction ne sont pas indicatifs de la condition humaine, qui a une étiologie diverse et souvent ne comporte pas l&#39;inflammation directe, une infection ou une blessure de la prostate. L&#39;influence de début stress de la vie sur le développement de CP / CPPS chez les humains est largement passée objet d&#39;aucune enquête; Toutefois, une étude menée par Hu et al. 41, a démontré que moin qui ont rapporté une histoire de physique de l&#39;enfance, émotionnel, et / ou d&#39;abus sexuels étaient beaucoup plus susceptibles d&#39;éprouver des symptômes évocateurs d&#39;CP / CPPS. En outre, ils ont montré que la douleur et les scores urinaires ont été augmentées chez les patients ayant des antécédents de violence physique et psychologique. Nous avons précédemment démontré que le même paradigme dans NMS femelle C57BL / 6 souris produit une hypersensibilité vaginal et l&#39;expression du gène anormal à la fois dans le vagin et la vessie suggestif de sortie de l&#39;axe HPA 16 dysfonctionnelle. Cette preuve combiné avec la forte prévalence de CP / CPPS patients présentant des comorbidités 42 autres, y compris les IC / PBS et troubles de l&#39;humeur, qui ont été présentées plus clairement être lié à la vie tôt le stress exposition 12-14, fournit la justification de l&#39;utilisation d&#39;un NMS modèle d&#39;enquêter CP / CPPS chez la souris.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Pregnant C57BL/6 female mice&#160;</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>027</td>
			<td>Timed or untimed pregnant females should be monitored daily for in-house birth.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2L glass beaker(s)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS10002L</td>
			<td>Each NMS litter will be held in the same beaker throughout the 21 day separation period.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Forced Air Incubator, Basic</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>414005-124</td>
			<td>The incubator should be held at 33&#176;C and 50% humidity.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Touch Test Sensory Evaluator, Kit of 20 (Semmes-Weinstein Von Frey Aesthesiometer for touch assessment)</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>58011</td>
			<td>The following monofilaments should be used for perigenital sensitivity assessment: 1.65 g, 2.36 g, 2.83 g, 3.22 g, 3.61 g, 4.08 g, 4.31 g, and 4.74 g.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal Enclosure (12 mice 6 rats)</td>
			<td>IITC</td>
			<td>435</td>
			<td>Be sure to place a heavy object on top of the individual, acrylic animal enclosures to prevent mice from escaping.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mesh Stand for mice and rats (12 mice 6 rats)</td>
			<td>IITC</td>
			<td>410</td>
			<td>Place stand on a stable table top for comfortable access.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5493</td>
			<td>Dilute the 10x PBS stock to 1x PBS.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td>A 4% paraformaldehyde solution is needed to intracardially perfuse mice and postfix tissue in preparation for mast cell staining.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5016</td>
			<td>Cryoprotect fixed tissue in 30% sucrose solution at 4&#176;C overnight.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heptane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>246654</td>
			<td>Chill heptane on dry ice to freeze tissue.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Cryomold&#160;</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>4557</td>
			<td>To assist in freezing prostate tissue prior to cryostat sectioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek OCT Compound</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4583</td>
			<td>12 x 125 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Superfrost Plus Micro Slide</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>48311-703</td>
			<td>75 x 25 x 1 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluidine Blue O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>198161</td>
			<td>Certified by the Biological Stain Commission. Suitable for use as a metachromatic stain for mast cells.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, Absolute (200 Proof)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2818-4</td>
			<td>Molecular Biology Grade, Fisher Bioreagents; 95% and 100% solutions will be needed to dehydrate stained cryosections before mast cell visualization.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td>Acidified NaCl solution should be made fresh before staining cryosections.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneMate Sterile 50 mL Centrifuge Tubes&#160;</td>
			<td>BioExpress</td>
			<td>C-3394</td>
			<td>Disposable tubes used to mix toulidine blue elements or dip slides into 1xPBS.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin staining dish for 10 slides, with ground glass cover</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-815</td>
			<td>Hold up to 10 standard 3 x 1 in. (75 x 25mm) slides back-to-back. Use separate dishes for Toluidine Blue working solution, 95% EtOH, 100% EtOH, and xylene.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylenes (Histological)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>X3P</td>
			<td>Once dehydrated, tissue is cleared with xylene.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slide Boxes, 100-Place</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>82003</td>
			<td>Boxes can be used for storage and transportation of slides.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Microscope Slide Box</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-363-400</td>
			<td>These slide boxes are typically small enough to fit inside a cryostate.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
			<td>Glycerol is a traditional mounting medium.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting Medium, Richard-Allan Scientific</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>4111</td>
			<td>Mounting medium firmly bonds the coverslip to the slide.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Cover Glasses, Rectangular, No. 1</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>48393-106</td>
			<td>A coverslip is placed over the dehydrated and cleared tissue to protect the sample.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>The Advanced Automated Research Microscope Eclipse 90i, used by our lab, has been discontinued and replaced Eclipse Ni-E.&#160;&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of perigenital sensitivity and prostatic mast cell activation in a mouse model of neonatal maternal separation

La prostatite chronique / syndrome de la douleur pelvienne chronique (CP / CPPS) a une prévalence à vie de 14% et est le diagnostic urologique la plus courante pour les hommes de moins de 50 ans, mais il est le trouble le moins bien compris et a étudié la douleur pelvienne chronique. Un sous-ensemble significatif de patients avec le rapport de la douleur pelvienne chronique ayant connu le stress de début de la vie ou d&#39;abus, ce qui peut sensiblement affecter le fonctionnement et la régulation du (HPA) axe hypothalamo-hypophyso-surrénalien. L&#39;activation des mastocytes, qui a été montré à être augmentée dans l&#39;urine et exprimé sécrétions prostatiques de patients CP / CPPS, est partiellement régulée par activation en aval de l&#39;axe HPA. La séparation maternelle néonatale (NMS) a été utilisé pendant plus de deux décennies à étudier les résultats de début de stress de la vie dans les modèles de rongeurs, y compris les changements dans l&#39;axe HPA et la sensibilité viscérale. Ici, nous fournissons un protocole détaillé pour l&#39;utilisation de NMS comme un modèle préclinique de CP / CPPS dans C57BL / 6 souris mâles. Nous décrivons la méthodologiepour effectuer NMS, évaluer allodynie mécanique périgénitale, et la preuve histologique de l&#39;activation des mastocytes. Nous fournissons également des preuves que le stress psychologique précoce peut avoir des effets à long terme sur le système génito-urinaire masculin chez la souris.

Les souris qui ont subi NMS a montré des preuves de comportement indicatif de CP / CPPS. Lors d&#39;un essai avec une série graduée de monofilaments von Frey, souris NMS 8 semaines-vieux (n = 4) affiché allodynie mécanique périgénitale par rapport à leurs homologues naïfs (n = 5, figure 2). Ceci est démontré qu&#39;une réduction significative (p &lt;0,01; test t de Student) dans le seuil de retrait mécanique qui a suscité une réaction positive des comportements, enregistrée comm...

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Assessment of Perigenital Sensitivity and Prostatic Mast Cell Activation in a Mouse Model of Neonatal Maternal Separation

Nous mesurons activation périgénitale mécanique de la sensibilité et des mastocytes dans la prostate des hommes C57BL / 6 qui a subi un début de paradigme du stress de la vie - la séparation maternelle néonatale, afin d&#39;induire un modèle préclinique de syndrome chronique de la prostatite chronique / de douleurs pelviennes.

Évaluation de la sensibilité et de la prostate péri-Mast Cell Activation dans un modèle murin de la séparation maternelle néonatale

Chronic prostatitis/chronic pelvic pain syndrome (CP/CPPS) has a lifetime prevalence of 14% and is the most common urological diagnosis for men under the ...

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Medicine

9.2K vues.  University of Kansas Medical Center.  Nous mesurons activation périgénitale mécanique de la sensibilité et des mastocytes dans la prostate des hommes C57BL / 6 qui a subi un début de paradigme du stress de la vie - la séparation maternelle néonatale, afin d'induire un modèle préclinique de syndrome chronique de la prostatite chronique / de douleurs pelviennes. 

Vidéo: Assessment of Perigenital Sensitivity and Prostatic Mast Cell Activation in a Mouse Model of Neonatal Maternal Separation

A Mouse Model of in Utero Transplantation

The transplantation of stem cells and viruses in utero has tremendous potential for treating congenital disorders in the human fetus. For example, in utero transplantation (IUT) of hematopoietic stem cells has been used to successfully treat patients with severe combined immunodeficiency.1,2 In several other conditions, however, IUT has been attempted without success.3 Given these mixed results, the availability of an efficient non-human model to study the biological sequelae of stem cell transplantation and gene therapy is critical to advance this field. We and others have used the mouse model of IUT to study factors affecting successful engraftment of in utero transplanted hematopoietic stem cells in both wild-type mice4-7 and those with genetic diseases.8,9 The fetal environment also offers considerable advantages for the success of in utero gene therapy. For example, the delivery of adenoviral10, adeno-associated viral10, retroviral11, and lentiviral vectors12,13 into the fetus has resulted in the transduction of multiple organs distant from the site of injection with long-term gene expression. in utero gene therapy may therefore be considered as a possible treatment strategy for single gene disorders such as muscular dystrophy or cystic fibrosis. Another potential advantage of IUT is the ability to induce immune tolerance to a specific antigen. As seen in mice with hemophilia, the introduction of Factor IX early in development results in tolerance to this protein.14 
In addition to its use in investigating potential human therapies, the mouse model of IUT can be a powerful tool to study basic questions in developmental and stem cell biology. For example, one can deliver various small molecules to induce or inhibit specific gene expression at defined gestational stages and manipulate developmental pathways. The impact of these alterations can be assessed at various timepoints after the initial transplantation. Furthermore, one can transplant pluripotent or lineage specific progenitor cells into the fetal environment to study stem cell differentiation in a non-irradiated and unperturbed host environment.
The mouse model of IUT has already provided numerous insights within the fields of immunology, and developmental and stem cell biology. In this video-based protocol, we describe a step-by-step approach to performing IUT in mouse fetuses and outline the critical steps and potential pitfalls of this technique.

A Mouse Model of in Utero Transplantation

The mouse model of in utero transplantation is a versatile tool that can be used to study the potential clinical applications of stem cell transplantation and gene therapy in the fetus. In this protocol, we present a general approach to performing this technique

Un modèle murin de In utero Transplantation

The transplantation of stem cells and viruses in utero has tremendous potential for treating congenital disorders in the human fetus.  For example, in ...

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Médecine

Multi-photon Imaging of Tumor Cell Invasion in an Orthotopic Mouse Model of Oral Squamous Cell Carcinoma

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient management strategies. Orthotopic mouse models of oral cancer have been developed to facilitate the study of factors that impact invasion and serve as model system for evaluating anti-tumor therapeutics. In these systems, visualization of disseminated tumor cells within oral cavity tissues has typically been conducted by either conventional histology or with in vivo bioluminescent methods. A primary drawback of these techniques is the inherent inability to accurately visualize and quantify early tumor cell invasion arising from the primary site in three dimensions. Here we describe a protocol that combines an established model for squamous cell carcinoma of the tongue (SCOT) with two-photon imaging to allow multi-vectorial visualization of lingual tumor spread. The OSC-19 head and neck tumor cell line was stably engineered to express the F-actin binding peptide LifeAct fused to the mCherry fluorescent protein (LifeAct-mCherry). Fox1nu/nu mice injected with these cells reliably form tumors that allow the tongue to be visualized by ex-vivo application of two-photon microscopy. This technique allows for the orthotopic visualization of the tumor mass and locally invading cells in excised tongues without disruption of the regional tumor microenvironment. In addition, this system allows for the quantification of tumor cell invasion by calculating distances that invaded cells move from the primary tumor site. Overall this procedure provides an enhanced model system for analyzing factors that contribute to SCOT invasion and therapeutic treatments tailored to prevent local invasion and distant metastatic spread. This method also has the potential to be ultimately combined with other imaging modalities in an in vivo setting.

A comprehensive overview of the techniques involved in generating a mouse model of oral cancer and quantitative monitoring of tumor invasion within the tongue through multi-photon microscopy of labeled cells is presented. This system can serve as a useful platform for the molecular assessment and drug efficacy of anti-invasive compounds.

Multi-photon imagerie de l&#39;invasion des cellules tumorales dans un modèle de souris orthotopique du carcinome épidermoïde oral

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient ...

A Swine Model of Neonatal Asphyxia

Annually more than 1 million neonates die worldwide as related to asphyxia. Asphyxiated neonates commonly have multi-organ failure including hypotension, perfusion deficit, hypoxic-ischemic encephalopathy, pulmonary hypertension, vasculopathic enterocolitis, renal failure and thrombo-embolic complications. Animal models are developed to help us understand the patho-physiology and pharmacology of neonatal asphyxia. In comparison to rodents and newborn lambs, the newborn piglet has been proven to be a valuable model. The newborn piglet has several advantages including similar development as that of 36-38 weeks human fetus with comparable body systems, large body size (&tilde;1.5-2 kg at birth) that allows the instrumentation and monitoring of the animal and controls the confounding variables of hypoxia and hemodynamic derangements.
We here describe an experimental protocol to simulate neonatal asphyxia and allow us to examine the systemic and regional hemodynamic changes during the asphyxiating and reoxygenation process as well as the respective effects of interventions. Further, the model has the advantage of studying multi-organ failure or dysfunction simultaneously and the interaction with various body systems. The experimental model is a non-survival procedure that involves the surgical instrumentation of newborn piglets (1-3 day-old and 1.5-2.5 kg weight, mixed breed) to allow the establishment of mechanical ventilation, vascular (arterial and central venous) access and the placement of catheters and flow probes (Transonic Inc.) for the continuously monitoring of intra-vascular pressure and blood flow across different arteries including main pulmonary, common carotid, superior mesenteric and left renal arteries. Using these surgically instrumented piglets, after stabilization for 30-60 minutes as defined by Z&lt;10% variation in hemodynamic parameters and normal blood gases, we commence an experimental protocol of severe hypoxemia which is induced via normocapnic alveolar hypoxia. The piglet is ventilated with 10-15% oxygen by increasing the inhaled concentration of nitrogen gas for 2h, aiming for arterial oxygen saturations of 30-40%. This degree of hypoxemia will produce clinical asphyxia with severe metabolic acidosis, systemic hypotension and cardiogenic shock with hypoperfusion to vital organs. The hypoxia is followed by reoxygenation with 100% oxygen for 0.5h and then 21% oxygen for 3.5h. Pharmacologic interventions can be introduced in due course and their effects investigated in a blinded, block-randomized fashion.

Large animal models have good translational values in the examination of physiology and pharmacology of neonatal asphyxia. Using newborn piglets, we develop an experimental protocol to simulate neonatal asphyxia which has advantages of studying the systemic and regional hemodynamics, oxygen transport with biochemical and pathologic pathways and correlations.

Un modèle porcin de l&#39;asphyxie néonatale

Annually more than 1 million neonates die worldwide as related to asphyxia. Asphyxiated neonates commonly have multi-organ failure including hypotension, ...

A Piglet Model of Neonatal Hypoxic-Ischemic Encephalopathy

Birth asphyxia, which causes hypoxic-ischemic encephalopathy (HIE), accounts for 0.66 million deaths worldwide each year, about a quarter of the world&#8217;s 2.9 million neonatal deaths. Animal models of HIE have contributed to the understanding of the pathophysiology in HIE, and have highlighted the dynamic process that occur in brain injury due to perinatal asphyxia. Thus, animal studies have suggested a time-window for post-insult treatment strategies. Hypothermia has been tested as a treatment for HIE in pdiglet models and subsequently proven effective in clinical trials. Variations of the model have been applied in the study of adjunctive neuroprotective methods and piglet studies of xenon and melatonin have led to clinical phase I and II trials1,2. The piglet HIE model is further used for neonatal resuscitation- and hemodynamic studies as well as in investigations of cerebral hypoxia on a cellular level. However, it is a technically challenging model and variations in the protocol may result in either too mild or too severe brain injury. In this article, we demonstrate the technical procedures necessary for establishing a stable piglet model of neonatal HIE. First, the newborn piglet (&#60; 24 hr old, median weight 1500 g) is anesthetized, intubated, and monitored in a setup comparable to that found in a neonatal intensive care unit. Global hypoxia-ischemia is induced by lowering the inspiratory oxygen fraction to achieve global hypoxia, ischemia through hypotension and a flat trace amplitude integrated EEG (aEEG) indicative of cerebral hypoxia. Survival is promoted by adjusting oxygenation according to the aEEG response and blood pressure. Brain injury is quantified by histopathology and magnetic resonance imaging after 72 hr.

Hypoxic-ischemic encephalopathy following perinatal asphyxia can be studied using animal models. We demonstrate the procedures necessary for establishing a piglet model of neonatal hypoxic-ischemic encephalopathy.

Un modèle de Porcinet néonatale encéphalopathie hypoxique-ischémique

Birth asphyxia, which causes hypoxic-ischemic encephalopathy (HIE), accounts for 0.66 million deaths worldwide each year, about a quarter of the ...

A Neonatal Mouse Spinal Cord Compression Injury Model

Spinal cord injury (SCI) typically causes devastating neurological deficits, particularly through damage to fibers descending from the brain to the spinal cord. A major current area of research is focused on the mechanisms of adaptive plasticity that underlie spontaneous or induced functional recovery following SCI. Spontaneous functional recovery is reported to be greater early in life, raising interesting questions about how adaptive plasticity changes as the spinal cord develops. To facilitate investigation of this dynamic, we have developed a SCI model in the neonatal mouse. The model has relevance for pediatric SCI, which is too little studied. Because neural plasticity in the adult involves some of the same mechanisms as neural plasticity in early life1, this model may potentially have some relevance also for adult SCI. Here we describe the entire procedure for generating a reproducible spinal cord compression (SCC) injury in the neonatal mouse as early as postnatal (P) day 1. SCC is achieved by performing a laminectomy at a given spinal level (here described at thoracic levels 9-11) and then using a modified Yasargil aneurysm mini-clip to rapidly compress and decompress the spinal cord. As previously described, the injured neonatal mice can be tested for behavioral deficits or sacrificed for ex vivo physiological analysis of synaptic connectivity using electrophysiological and high-throughput optical recording techniques1. Earlier and ongoing studies using behavioral and physiological assessment have demonstrated a dramatic, acute impairment of hindlimb motility followed by a complete functional recovery within 2 weeks, and the first evidence of changes in functional circuitry at the level of identified descending synaptic connections1.

This article describes a method for generating a reproducible spinal cord compression injury (SCI) in the neonatal mouse. The model provides an advantageous platform for studying mechanisms of adaptive plasticity that underlie spontaneous functional recovery.

Un nouveau-né de la moelle épinière de souris Compression Modèle de lésion

Spinal cord injury (SCI) typically causes devastating neurological deficits, particularly through damage to fibers descending from the brain to the spinal ...

A Battery of Motor Tests in a Neonatal Mouse Model of Cerebral Palsy

As the sheer number of transgenic mice strains grow and rodent models of pediatric disease increase, there is an expanding need for a comprehensive, standardized battery of neonatal mouse motor tests. These tests can validate injury or disease models, determine treatment efficacy and/or assess motor behaviors in new transgenic strains. This paper presents a series of neonatal motor tests to evaluate general motor function, including ambulation, hindlimb foot angle, surface righting, negative geotaxis, front- and hindlimb suspension, grasping reflex, four limb grip strength and cliff aversion. Mice between the ages of post-natal day 2 to 14 can be used. In addition, these tests can be used for a wide range of neurological and neuromuscular pathologies, including cerebral palsy, hypoxic-ischemic encephalopathy, traumatic brain injury, spinal cord injury, neurodegenerative diseases, and neuromuscular disorders. These tests can also be used to determine the effects of pharmacological agents, as well as other types of therapeutic interventions. In this paper, motor deficits were evaluated in a novel neonatal mouse model of cerebral palsy that combines hypoxia, ischemia and inflammation. Forty-eight hours after injury, five tests out of the nine showed significant motor deficits: ambulation, hindlimb angle, hindlimb suspension, four limb grip strength, and grasping reflex. These tests revealed weakness in the hindlimbs, as well as fine motor skills such as grasping, which are similar to the motor deficits seen in human cerebral palsy patients.

Presented is a concise battery of mouse neonatal motor tests. Using these tests, neonatal motor deficits can be demonstrated in a variety of neonatal motor disorders. By having a standardized set of tests, results from different studies can be compared, allowing for better and accurate reporting between groups.

Une batterie de tests de moteur dans un modèle de souris néonatale de paralysie cérébrale

As the sheer number of transgenic mice strains grow and rodent models of pediatric disease increase, there is an expanding need for a comprehensive, ...

Myocardial Infarction in Neonatal Mice, A Model of Cardiac Regeneration

Myocardial infarction induced by coronary artery ligation has been used in many animal models as a tool to study the mechanisms of cardiac repair and regeneration, and to define new targets for therapeutics. For decades, models of complete heart regeneration existed in amphibians and fish, but a mammalian counterpart was not available. The recent discovery of a postnatal window during which mice possess regenerative capabilities has led to the establishment of a mammalian model of cardiac regeneration. A surgical model of mammalian cardiac regeneration in the neonatal mouse is presented herein. Briefly, postnatal day 1 (P1) mice are anesthetized by isoflurane and placed on an ice pad to induce hypothermia. After the chest is opened, and the left anterior descending coronary artery (LAD) is visualized, a suture is placed around the LAD to inflict myocardial ischemia in the left ventricle. The surgical procedure takes 10-15 min. Visualizing the coronary artery is crucial for accurate suture placement and reproducibility. Myocardial infarction and cardiac dysfunction are confirmed by triphenyl-tetrazolium chloride (TTC) staining and echocardiography, respectively. Complete regeneration 21 days post myocardial infarction is verified by histology. This protocol can be used to as a tool to elucidate mechanisms of mammalian cardiac regeneration after myocardial infarction.

This protocol describes a highly reproducible model of cardiac regeneration by surgical induction of myocardial infarction in the left ventricle of postnatal day 1 mice. The method involves induction of hypothermic anesthesia and ligation of the left anterior descending coronary artery.

Infarctus du myocarde chez les souris néonatales, Un modèle de régénération cardiaque

Myocardial infarction induced by coronary artery ligation has been used in many animal models as a tool to study the mechanisms of cardiac repair and ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and drugs. It is widely used in many studies on the physiological functions of vascular smooth muscle, the pathogenesis of vascular diseases such as hypertension, and the development of smooth muscle relaxant drugs. The mouse is a widely used model animal with a large pool of disease models and genetically modified strains. We introduced this method to measure the isometric contraction of mouse mesenteric artery in detail. A 1.4-mm segment of mouse mesenteric resistance artery was isolated and mounted on a myograph chamber by passing two steel wires through its lumen. After equilibration and normalization steps, the vessel segment was potentiated by a high-K+ solution twice prior to the contraction assay. As an example of the application of this method in drug development, we measured the relaxant effect of a novel natural substance, neoliensinine, isolated from a Chinese herb, embryos of the lotus seed (Nelumbo nucifera Gaertn.) on mouse mesenteric arteries. The vessel segments mounted on the myograph chamber were stimulated with a high-K+ solution. When the force tension reached a stable sustained phase, cumulative doses of neoliensinine were added to the chamber. We found that neoliensinine had a dose-dependent relaxant effect on smooth muscle contraction, thus suggesting that it bears potential activity against hypertension. In addition, as the vessel segment can survive at least 4 hours after mounting and maintain contractility induced by the high-K+ solution for many times, we suggest that the wire myograph system may be used for the time-consuming process of drug screening.

The wire myograph technique is used to investigate vascular smooth muscle functions and screen new drugs. We report a detailed protocol for measuring the isometric contractility of the mouse mesenteric artery and for screening new relaxants of vascular smooth muscle.

Mesure de la contractilité isométrique de l’artère mésentérique de souris à l’aide de fil myographie

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...

A Cryoinjury Model to Study Myocardial Infarction in the Mouse

The use of animal models is essential for developing new therapeutic strategies for acute coronary syndrome and its complications. In this article, we demonstrate a murine cryoinjury infarct model that generates precise infarct sizes with high reproducibility and replicability. In brief, after intubation and sternotomy of the animal, the heart is lifted from the thorax. The probe of a handheld liquid nitrogen delivery system is applied onto the myocardial wall to induce cryoinjury. Impaired ventricular function and electrical conduction can be monitored with echocardiography or optical mapping. Transmural myocardial remodeling of the infarcted area is characterized by collagen deposition and loss of cardiomyocytes. Compared to other models (e.g., LAD-ligation), this model utilizes a handheld liquid nitrogen delivery system to generate more uniform infarct sizes.

This article demonstrates a model to study cardiac remodeling after myocardial cryoinjury in mice.

Un modèle cryo-blessure pour étudier l'infarctus du myocarde chez la souris

The use of animal models is essential for developing new therapeutic strategies for acute coronary syndrome and its complications. In this article, we ...

A Neonatal BALB/c Mouse Model of Necrotizing Enterocolitis

Necrotizing enterocolitis (NEC) is the most severe gastrointestinal (GI) disease that often occurs in premature infants, especially very low birth weight infants, with high mortality and unclear pathogenesis. The cause of NEC may be related to inflammatory immune regulatory system abnormalities. An NEC animal model is an indispensable tool for NEC disease immune research. NEC animal models usually use C57BL/6J neonatal mice; BALB/c neonatal mice are rarely used. Related studies have shown that when mice are infected, Th2 cell differentiation is predominant in BALB/c mice compared to C57BL/6J mice. Studies have suggested that the occurrence and development of NEC are associated with an increase in T helper type 2 (Th2) cells and are generally accompanied by infection. Therefore, this study used neonatal BALB/c mice to induce an NEC model with similar clinical characteristics and intestinal pathological changes as those observed in children with NEC. Further study is warranted to determine whether this animal model could be used to study Th2 cell responses in NEC.

Necrotizing enterocolitis (NEC) is the most severe gastrointestinal (GI) disease that often occurs in premature infants, especially very low birth weight infants, with high mortality and unclear pathogenesis. The cause of NEC may be related to inflammatory immune regulatory system abnormalities. An NEC animal model is an indispensable tool for NEC disease immune research. NEC animal models usually use C57BL/6J neonatal mice; BALB/c neonatal mice are rarely used. Related studies have shown that when mice are infected, Th2 cell differentiation is predominant in BALB/c mice compared to C57BL/6J mice. Studies have suggested that the occurrence and development of NEC are associated with an increase in T helper type 2 (Th2) cells and are generally accompanied by infection. Therefore, this study used neonatal BALB/c mice to induce an NEC model with similar clinical characteristics and intestinal pathological changes as those observed in children with NEC. Further study is warranted to determine whether this animal model could be used to study Th2 cell responses in NEC.

Un modèle murin BALB/c néonatal d’entérocolite nécrosante

Necrotizing enterocolitis (NEC) is the most severe gastrointestinal (GI) disease that often occurs in premature infants, especially very low birth weight ...