Notre protocole permet la diffusion bactérienne et le suivi du fardeau dans un modèle expérimental de septicémie néonatale en temps réel, et la capacité de corréler d’autres marqueurs de la maladie avec la charge pathogène. Ce protocole nous permet d’analyser longitudiinally la septicémie chez les souris néonatales individuelles, offrant la possibilité d’observer et de comparer la dynamique de l’infection et la diffusion bactérienne en temps réel. Des essais précliniques des interventions pour le sepsis néonatal peuvent être exécutés avec cette méthode, permettant la surveillance des effets du contrôle d’hôte des bactéries.
Commencez par placer des chiots appariés par âge dans des groupes de litière à dose élevée ou faible dans un cabinet de niveau de biosécurité deux. Le troisième ou quatrième jour postnatal, enregistrez le poids de tous les chiots avant l’inoculation. Chargez les seringues à insuline avec du PBS ou de l’inoculum e.coli lux à haute ou basse dose dans l’armoire de biosécurité et placez les seringues chargées sur la glace.
Placez le nouveau-né à injecter sur une surface propre dans l’armoire de biosécurité et soulevez la peau à la nuque comme pour débrailler le chiot. Insérez l’aiguille biseauté juste sous la peau dans l’espace créé entre la peau et le muscle. Lorsque l’aiguille peut être ressentie sous la peau, injecter 50 microlitres de l’inoculant tout en libérant simultanément la partie pincée de la peau pour prévenir le flux arrière, puis retirer l’aiguille lentement et avec soin.
Lorsque tous les chiots ont été injectés de la même manière, retournez les chiots à leurs barrages. Immédiatement après l’injection et aux points de temps expérimentaux appropriés par la suite, placez la cage avec des souris néonatales infectées par E.coli lux et endiguez dans un niveau de biosécurité deux hotte d’écoulement laminaire et ouvrez le logiciel dans l’ordinateur micro CT. Après avoir paraphé le système et attendu que la température de l’étape se verrouille à 37 degrés Celsius et que la température du CCD se verrouille à 90 degrés Celsius négatifs, placez jusqu’à quatre chiots anesthésiés sur la boîte d’imagerie de la chambre d’imagerie en position couchée.
Fermez la porte de la chambre d’imagerie et sélectionnez l’option d’imagerie par luminescence. Sélectionnez filtre ouvert et suivant et réglez le filtre d’excitation pour bloquer et le filtre d’émission à ouvrir. Sélectionnez 500, 520, 560, 580, 600 et 620 nanomètres.
Puis l’image des chiots avant de les retourner à la cage avec le barrage avec surveillance jusqu’à la récupération de l’anesthésie. Au point de terminaison expérimental approprié, dans une armoire de biosécurité, utilisez le nouveau-né euthanasié avec 70% d’éthanol pour prévenir la contamination et placer l’animal sur son côté droit. Utilisez des forceps pour saisir la peau entre l’abdomen et la jambe gauche arrière et utilisez des ciseaux chirurgicaux à pointe fine pour faire une incision cutanée.
Ensuite, continuez l’incision vers l’arrière de l’animal jusqu’à ce que toute la rate soit exposée. Utilisez les forceps et les ciseaux pour enlever la rate de l’abdomen et la placer dans la solution appropriée à son application en aval. Pour obtenir les poumons, peler complètement la peau de la poitrine et entrer à la base du sternum avec les ciseaux maintenus verticalement, couper vers le haut jusqu’à ce que la cage thoracique soit fendue.
Utilisez des forceps pour saisir les poumons droit et gauche individuellement et enlever les poumons de la cavité thoracique. Retirer le cœur du tissu pulmonaire à l’aide de ciseaux. Placez ensuite le poumon dans la solution appropriée à son application en aval.
Pour effectuer un test de mise à mort bactérienne in vitro, placez la rate non infectée dans une passoire en nylon de 40 micromètres dans une boîte de Petri stérile de 60 millimètres contenant cinq millilitres de PBS complétée par un sérum bovin fœtal de 10 % et utilisez un piston stérile de seringue de trois millilitres pour disaggrer le tissu en une seule suspension cellulaire. Transférer les cellules dans un tube de centrifugeuse de 15 millilitres et les recueillir par centrifugation. Resuspendez la pastille en un millilitre de tampon de lyse de globule rouge par trois à quatre rates.
Après cinq minutes à température ambiante, laver la rate dans PBS et résuspendre la pastille dans 250 microlitres de PBS complétés par de l’albumine de sérum bovin et deux millimolaires EDTA pour le comptage. Ensuite, isolez les cellules positives Ly6 B2 avec les perles immunomagnétiques appropriées selon le protocole du fabricant et ensemencez les cellules positives Ly6 B2 enrichies à une fois 10 à cinq cellules pour 100 microlitres de moyenne complète par densité de puits dans une plaque noire ou blanche de 96 puits. Préparer l’inoculum bactérien à la multiplicité désirée de l’infection dans un volume final de 100 microlitres par puits et ajouter 100 microlitres d’inoculum bactérien ou moyen seul à chaque puits pour une incubation d’une heure dans l’incubateur de culture cellulaire.
À la fin de l’incubation, remplacer le milieu par 200 microlitres de milieu complet frais complétés par 100 microgrammes par millilitre de gentamycine pour éliminer les bactéries extracellulaires restantes et retourner les cellules à l’incubateur de culture cellulaire pendant deux heures supplémentaires. À la fin de l’incubation et à chaque moment expérimental par la suite, utilisez un lecteur de plaques pour mesurer la luminescence dans chaque puits de la plaque de culture locative avant de retourner la plaque à l’incubateur de culture cellulaire jusqu’à la prochaine lecture. Alors que la plupart des animaux présentent des niveaux élevés de bactéries dans le sang à 24 heures après l’infection, certains chiots ont des bactéries faibles ou indétectables dans le sang, ce qui suggère le dégagement de l’infection à ce moment-là.
En outre, les cellules spléniques positives néonatales Ly6 B2 infectées par E.coli bioluminescent pendant une heure avant l’élimination des bactéries extracellulaires et le traitement subséquent de la géntamycine ont exprimé un niveau élevé de luminescence à trois heures qui diminue au fil du temps, ce qui indique une autorisation bactérienne. L’imagerie animale vivante des bactéries luminescentes confirme en outre l’augmentation de la dissémination et de la croissance des bactéries chez les chiots néonatals au fil du temps à 10 et 24 heures après l’infection. L’imagerie intravitale en conjonction avec le micro CT facilite l’identification des foyers d’infection dans le cerveau, les poumons et d’autres tissus périphériques.
Les poumons de certaines souris fortement infectées démontrent des régions opaques compatibles avec la consolidation inflammatoire qui a co-localisé aux signaux bactériens luminescents. Ces régions d’exsudate inflammatoire présumé ne sont pas observées dans les poumons témoins non infectés. Une augmentation significative de l’expression inflammatoire de cytokine par rapport aux contrôles est également observée dans les groupes bas et élevés d’inoculum, corrélant avec un épaississement notable de la paroi alvéolaire, l’hémorragie alvéolaire accrue, et l’infiltration inflammatoire dans ces animaux.
Les choses les plus importantes à retenir sont d’exécuter la technique appropriée lors de l’exécution des injections et de prêter une attention stricte aux nouveau-nés lors de l’administration de l’anesthésie. En utilisant cette technique, nous pouvons visualiser la septicémie néonatale en temps réel pour étudier les interventions et les thérapies dirigées par l’hôte visant à améliorer la réponse immunitaire.
