En raison de sa grande efficacité, cette méthode peut encore faire progresser les cellules souches pluripotentes induites, ou CISP comme un outil pour étudier les maladies humaines et développer de nouvelles thérapies de cellules souches. Le principal avantage de ce protocole est la capacité de générer des IPSCs libres d’intégration de haute qualité à partir de fibroblastes humains primaires, y compris les fibroblastes humains primaires, y compris les fibroblastes difficiles à reprogrammer, les maladies associées, âgées et sénescentes. Le succès de cette méthode dépend de l’efficacité optimale de transfection d’ARN des fibroblastes.
Et l’ajustement du pH d’un tampon de transfection est une procédure clé pour y parvenir. Pour commencer, préparez un tampon de transfection à l’aide de 500 millilitres et de 100 millilitres de bouteilles préchauffées à température ambiante de sérum frais réduit moyen. Mesurez le pH de base du milieu dans une bouteille de 500 millilitres en insérant l’électrode de verre du compteur de pH dans le tampon, et attendez jusqu’à une minute avant de lire le pH.
Pour ajuster le pH, ajouter de trois à quatre millilitres d’un hydroxyde de sodium molaire dans une bouteille de 500 millilitres. Fermer la bouteille et bien mélanger. Après avoir attendu cinq minutes, ouvrez la bouteille et insérez l’électrode du compteur de pH dans le tampon.
Attendez que la lecture du compteur de pH se stabilise. Continuer à ajouter de petits volumes d’hydroxyde de sodium molaire jusqu’à ce que le pH atteigne 8,15 à 8,17, en s’assurant de calibrer le compteur de pH plusieurs fois au cours du processus. Utilisez un système de filtration sous vide de 0,22 micromètre pour filtrer la stérilisation du tampon de transfection.
Aliquot le tampon stérilisé en tubes de cinq millilitres avec un espace minimal d’air. Vérifiez que les fibroblastes à reprogrammer sont à 40% à 60% confluency. Transférer quatre millilitres de DPBS dans un tube conique de 15 millilitres et ajouter 100 microlitres de laminine humaine recombinante 521.
Bien mélanger en pipetage de haut en bas. Ajouter un millilitre par puits de laminine humaine recombinante diluée 521 dans trois puits d’une plaque de six puits. Incuber cette plaque enduite à 37 degrés Celsius pendant deux heures.
Au cours de cette incubation, chauffer six millilitres de milieu d’expansion du fibroblaste et quatre millilitres de placage moyen à 37 degrés Celsius. Compléter le milieu de placage avec fgf de base à une concentration finale de 100 nanogrammes par millilitre et B18R à une concentration finale de 200 nanogrammes par millilitre. Aspirez soigneusement le milieu usé des fibroblastes qui sont à 40% à 60% confluency.
Rincer les cellules avec cinq millilitres de DPBS. Ajouter trois millilitres de trypsine EDTA et bercer doucement la plaque pour couvrir les cellules avec de la trypsine EDTA. Aspirer l’excès de liquide, laissant environ 500 microlitres de trypsine, et incuber les fibroblastes pendant trois minutes à 37 degrés Celsius.
Après avoir retiré la plaque de l’incubateur, appuyez fermement mais soigneusement sur le côté de la plaque pour déloger les cellules. Consultez les cellules au microscope pour vérifier si elles ont été détachées. Ajouter cinq millilitres de milieu d’expansion du fibroblaste aux cellules détachées pour neutraliser la trypsine EDTA.
Recueillir les cellules dans un tube conique de 15 millilitres et bien les mélanger. Comptez les cellules à l’aide d’un hémcytomètre, puis pipette 12 000 cellules en quatre millilitres de milieu de placage préchauffé préalablement préparé. Après avoir retiré la plaque enduite de l’incubateur, aspirer la laminine diluée 521 des puits, en s’assurant que la surface des puits ne sèche pas.
Resuspendez doucement les cellules qui sont dans le milieu de placage et ajoutez un millilitre de suspension cellulaire dans chaque puits enduit. Placez les cellules plaquées dans un incubateur de culture de tissu tri-gaz avec peu d’oxygène ou d’oxygène réglé à 5%Et puis dispersez doucement mais complètement les cellules en alternant entre un mouvement vers le haut, puis à gauche à droite, et répétez les mouvements deux fois de plus, en s’assurant de ne pas tourbillonner la plaque. Incuber les cellules pendant la nuit.
Pendant ce temps, ajouter quatre millilitres de milieu de reprogrammation à un tube conique de 15 millilitres, et le placer dans l’incubateur O deux bas avec un bouchon desserré pour équilibrer pendant la nuit. Au moins une heure avant la transfection, retirez le milieu de reprogrammation équilibré d’un incubateur o deux bas. Ajouter le bFGF à une concentration finale de 100 nanogrammes par millilitre, et le B18R à une concentration finale de 200 nanogrammes par millilitre, et bien mélanger.
En travaillant un puits à la fois, utilisez une pipette d’un millilitre pour enlever le milieu usé. Et remplacez-le par un millilitre de support de reprogrammation, complété par bFGF et B18R. Déplacez la plaque avec des cellules dans l’incubateur à faible teneur en oxygène.
Pour commencer la transfection fibroblaste, équilibrer d’abord un aliquot du tampon de transfection pendant environ une heure à température ambiante. Retirez un seul aliquot de 33 microlitres d’A MRNA modifiés et 14 microlitres aliquot de MIRNA imite de 80 degrés Celsius négatifs, et réchauffez-les à température ambiante pendant environ trois à cinq minutes jusqu’à ce qu’ils soient décongelés. Faites-les tourner brièvement dans une microfuge.
Chauffer le réaccfection transfection à température ambiante pendant environ trois à cinq minutes. Inverser le tube deux à trois fois pour mélanger le réaugmenté et le faire tourner brièvement dans une microfuge. Transférer 279 microlitres du tampon de transfection à température ambiante dans un tube de microcentrifugeuse sans ARN et ajouter 31 microlitres du réaccente de transfection.
Bien mélanger au pipetage et incuber à température ambiante pendant une minute. Ajouter 132 microlitres du tampon de transfection à température ambiante aux 33 microlitres aliquot de MRNA modifié, et mélanger délicatement la pipette. Ajouter 102,6 microlitres du tampon de transfection à température ambiante à l’aliquot de 14 microlitres de MIRNA imite et doucement pipette à mélanger.
Pour préparer le mélange de transfection de MRNA modifié, ajoutez 165 microlitres du tampon de transfection de 310 microlitres, mélange de réagent de transfection à 165 microlitres du tampon de transfection, mélange MRNA modifié. Pipette à mélanger. Pour préparer le mélange de transfection des imitations MIRNA, ajouter 116,6 microlitres du tampon transfection de 310 microlitres, mélange de réaccfection transfection au tampon transfection de 116,6 microlitres, MIRNA imiter le mélange.
Bien mélanger et incuber pendant 15 minutes à température ambiante pour permettre au tampon de transfection de se complexifier avec les IRM modifiées et les imitations MIRNA. Retirer la plaque avec les cellules de l’incubateur à faible teneur en oxygène. Laissez tomber sagement dans chaque puits, ajoutez 100 microlitres par puits du mélange de transfection contenant les MRNAs complexes et modifiés.
Agitez doucement mais soigneusement la plaque avec un mouvement vers le haut, puis à gauche à droite pour disperser les complexes de transfection. Ajouter 66,7 microlitres par puits du mélange de transfection contenant le complexe MIRNA imite goutte sage à travers chaque puits. Agitez doucement mais soigneusement la plaque avec un mouvement vers le haut, puis à gauche à droite pour disperser les complexes de transfection.
Placez la plaque avec les cellules transfectées dans l’incubateur à trois gaz avec peu d’oxygène. Dispersez les complexes de transfection en agitant doucement mais soigneusement la plaque avec un mouvement vers le haut, puis à gauche à droite. Incuber les cellules transfectées dans l’incubateur pendant 16 à 20 heures avant de changer de milieu le lendemain.
Ajouter quatre millilitres de milieu de reprogrammation à un tube conique de 15 millilitres, et le placer dans l’incubateur O deux bas avec un bouchon desserré pour équilibrer pendant la nuit. Le lendemain matin, remplacez la transfection contenant du milieu par le milieu prééquilibré frais complété par bFGF et B18R et continuez avec le régime de transfection tel que décrit dans le protocole. Après placage réussi dans un puits d’un plat de six bien format pour la reprogrammation, les fibroblastes sont apparus très clairsemés.
24 heures après la première transfection réussie, les fibroblastes ont perdu leur forme de fuseau et ont adopté une morphologie plus arrondie. Tout au long des trois premières transfections, la densité cellulaire a augmenté graduellement et uniformément avec un éclat apparent de prolifération se produisant entre les jours sept et huit. Au jour 10, les cellules sont apparues en grande partie confluentes.
Les premières colonies de l’IPSC sont apparues dès le jour 11. Au cours des jours 15 à 17, les colonies de l’IPSC sont devenues grandes et évidentes et clairement distinctes des fibroblastes environnants et complètement reprogrammés. L’immunostaining pour le marqueur de pluripotence TRA-1-60 a confirmé l’efficacité élevée de reprogrammation.
La densité sous-optimale du placage est la raison la plus courante d’une efficacité réduite de la reprogrammation dans ce protocole. Si la densité de placage était trop faible, de grandes parcelles de baron acellulaires sont apparues et les colonies ipsc ne se sont pas formentes. Après le passage de dilution des cellules reprogrammées, les IPSC se sont développées en tant que colonies simples et ont été facilement distinguables des fibroblastes.
Ils étaient lâchement emballés et les cellules individuelles ont eu une zone cytoplasmique relativement grande. Pendant quatre à sept jours, les CISP ont proliféré et formé une colonie caractéristique bien remplie avec des bords définis. Les cellules individuelles dans la colonie ont montré une grande fraction nucléaire avec des noyaux proéminents.
Après avoir reprogrammé les fibroblastes patients, les CISP qui en résultent peuvent être différenciés en une variété de cellules somatiques afin d’élucider les mécanismes responsables de la maladie ou de développer de nouvelles thérapies régénératives à base de cellules.
