Ce protocole immunohistochimique et histopathologique peut être employé pour examiner la bêta de récepteur de folate, qui est une protéine candidate avec la valeur pronostique et thérapeutique potentielle au microenvironnement vasculaire dans l’artérite géante de cellules. Ce protocole est testé dans le temps et largement utilisé et peut être utilisé pour explorer les attributs bêta des récepteurs foliques dans les tissus de l’artère temporelle, même après un stockage à long terme. Pour acquérir des sections tissulaires, utilisez une microtome pour trancher quatre à cinq sections micromètres d’épaisseur d’artères temporelles intégrées à la paraffine, flottant chaque section dans un bain d’eau de 40 degrés Celsius au fur et à mesure qu’elles sont obtenues, afin d’éliminer les rides.
Utilisez des toboggans au microscope en verre pour capturer trois sections par glissière et réchauffer les glissières sur une plaque chauffante, dans un four de 60 degrés Celsius pendant 60 minutes. Lorsque les sections ont adhéré aux glissières, placez les glissières dans un support vertical pour le séchage à 37 degrés Celsius pendant 24 heures. Le lendemain, transférez les glissières dans un contenant de glissière pour les entreposer à quatre degrés Celsius pendant au moins 12 heures.
Ensuite, la charge glisse dans un support de diapositives et hydrate les tissus avec deux immersions de cinq minutes, 100% xylène et une descente, cinq minutes par concentration série d’immersion d’éthanol, avec 10 secondes d’agitation toutes les 30 secondes. Après l’immersion de 70 % d’éthanol, rincer les diapositives deux fois à l’eau double-distillée pendant cinq minutes, avec 10 secondes d’agitation toutes les 30 secondes. Pour la récupération des antigènes, transférer la grille dans un récipient en verre avec 200 microlitres de 95 degrés Celsius, 10 millimolaire par litre tampon de citrate pendant 30 minutes.
À la fin de l’incubation, laisser refroidir les toboggans à température ambiante pendant 20 minutes avant de les rincer à l’eau courante pendant cinq minutes. Pour éliminer l’activité endogène de la peroxyde, utilisez d’abord un marqueur hydrophobe pour dessiner un cercle autour de chaque échantillon de tissu, avant d’incuber les échantillons dans 200 microlitres de peroxyde d’hydrogène à 3 % pendant 10 minutes, suivi de 3 lavages dans 200 micolitres de solution saline tamponnée de tris, ou TBSS, par lavage. Après le dernier lavage, tamponnez doucement chaque glissière pour enlever tout excès de tampon et ajoutez 200 microlitres du cocktail d’anticorps primaire d’intérêt et un glissement de couvercle à chaque glissière pour une incubation d’une heure dans une chambre humide à température ambiante.
À la fin de l’incubation, jeter les feuillets de couverture et rincer les glissières à l’aide de trois lavages de deux minutes dans le SCT frais. Après avoir enlevé l’excès de tampon, ajouter 200 microlitres d’une solution appropriée d’anticorps secondaires biotinylés et un glissement de couvercle à chaque glissière pour une incubation de 45 minutes dans la chambre humide à température ambiante. Après avoir jeté les feuillets de couverture, rincez les glissières avec le SCT comme démontré.
Supprimez tout tampon excédentaire. Et étiquetez les sections avec 200 microlitres de tampon de substrat DAB pendant 10 minutes à température ambiante. À la fin de l’incubation, laver les toboggans avec le SCT et faire fonctionner l’eau du robinet pendant 10 minutes, avant de les contre-tacher avec de l’hématoxyline pendant trois minutes.
Ensuite, ajoutez 70 microlitres d’un milieu de montage approprié à chaque glissière et inclinez lentement une bande de couverture en verre sur le milieu de montage pour éviter de créer des bulles pendant que le glissement de couverture est abaissé en place. Pour l’analyse histopathologique, placez la diapositive sur la scène d’un microscope léger et évaluez l’architecture vasculaire de la première section tissulaire. Ensuite, quantifier le nombre de macrophages par rapport au nombre de lymphocytes par section.
Pour l’analyse immunohistochimique, examinez le modèle de coloration bêta des récepteurs foliques sur chaque section tissulaire et quantifiez le nombre de cellules bêta positives, cd68 positives et CD3 du récepteur folique dans 10 champs de haute puissance choisis au hasard par section. La coloration de l’hématoxyline et de l’éosine dans les spécimens normaux révèle une anatomie artérielle normale, avec des cellules endothéliales dans la tunica intima, des cellules musculaires lisses dans le média tunica, et une matrice hétérogène de collagène, qui incluent des fibroblastes et des vaisseaux d’alimentation appelés vasa vasorum dans l’adventitia de tunica. Les artères temporelles positives d’arteritis de cellules géantes démontrent une inflammation modérée à grave, avec des agrégats et des macrophages, ou des histiocytes, des lymphocytes, des cellules occasionnelles de plasma, et des cellules géantes multinucléées.
Le rétrécissement luminal est également noté, et accompagné d’épaississement intimal et d’une perturbation de 90% du lamina élastique interne. Les lymphocytes positifs CD3 et les macrophages positifs CD68 sont également présents dans tous les spécimens positifs d’artérite cellulaire géante, avec des modèles de coloration similaires observés dans toutes les biopsies. La coloration pour la bêta des récepteurs foliques est limitée aux macrophages et aux cellules géantes multinucléées qui se localisent préférentiellement à l’adventitia et aux médias.
Notamment, la bêta des récepteurs foliques représentait environ 30 % du total des macrophages. Le traitement, la coupe, et le déwaxing de biopsie d’artère temporelle exigent la dextérité soignante afin d’exécuter des étapes suivantes. L’interprétation de la diapositive requiert l’expertise d’un pathologiste cardiovasculaire expérimenté.
Rappelez aux spectateurs d’utiliser des précautions de contact et respiratoires, comme des gants et des capuchons ventilés, lors de la manipulation des spécimens et des réhabilités.
