Ce travail a été soutenu par le Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek (FWO) Vlaanderen G0466.10, 11I0113N; &quot;Eddy Merckx subvention de recherche» et le «Sporta recherche Grant&quot; pour cardiologie pédiatrique, UZ Leuven, Belgique (JC); le Center for Molecular and Vascular Biology est soutenu par le Programmafinanciering KU Leuven (PF / 10/014), par le &quot;Geconcentreerde Onderzoeksacties&quot; (GOA 2009/13) de l&#39;Université de Louvain et une subvention de Boehringer-Ingelheim recherche.

Les expérimentations animales ont été approuvés par le comité d&#39;éthique de la KU Leuven. 1. Préparation des bactéries in vitro perfusions et expériences in vivo <ol><li> Nous avons utilisé S. aureus souche Newman pour toutes les expériences décrites dans ce manuscrit. S. aureus Newman a été stocké dans Brain Heart Infusion (BHI) avec 10% de glycérol à -80 ° C. </li><li> Utilisez une boucle stérile pour gratter les bactéries congelées off et l&#39;inoculer dans 5 ml bouillon de soja tryptique (TSB) O / N à 37 ° C (600 OD&gt; 3). </li><li> Laver les bactéries par centrifugation (2600 g, RT, 5 min) et remettre en suspension le culot bactérien dans 5 ml de PBS (tampon phosphate salin). </li><li> Préparer une solution à 1 mg / ml de 5 (6) ester de N-hydroxysuccinimidyle carboxy-fluorescéine (carboxy-fluorescéine) dans de l&#39;éthanol. Diluer le / solution à 1 mg ml carboxy-fluorescéine à 150 pg / ml dans de l&#39;eau de qualité laboratoire (par exemple, l&#39;eau MilliQ). Protéger les tubes de lumièreavec une feuille d&#39;aluminium et conserver à -20 ° C. </li><li> Centrifuger les bactéries (2600 xg, RT, 5 min). Remettre en suspension le culot bactérien dans 800 ul de PBS et ajouter 200 ul (concentration finale de 30 ug / ml pour les expériences de perfusion) ou 400 pl (concentration finale 50 pg / ml pour les expériences in vivo) de la / ml solution de carboxy-fluorescéine 150 ug. Protéger les tubes de la lumière avec du papier aluminium et laisser incuber pendant 30 min à température ambiante sur un agitateur. </li><li> Après marquage, bloc avec bovin solution à 6% de sérum albumine (BSA) dans du PBS. </li><li> Diluer à l&#39;aide de bactéries densitométrie optique (DO), une DO600 de 0,65 pour les expériences in vitro (correspondant à environ 3 x 10 8 unités formant des colonies (UFC) / ml pour S. aureus) et une DO 600 de 1,8 pour les expériences in vivo ( correspondant à environ 1 x 10 9 CFU / ml pour S. aureus) dans du PBS. Protéger les tubes de la lumière avec une feuille d&#39;aluminium et laisser sur la glace. </li></ol> 2. Des expériences in vitro perfusion <ol><li> Revêtement de verre Lamelles <ol><li> Diluer le facteur de von Willebrand (VWF) (Haemate P, concentration stock de 2400 pg / ml) dans de l&#39;eau de qualité laboratoire (déminéralisée distillée) à une concentration finale de 50 pg / ml. </li><li> Diluer le collagène dans une solution isotonique de glucose (solution SKF, pH 2.7 à 2.9, tel que fourni par le fabricant) à une concentration finale de 160 ug / ml. </li><li> des lamelles de verre de manteau (24 × 50 mm) avec VWF ou du collagène par 200 ul de déposer le revêtement sur du parafilm et placer la lamelle couvre-objet au-dessus de la gouttelette. La goutte se propage le long de la surface de la lamelle. </li><li> Incuber la lamelle couvre-objet dans un conteneur humidifié pendant 4 heures à température ambiante. Soulevez délicatement les lamelles du parafilm avec une aiguille émoussée. Montez la lamelle dans la partie inférieure de la chambre d&#39;écoulement. </li></ol></li><li> Revêtement de plastique Slips avec les cellules endothéliales <ol><li> Bordereaux Manteau en plastique(1 puits chambre de culture de cellules APC, Sarstedt, Allemagne) avec 1 ml d&#39;une solution de gélatine à 1% dans du PBS et incuber pendant 30 min à 37 ° C. des cellules de semence humaine endotheliales de veine ombilicale (HUVEC) sur les fiches de gélatine revêtues de plastique et les cultiver à 70-80% de confluence. Montez le glissement plastique dans la partie inférieure de la chambre d&#39;écoulement. </li></ol></li><li> Perfusion Experiment REMARQUE: une vue d&#39;ensemble schématique du modèle in vitro de perfusion est représenté sur la figure 1. <ol><li> Effectuer des études in vitro l&#39;adhérence de bactéries dans une chambre d&#39;écoulement de la plaque de micro-parallèle à une contrainte de cisaillement laminaire entre 2,5 dyne / cm 2 et 20 dyne / cm 2 pour simuler des conditions d&#39;écoulement physiologiques. </li><li> Le (conception interne) chambre d&#39;écoulement est constituée d&#39;une structure métallique et une chambre de perfusion faite de plexiglas (poly (méthyl) méthacrylate de méthyle (PMMA)). En le connectant à une pompe à perfusion de haute précision (PHD 2000 Infusion, Harvard Apparatus, USA), nous pouvons générer des flux de rates entre 0,0001 ul / min et 220,82 ml / min. </li><li> Connecter le tube à la partie supérieure de la chambre d&#39;écoulement et d&#39;injecter dans le tube support. Placez délicatement la partie supérieure de la chambre d&#39;écoulement sur le dessus de la partie inférieure et assembler la chambre d&#39;écoulement. Soyez prudent pour éviter les bulles d&#39;air. Injecter 1 ml de milieu à travers la chambre pour vous assurer que la chambre ne fuit pas et pour éliminer la solution de revêtement en excès. Éviter les bulles d&#39;air. </li><li> Placez la souris sur un coussin chauffant thermo-régulée à 37 ° C sur un plateau de microscope. Etant donné que cette procédure est un terminal, il n&#39;y a pas besoin de procédures aseptiques strictes. Faire une incision près de la veine jugulaire, retirez délicatement le côté droit du muscle col de l&#39;utérus et d&#39;isoler la veine jugulaire du tissu environnant. </li><li> Mettre en place la pompe de perfusion et microscope à fluorescence. réglages de la pompe à perfusion dépendent du diamètre de la seringue et le débit souhaité (voir section 2.4). A partir de maintenant, travailler dans une pièce sombre. </li><li> Revêtement VWF: <ol><li> Remplir une seringue avec des bactéries marquées par fluorescence et de le connecter au tube d&#39;entrée. Éviter les bulles d&#39;air. Démarrer la pompe de perfusion pendant 10 minutes. Le temps de perfusion dépend du taux de cisaillement et le revêtement, les bactéries et moyen utilisés et devrait représenter l&#39;état d&#39;équilibre de l&#39;adhérence. </li><li> Après 10 min, lavé de bactéries non liées par la connexion d&#39;une seringue avec du PBS pour le tube d&#39;entrée et de démarrage de la pompe de perfusion. </li><li> Prenez au moins 15 images ou de vidéos en différents endroits après le processus de lavage. Les bactéries sont de petite taille et potentiellement difficile de se concentrer sur. Avant l&#39;expérience de flux in vitro, le plan focal approprié peut être obtenu en plaçant une goutte de bactéries marquées par fluorescence sur une lamelle couvre-objet et en plaçant la lamelle couvre-objet dans la chambre d&#39;écoulement. Ensuite, recherchez le plan focal approprié et enregistrer les paramètres. Remarque: Au cours de l&#39;expérience de flux in vitro, la capture des images au cours de l&#39;étape de lavage (± 5 min après le début) fait en sorte que seule lasignal pour les bactéries adhérentes est capturé. </li></ol></li><li> Collagène Revêtement: <ol><li> Ajouter 60 pg / ml VWF aux bactéries marquées par fluorescence juste avant de commencer la perfusion. Remplir une seringue avec des bactéries marquées par fluorescence ou des bactéries marquées par fluorescence complété avec 60 ug / ml VWF et de le connecter au tube d&#39;entrée. Éviter les bulles d&#39;air. Répétez les étapes 2.3.5.2 à 2.3.5.3 </li></ol></li><li> Cellules endothéliales: <ol><li> Activer les cellules endotheliales par perfusion avec une solution à 0,1 mM de Ca 2+ -ionophore A23187 (solution mère 10 mM dissous dans du diméthylsulfoxyde (DMSO)) dans du DMEM à la même vitesse de cisaillement que la perfusion bactérienne pendant 10 minutes par perfusion avec un 0,1 mm. Répétez les étapes 2.3.5.2 à 2.3.5.3. </li></ol></li></ol></li><li> Calculer le taux de cisaillement et de cisaillement comme suit. taux de cisaillement = 6Q / wh 2 Où: Q: débit en ml / min, w flux: largeur en cm, h: hauteur en cm Contrainte de cisaillement (de τ) = cisaillement ratex viscosité (μ) Où μ: moyenne: 0.01 x sec dynes / cm 2, le sang total: 0,04 x sec dynes / cm 2 </li><li> L&#39;analyse d&#39;image <ol><li> Obtenir des images en direct en utilisant un microscope inversé à fluorescence avec une caméra noir et blanc et de développer l&#39;utilisation de logiciels d&#39;imagerie. Utilisez le temps d&#39;exposition de 1,5 sec. Prenez plusieurs instantanés (au moins 15) réparties de manière aléatoire sur la surface revêtue de la chambre de flux et de les enregistrer dans le format de fichier approprié. </li><li> Effectuer l&#39;analyse d&#39;image avec ImageJ. Soustraire le fond pour enlever milieux lisses continues de l&#39;image (Process - Contexte Soustraire) et définir le seuil à fixer des valeurs limites inférieure et supérieure, la segmentation des images d&#39;échelle de gris en caractéristiques d&#39;intérêt. Mesurer la zone limitée au seuil. </li><li> Comparer adhésion bactérienne, exprimée en partie fluorescente, par exemple, en utilisant un logiciel d&#39;analyse statistique. Comparer les groupes utilisant ANOVA unidirectionnelle ou two-tailed test t de Student. Signaler toutes les valeurs que moyenne ± erreur standard de la moyenne (SEM). Envisager une valeur p &lt;0,05 significative (* p &lt;0,05; ** p &lt;0,01; *** p &lt;0,001). </li></ol></li></ol> 3. mésentérique perfusion in vivo Modèle <ol><li> Préparation / chirurgie de la souris <ol><li> Jeûner la souris la nuit avant l&#39;expérience, afin de limiter le mouvement de l&#39;intestin. </li><li> Donner une vieille souris 6-8 de la semaine (C57BL / 6) l&#39;analgésie pré-opératoire par une injection sous-cutanée de la buprénorphine (0,1 mg / kg de poids corporel (BW)) 20-30 min avant la chirurgie. </li><li> Anesthésier la souris par injection intra-péritonéale de kétamine (125 mg / kg de poids corporel) et de xylazine (12,5 mg / kg de poids corporel). Vérifiez par la pédale réflexe. Appliquer une pommade vétérinaire pour prévenir la sécheresse. </li><li> Placez la souris sur un coussin chauffant thermo-régulée à 37 ° C sur un plateau de microscope. Etant donné que cette procédure est un terminal, il n&#39;y a pas besoin de ascepti strictprocédures c. Faire une incision près de la veine jugulaire, retirez délicatement le côté droit du muscle col de l&#39;utérus et d&#39;isoler la veine jugulaire du tissu environnant. </li><li> Insérez un cathéter intraveineux 2 français dans la veine jugulaire droite pour perfusion de bactéries marquées par fluorescence ou d&#39;autres solutions. Ouvrez la cavité péritonéale par une incision abdominale médiane et utiliser des cotons-tiges pour répandre le mésentère et de visualiser le artérioles mésentériques et la circulation des veinules. </li><li> Placez la souris sur le côté droit sur une plaque transparente et fixer la canule avec du ruban adhésif. Utilisez une compresse chaude pour éviter l&#39;hypothermie. Pour prévenir la déshydratation du tissu, déposer 500 pi NaCl à 0,9% sur les intestins. </li></ol></li><li> La microscopie à fluorescence de l&#39;adhérence bactérienne à la circulation mésentérique <ol><li> Travailler dans une pièce sombre. Utilisez des cotons-tiges pour immobiliser les navires et de les visualiser sous un microscope inversé. </li><li> Appliquer localement 5 pi d&#39;une solution à 10 mM of le Ca 2+ A23187 -ionophore dissous dans du DMSO. Après 10 secondes, injecter 100 pi bactéries marquées (voir l&#39;étape 1) à travers le cathéter jugulaire. Prenez des photos de time-lapse. Après l&#39;expérience est terminée, euthanasier la souris selon les directives institutionnels approuvés. </li></ol></li><li> Analyse d&#39;image <ol><li> Obtenir des images en direct en utilisant un microscope inversé à fluorescence, capturé à l&#39;aide d&#39;une caméra noir et blanc et développée en utilisant un logiciel d&#39;imagerie. Appliquer le temps d&#39;exposition automatique et l&#39;optimisation de contraste spécifique à l&#39;équipement utilisé. </li><li> Acquérir les images de time-lapse en utilisant l&#39;outil &quot;acquisition&quot; dans la barre d&#39;outils (des acquisitions multidimensionnels - Time) en utilisant 40 cycles de 1 000 images / sec. Enregistrez les images dans un format de fichier image approprié. </li><li> Traiter les images à l&#39;aide de logiciels d&#39;analyse ImageJ pour mesurer la surface de signal fluorescent par image. Définir le seuil à fixer des valeurs limites inférieure et supérieure, la segmentation des images d&#39;échelle de gris dans fonctions d&#39;intérêt. Identifier la région d&#39;intérêt (vaisseau sanguin) et mesurer la zone limitée au seuil et la région d&#39;intérêt. Comparer adhésion bactérienne, exprimée en zone fluorescente utilisant un logiciel statistique ou graphique. </li></ol></li></ol>

<ol>
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A., Lehrer, S., Sohn, H. Y., Conzen, P., Pohl, U., Kr&#246;tz, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+inhibition+of+cyclooxygenase-2+enhances+platelet+adhesion+in+hamster+arterioles+in+vivo.">Selective inhibition of cyclooxygenase-2 enhances platelet adhesion in hamster arterioles in vivo.</a> Circulation. 110 (14), 2053-2059 (2004).</li><li>Kim, K. H., Barazia, A., Cho, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+imaging+of+heterotypic+platelet-neutrophil+interactions+on+the+activated+endothelium+during+vascular+inflammation+and+thrombus+formation+in+live+mice.">Real-time imaging of heterotypic platelet-neutrophil interactions on the activated endothelium during vascular inflammation and thrombus formation in live mice.</a> J Vis Exp. 2 (74), (2013).</li></ol>

Les auteurs ont rien à révéler.

Contrainte de cisaillement est un facteur crucial pour l&#39;adhésion bactérienne précoce de la paroi du vaisseau et de la génération suivante de endovasculaire ou végétations endocardiaques et les infections métastatiques 4,5. Nous avons décrit complémentaire in vitro et dans des modèles in vivo pour étudier la pathogenèse des infections endovasculaires moins de contrainte de cisaillement physiologique. Ces modèles ont permis d&#39;identifier le facteur von Willebrand-binding protein (vWbp) comme le principal S. aureus protéines d&#39;interagir sous flux avec une paroi vasculaire lésée exposer VWF 4. Infections endovasculaires, et l&#39;endocardite infectieuse, en particulier, sont une préoccupation non seulement en raison de l&#39;échec et de la mort organe induite par le sepsis, mais aussi à cause de (&#39;&#39;) métastatiques complications locales et distantes. Pour provoquer l&#39;endocardite infectieuse et les infections métastatiques, les bactéries ont à adhérer à la paroi de la cuve et donc résister à la contrainte de cisaillement de sang qui coule. Plusétudes sur les facteurs de virulence des bactéries ont été réalisées dans des conditions statiques. Cependant, ces interactions établies pourraient ne pas résister à des forces de cisaillement et des études dans des conditions d&#39;écoulement peut révéler de nouveaux facteurs, non comptabilisés précédemment dans interaction bactérie-hôte. Utilisation de la chambre d&#39;écoulement micro-parallèle, nous et d&#39;autres avons montré l&#39;importance de VWF pour l&#39;adhésion vasculaire. Sous la contrainte de cisaillement, VWF progressivement se déploie à partir de sa structure globulaire repos, et expose le domaine A1 qui interagit avec les plaquettes via son récepteur GPIb 6. chambres d&#39;écoulement ont été largement utilisés pour étudier la fonction des plaquettes 7. De manière remarquable, également S. aureus adhérence sous flux nécessite VWF, et en particulier le domaine A1 qui est exposée à un cisaillement. Nous avons identifié vWbp de médiation contraignant VWF. vWbp est une coagulase qui contribue à S. aureus physiopathologie en activant la prothrombine de l&#39;hôte. Staphylothrombine, les resUlting complexe d&#39;une coagulase bactérienne et la prothrombine, convertit le fibrinogène en fibrine insoluble 8,9. Nos études ont montré que seulement vWbp ne pas activer la prothrombine, mais déclenche la formation d&#39;agrégats de bactéries fibrine-plaquettes, qui améliorent l&#39;adhérence aux vaisseaux sanguins sous flux 4,10,11. Le modèle in vitro de la chambre de flux permet d&#39;étudier les différents acteurs de l&#39;adhérence bactérienne aux composants cellulaires ou matrice. Facteurs de virulence bactériennes peuvent être étudiés en utilisant des mutants ou des bactéries exprimant des protéines inoffensives de surface spécifiques. En variante, les inhibiteurs pharmacologiques ou des anticorps bloquants peuvent être ajoutés au milieu dans la chambre d&#39;écoulement. Le rôle des facteurs de l&#39;hôte tels que les différents constituants de la matrice extracellulaire peut être étudiée en utilisant des lamelles avec différents revêtements. Les lamelles peuvent également être recouverts avec des cellules endotheliales, dont l&#39;état d&#39;activation peut être modulée par adjonction de stimulateurs spécifiques. Apart de la paroi vasculaire, la contribution des cellules du sang de l&#39;hôte et des protéines plasmatiques peut être étudiée en ajoutant ces facteurs dans le milieu en écoulement. Par conséquent, différentes conditions de plus en plus complexes peuvent être étudiés dans des conditions normalisées de flux laminaire pour démêler les interactions qui permettent aux bactéries d&#39;adhérer à la paroi du vaisseau in vivo. Interactions identifiés dans le modèle in vitro sont ensuite étudiés dans un modèle animal pour tester leur pertinence dans un organisme complexe. Autres modèles in vivo pour étudier les interactions dynamiques sous écoulement ont été décrits, comme la chambre de hamster pli cutané dorsal 12 et le modèle de cremaster 13. En comparaison, le modèle de perfusion mésentérique décrit ici offre plusieurs avantages en raison de sa facilité d&#39;utilisation, la possibilité de faire varier accueillir fond génétique des souris et d&#39;évaluer les interventions pharmacologiques. En conclusion, les modèles décritsoffrir la possibilité d&#39;étudier des protéines non seulement de S. de surface aureus, mais de nombreux autres micro-organismes dans différents milieux d&#39;accueil, afin de mieux comprendre la pathogenèse des infections vasculaires.

To establish endovascular infections, pathogens require a mechanism to adhere to the endothelium, which lines the vessel wall and the inner surface of the heart, and to persist and establish an infection despite being exposed to the shear stress of rapidly flowing blood. The most frequent pathogen causing life-threatening endovascular infections and infective endocarditis is Staphylococcus aureus (S. aureus)1. 
Various bacterial surface-bound adhesive molecules mediate adhesion to host tissue by interacting with extracellular matrix components. These MSCRAMMs (microbial surface components recognizing adhesive matrix molecules) recognize molecules such as fibronectin, fibrinogen, collagen and von Willebrand factor (VWF). MSCRAMMs are important virulence factors of S. aureus and are implicated in the colonization and invasion of the host2. Most studies on these virulence factors have been performed in static conditions, and thus may not be representative for human infections where initial adhesion of the bacteria occurs in flowing blood. 
In the case of bloodstream infections, bacteria need to overcome the shearing forces of flowing blood in order to attach to the vessel wall. Models that investigate the interaction between bacteria and endothelium or subendothelium under flow conditions are therefore of particular interest. 
A recent study showed that the adhesion of S. aureus to blood vessels under shear stress is mediated by VWF3. VWF, a shear stress-operational protein, is released from endothelial cells upon activation. Circulating VWF binds to collagen fibers of the exposed subendothelial matrix. Our group reported that the von Willebrand factor-binding protein (vWbp) of S. aureus is crucial for shear-mediated adhesion to VWF4. 
In this article, we present an in vitro flow chamber model where bacterial adhesion to different components of the extracellular matrix or to endothelial cells can be evaluated. To validate the findings from in vitro data, we have developed an in vivo model that visualizes and quantifies the direct interaction of bacteria with the vessel wall and the formation of bacteria-platelet thrombi in the mesenteric circulation of mice, using real-time intravital vascular microscopy.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="border-collapse:
 collapse;width:192pt">
	<colgroup>
		<col span="4" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Brain Heart Infusion (BHI)</td>
			<td>BD Plastipak&#160;</td>
			<td align="right">237500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptic Soy Broth (TSB)</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>CM0129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14190-169</td>
			<td>D-PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5(6)-carboxy-fluorescein N-hydroxysuccinimidyl ester&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>21878-25MG-F</td>
			<td>fluorescent labeling&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin Fraction V (BSA)</td>
			<td>Roch</td>
			<td colspan="2">10 735 086 001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Haemate-P</td>
			<td>CSL Behring</td>
			<td>PL 15036/0010</td>
			<td>VWF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horm collagen</td>
			<td>Takeda</td>
			<td align="right">10500</td>
			<td>collagen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-well PCA cell culture chambers</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td align="center" class="xl63">########</td>
			<td>plastic slips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temgesic</td>
			<td>Reckitt Benckiser</td>
			<td align="right">283716</td>
			<td>bruprenorphine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesketin (Ketamin hydrochloride 115 mg/ml (100 mg/ml ketaminum))</td>
			<td>Eurovet</td>
			<td>BE-V136516</td>
			<td>ketamin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XYL-M 2% (xylazine hydrochloride 23.32 mg/ml (20 mg/ml xylazine))</td>
			<td>VMD Arendonk</td>
			<td>BE-V170581</td>
			<td>xylazine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 french intravenous catheter green</td>
			<td>Portex</td>
			<td colspan="2">200/300/010</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0,9% Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Baxter Healthcare</td>
			<td>W7124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cotton swabs</td>
			<td>International Medical Product</td>
			<td align="right">300230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ca2+-ionophore solution A23187</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td colspan="2">C7522-10 MG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>26 gauge 1 ml syringe&#160;&#160;</td>
			<td>BD Plastipak&#160;</td>
			<td align="right">300013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>26 gauge 1 ml syringe&#160; with needle</td>
			<td>BD Plastipak&#160;</td>
			<td align="right">300015</td>
			<td>intra-peritoneal injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5810-R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td colspan="2">5811 000.320</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass cover slips (24x50)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BB02405A11</td>
			<td>Thickness No, 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PHD 2000 Infusion</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td align="right">702100</td>
			<td>High-accuracy Harvard infusion pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axio-observer DI</td>
			<td colspan="2">Carl-Zeiss</td>
			<td>Inverted fluorescence microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td colspan="2">National Institute of Health</td>
			<td>Analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad Prism 5,0</td>
			<td colspan="2">Graphpad Software</td>
			<td>Analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AxioCam MRm</td>
			<td colspan="2">Carl-Zeiss&#160;</td>
			<td>Black and white camera</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro and in vivo model to study bacterial adhesion to the vessel wall under flow conditions

Afin de provoquer des infections endovasculaires et l&#39;endocardite infectieuse, les bactéries ont besoin pour être en mesure d&#39;adhérer à la paroi du vaisseau tout en étant exposés à la contrainte de cisaillement du sang qui coule. Pour identifier les facteurs hôtes bactériennes et qui contribuent à l&#39;adhérence de micro-organismes vasculaire, des modèles appropriés qui étudient ces interactions dans des conditions de cisaillement physiologiques sont nécessaires. Ici, nous décrivons un modèle in vitro de la chambre d&#39;écoulement en ce que permet d&#39;étudier l&#39;adhérence bactérienne aux différents composants de la matrice extracellulaire ou aux cellules endothéliales, et un modèle de microscopie intravitale qui a été développé pour visualiser directement l&#39;adhérence initiale des bactéries à la circulation splanchnique in vivo . Ces méthodes peuvent être utilisées pour identifier les facteurs hôtes bactériennes et nécessaires pour l&#39;adhésion des bactéries sous flux. Nous illustrons la pertinence de la contrainte de cisaillement et le rôle du facteur de von Willebrand pour l&#39;adhésion de Staphylococcus aureus utilisant à la fois in vitro et in vivo dans le modèle.

S. aureus adhésion à VWF, matrice sous-endothéliale et les cellules endothéliales est un phénomène dépendant de la contrainte de cisaillement Pour souligner le rôle de la contrainte de cisaillement dans l&#39;interaction entre S. aureus et VWF, nous avons réalisé des perfusions plus de VWF lamelles recouvertes de différents taux de cisaillement (un aperçu schématique du modèle in vitro de perfusion est donné dans la figure 1. L&#39;adhérence de S. aureus VWF a augmenté avec l&#39;augmentation des taux de cisaillement de 250 sec -1 à 2000 s-1 (Figure 2), ce qui indique que les forces de cisaillement élevées mais ne inhibent renforcent l&#39;adhérence de bactéries à VWF. Afin d&#39;étudier la contribution du VWF à l&#39;adhérence bactérienne au collagène, la principale composante de la matrice sous-endothéliale, nous perfusé marqué par fluorescence S. aureus sur le collagène en présence ou en l&#39;absence de VWF. En l&#39;absence de VWF, l&#39;adhérence de S. uneuréus au collagène diminue avec l&#39;augmentation des taux de cisaillement. Toutefois, lorsque le VWF est présent dans le milieu, l&#39;adhérence de S. aureus a augmenté avec l&#39;augmentation des taux de cisaillement (Figure 3). Le modèle in vitro d&#39;écoulement en nous permet également d&#39;examiner l&#39;adhésion des bactéries aux cellules endothéliales sous flux. Nous perfusé avec HUVEC marqué par fluorescence S. aureus à un taux de cisaillement de 500 à 2000 s -1. Le cas échéant, HUVECs ont été activés avec un Ca 2+ -ionophore, à provoquer la libération du VWF. Activation des cellules endothéliales et la libération subséquente VWF, une adhérence accrue de S. aureus (figure 4A), qui a formé des motifs de chaîne &quot;analogue&quot; typiques de grappes de bactéries marquées par fluorescence alignées dans la direction de la force de cisaillement (figure 4B), ce qui suggère la liaison de bactéries le long d&#39;une molécule linéaire VWF-étiré. Initial in vivoadhésion bactérienne dans les veines splanchniques est médiée par VWF Depuis S. aureus est en mesure d&#39;adhérer à VWF, nous avons utilisé des souris de type sauvage (vWF + / +) et VWF souris déficientes (vWF - / -) pour étudier l&#39;adhésion bactérienne sur la paroi du vaisseau activé in vivo. Vidéomicroscopie en temps réel des veines splanchniques permis la visualisation in vivo de circuler marqué par fluorescence S. aureus (Vue d&#39;ensemble schématique du modèle in vivo de perfusion est représenté sur la figure 5). Après l&#39;activation pharmacologique de l&#39;endothélium par le Ca2 + -ionophore, nous avons observé une accumulation locale rapide des bactéries et des agrégats de bactéries individuelles à la paroi de la cuve de souris WT (Vidéos supplémentaire de 1 et 2). Presque aucune adhésion des bactéries n&#39;a été observée sur la paroi de la cuve du vWF activé -deficiesouris nt (vidéo supplémentaire 3) par rapport à l&#39;adhérence chez les souris WT (Figure 6). L&#39;absence de VWF diminue la capacité de S. aureus à adhérer à la paroi du vaisseau activé. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/52862/52862fig1.jpg" /> Figure 1. Représentation schématique du modèle de flux in vitro. Le modèle d&#39;écoulement vitro dans un modèle multifonctionnel, ce qui permet l&#39;étude des différents mécanismes qui dépendent de cisaillement telle que l&#39;adhérence bactérienne à la matrice sous-endothéliale, mais aussi la formation thrombus. La chambre d&#39;écoulement micro-parallèle est placée sur une lamelle couvre-objet (plastique ou verre) avec différents revêtements de protéines et de cellules endotheliales. L&#39;adhérence des bactéries différentes (orange et points gris) peut être analysé, et l&#39;impact de la présence de protéines de plasma, les plaquettes et le sang total peut être évalué. Des marqueurs fluorescents pour les plaquettes (bleu) ou ovales fibrinogfr (strings bleu) peut être utilisé en combinaison avec différents inhibiteurs (ovales noires) de distinguer les facteurs bactériens et d&#39;accueil. Des images représentatives de l&#39;adhésion bactérienne de S. aureus au collagène revêtement en présence (en bas) ou l&#39;absence (en haut) du VWF sont présentées (barre d&#39;échelle est de 100 um). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52862/52862fig1large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/52862/52862fig2.jpg" /> Figure 2. L&#39;adhérence de S. aureus à VWF augmente avec l&#39;augmentation des taux de cisaillement. Micro-parallèle perfusion de la chambre d&#39;écoulement au-dessus de VWF enrobé (50 pg / ml) marqué par fluorescence avec S. aureus Newman au taux de cisaillement de 250 à 2.000 sec -1 (sec -1) dans le milieu (n&gt; 5). Tous les résultats sont exprimés en moyenne ± SEM. * P &lt;0,05, ** p &lt;0,01. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/52862/52862fig3.jpg" /> Figure 3. L&#39;adhérence de S. aureus à sous-endothélium est dépendante de cisaillement et VWF. Micro-parallèle perfusion de la chambre d&#39;écoulement au-dessus de collagène revêtu (160 ug / ml) marqué par fluorescence avec S. aureus Newman au taux de cisaillement de 250 à 2.000 sec -1 en moyenne (n&gt; 5). VWF (60 ug / ml) était présent dans le milieu spécification. Tous les résultats sont exprimés en moyenne ± SEM. ** P &lt;0,01. <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/52862/52862fig4.jpg" /> Figure 4. L&#39;adhérence de S. aureus aux cellules endothéliales activées est dépendante cisaillement. chambre d&#39;écoulement perfusion de Micro-parallèle sur les cellules endothéliales. (A) les cellules endothéliales de veine ombilicale humaine ont été activés avec le Ca2 + A -ionophore23 187 (0,1 mM) suivie d&#39;une perfusion de 10 min marqué par fluorescence S. aureus Newman au taux de cisaillement de 500 à 2.000 sec -1 en moyenne (n&gt; 5). Tous les résultats sont exprimés en moyenne ± SEM. * P &lt;0,05. (B) Image de la micro-parallèle chambre d&#39;écoulement perfusion sur HUVEC activées avec S. aureus à un taux de cisaillement de 1000 sec -2. S. aureus forme des chaînes de ± 200 microns de longueur, ce qui suggère l&#39;adhésion à multimères VWF (barre d&#39;échelle est de 100 um). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52862/52862fig4large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 5" src="/files/ftp_upload/52862/52862fig5.jpg" /> Figure 5. Un aperçu schématique du modèle de perfusion mésentérique in vivo. Un droit de cathéter de la veine jugulaire (ligne jaune) est inséré pour l&#39;administration de fluorbactéries escently marqués (points orange), des anesthésiques supplémentaires ou d&#39;autres composants tels que les inhibiteurs pharmaceutiques et des anticorps. La cavité peritoneale est ouverte et le mésentère, réparties de visualiser les vaisseaux sanguins (artériels et veineux) sous un microscope à fluorescence. Après l&#39;activation pharmacologique de l&#39;endothélium par un -ionophore Ca2 +, ce qui induit la libération de VWF, les bactéries peuvent être injectés à travers le cathéter de la veine jugulaire. Vidéo en temps réel intravasculaire microscopie permet la visualisation in vivo de circulation bactéries marquées par fluorescence et de la formation résultant de bactéries-plaquettaires thrombus. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52862/52862fig5large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 6" src="/files/ftp_upload/52862/52862fig6.jpg" /> Figure 6. L&#39;adhérence initiale de S. aureusà l&#39;endothélium activé in vivo est médiée par VWF In vivo veineuse modèle de perfusion mésentérique avec C57BL / 6- VWF + / + et C57BL / 6- VWF -. / - souris. L&#39;adhérence de S. marqué par fluorescence aureus à la paroi du vaisseau actif localement est significativement plus faible dans Vwf - / - souris. Tous les résultats sont exprimés en moyenne ± SEM. *** P &lt;0,001, n&gt; 7. <img alt="Vidéo Figure 1" src="/files/ftp_upload/52862/52862figV1.jpg" /> Vidéo 1: adhérence en temps réel de S. aureus à la paroi du vaisseau activé dans + / + souris VWF. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52862/Video1JorienClaes.mov" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir cette vidéo.</a> Vidéo 2: la formation d&#39;agrégats en temps réel et l&#39;embolisation de S. aureus dans Vwf des souris + / +. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52862/Video2JorienClaes.mov" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir cette vidéo.</a> <img alt="Vidéo Figure 3" src="/files/ftp_upload/52862/52862figV3.jpg" /> Vidéo 3: adhérence en temps réel de S. aureus à la paroi du vaisseau activé dans Vwf - / -. In vivo souris modèle de perfusion mésentérique avec Vwf + / + et Vwf souris - / -. Cinq ul d&#39;une -ionophore Ca2 + (10 mM) a été applied dans la région du lit vasculaire visualisée. Une suspension de carboxy-fluorescéine S. aureus a été injecté à travers le cathéter jugulaire. La circulation mésentérique a été visualisée sous un microscope inversé. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52862/Video3JorienClaes.mov" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir cette vidéo.</a>

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In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

To study the interaction of bacteria with the blood vessels under shear stress, a flow chamber and an in vivo mesenteric intravital microscopy model are described that allow to dissect the bacterial and host factors contributing to vascular adhesion.

In vitro et in vivo modèle pour étudier l&#39;adhésion bactérienne au navire muraux dans des conditions de débit

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

10.5K vues.  KU Leuven. To study the interaction of bacteria with the blood vessels under shear stress, a flow chamber and an in vivo mesenteric intravital microscopy model are described that allow to dissect the bacterial and host factors contributing to vascular adhesion. 

Vidéo: In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

To cause infections, bacteria must colonize their host. Bacterial pathogens express various molecules or structures able to promote attachment to host cells1. These adhesins rely on interactions with host cell surface receptors or soluble proteins acting as a bridge between bacteria and host. Adhesion is a critical first step prior to invasion and/or secretion of toxins, thus it is a key event to be studied in bacterial pathogenesis. Furthermore, adhered bacteria often induce exquisitely fine-tuned cellular responses, the studies of which have given birth to the field of 'cellular microbiology'2. Robust assays for bacterial adhesion on host cells and their invasion therefore play key roles in bacterial pathogenesis studies and have long been used in many pioneer laboratories3,4. These assays are now practiced by most laboratories working on bacterial pathogenesis.
Here, we describe a standard adherence assay illustrating the contribution of a specific adhesin. We use the Escherichia coli strain 27875, a human pathogenic strain expressing the autotransporter Adhesin Involved in Diffuse Adherence (AIDA). As a control, we use a mutant strain lacking the aidA gene, 2787&Delta;aidA (F. Berthiaume and M. Mourez, unpublished), and a commercial laboratory strain of E. coli, C600 (New England Biolabs). The bacteria are left to adhere to the cells from the commonly used HEp-2 human epithelial cell line. This assay has been less extensively described before6.

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

This protocol is a simple bacterial adhesion assay consisting in counting the numbers of bacterial colony forming units that are adhered onto cultured cells. The assay is robust, independent of the adhesin studied, and numerous variations are used in most laboratories working on bacterial pathogenesis.

Test in vitro de l&#39;adhésion bactérienne sur des mammifères cellules épithéliales

To cause infections, bacteria must colonize their host. Bacterial pathogens express various molecules or structures able to promote attachment to host ...

Recherche

Immunologie et infection

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the initial and determining step of the pathogenesis. Although experimentally adhesion is mostly studied in static conditions adhesion actually takes place in the presence of flowing liquid. First encounters between bacteria and their host often occur at the mucosal level, mouth, lung, gut, eye, etc. where mucus flows along the surface of epithelial cells. Later in infection, pathogens occasionally access the blood circulation causing life-threatening illnesses such as septicemia, sepsis and meningitis. A defining feature of these infections is the ability of these pathogens to interact with endothelial cells in presence of circulating blood. The presence of flowing liquid, mucus or blood for instance, determines adhesion because it generates a mechanical force on the pathogen. To characterize the effect of flowing liquid one usually refers to the notion of shear stress, which is the tangential force exerted per unit area by a fluid moving near a stationary wall, expressed in dynes/cm2. Intensities of shear stress vary widely according to the different vessels type, size, organ, location etc. (0-100 dynes/cm2). Circulation in capillaries can reach very low shear stress values and even temporarily stop during periods ranging between a few seconds to several minutes 1. On the other end of the spectrum shear stress in arterioles can reach 100 dynes/cm2 2. The impact of shear stress on different biological processes has been clearly demonstrated as for instance during the interaction of leukocytes with the endothelium 3. To take into account this mechanical parameter in the process of bacterial adhesion we took advantage of an experimental procedure based on the use of a disposable flow chamber 4. Host cells are grown in the flow chamber and fluorescent bacteria are introduced in the flow controlled by a syringe pump. We initially focused our investigations on the bacterial pathogen Neisseria meningitidis, a Gram-negative bacterium responsible for septicemia and meningitis. The procedure described here allowed us to study the impact of shear stress on the ability of the bacteria to: adhere to cells 1, to proliferate on the cell surface 5and to detach to colonize new sites 6 (Figure 1). Complementary technical information can be found in reference 7. Shear stress values presented here were chosen based on our previous experience1 and to represent values found in the literature. The protocol should be applicable to a wide range of pathogens with specific adjustments depending on the objectives of the study.

During the infection process, a key step is the adhesion of pathogens with host cells. In most instances this adhesion step occurs in the presence of mechanical stress generated by flowing liquid. We describe a technique that introduces shear stress as an important parameter in the study of bacterial adhesion.

Présentation de contrainte de cisaillement dans l&#39;étude de l&#39;adhésion bactérienne

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

There is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from cystic fibrosis (CF) patients. Existing methods rely on single or a few isolates grown aerobically and planktonically. Predetermined cut-offs are used to define whether the bacteria are sensitive or resistant to any given antibiotic1. However, during chronic lung infections in CF, P. aeruginosa populations exist in biofilms and there is evidence that the environment is largely microaerophilic2. The stark difference in conditions between bacteria in the lung and those during diagnostic testing has called into question the reliability and even relevance of these tests3.
 Artificial sputum medium (ASM) is a culture medium containing the components of CF patient sputum, including amino acids, mucin and free DNA. P. aeruginosa growth in ASM mimics growth during CF infections, with the formation of self-aggregating biofilm structures and population divergence4,5,6. The aim of this study was to develop a microtitre-plate assay to study antimicrobial susceptibility of P. aeruginosa based on growth in ASM, which is applicable to both microaerophilic and aerobic conditions.
 An ASM assay was developed in a microtitre plate format. P. aeruginosa biofilms were allowed to develop for 3 days prior to incubation with antimicrobial agents at different concentrations for 24 hours. After biofilm disruption, cell viability was measured by staining with resazurin. This assay was used to ascertain the sessile cell minimum inhibitory concentration (SMIC) of tobramycin for 15 different P. aeruginosa isolates under aerobic and microaerophilic conditions and SMIC values were compared to those obtained with standard broth growth. Whilst there was some evidence for increased MIC values for isolates grown in ASM when compared to their planktonic counterparts, the biggest differences were found with bacteria tested in microaerophilic conditions, which showed a much increased resistance up to a &gt;128 fold, towards tobramycin in the ASM system when compared to assays carried out in aerobic conditions.
 The lack of association between current susceptibility testing methods and clinical outcome has questioned the validity of current methods3. Several in vitro models have been used previously to study P. aeruginosa biofilms7, 8. However, these methods rely on surface attached biofilms, whereas the ASM biofilms resemble those observed in the CF lung9 . In addition, reduced oxygen concentration in the mucus has been shown to alter the behavior of P. aeruginosa2 and affect antibiotic susceptibility10. Therefore using ASM under microaerophilic conditions may provide a more realistic environment in which to study antimicrobial susceptibility.

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Current diagnostic antimicrobial susceptibility testing relies on the planktonic growth of isolates in nutrient rich, aerobic conditions. Here, we employ an alternative artificial sputum medium to study antimicrobial susceptibility of Pseudomonas aeruginosa biofilms under both aerobic and microaerophilic conditions more representative of the cystic fibrosis lung.

L&#39;utilisation de moyen d&#39;expectoration artificielle pour tester l&#39;efficacité des antibiotiques contre<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Dans des conditions plus pertinents à la fibrose kystique du poumon

There  is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial  susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from  cystic ...

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells and Their Use in the Study of Neutrophil Transmigration Under Flow Conditions

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, neutrophils are the first inflammatory cells to migrate to the site of injury. Recruitment of neutrophils to an injury site is a stepwise process that includes first, dilation of blood vessels to increase blood flow; second, microvascular structural changes and escape of plasma proteins from the bloodstream; third, rolling, adhesion and transmigration of the neutrophil across the endothelium; and fourth accumulation of neutrophils at the site of injury2,3. A wide array of in vivo and in vitro methods has evolved to enable the study of these processes4. This method focuses on neutrophil transmigration across human endothelial cells.
One popular method for examining the molecular processes involved in neutrophil transmigration utilizes human neutrophils interacting with primary human umbilical vein endothelial cells (HUVEC)5. Neutrophil isolation has been described visually elsewhere6; thus this article will show the method for isolation of HUVEC. Once isolated and grown to confluence, endothelial cells are activated resulting in the upregulation of adhesion and activation molecules. For example, activation of endothelial cells with cytokines like TNF-&alpha; results in increased E-selectin and IL-8 expression7. E-selectin mediates capture and rolling of neutrophils and IL-8 mediates activation and firm adhesion of neutrophils. After adhesion neutrophils transmigrate. Transmigration can occur paracellularly (through endothelial cell junctions) or transcellularly (through the endothelial cell itself). In most cases, these interactions occur under flow conditions found in the vasculature7,8.
The parallel plate flow chamber is a widely used system that mimics the hydrodynamic shear stresses found in vivo and enables the study of neutrophil recruitment under flow condition in vitro9,10. Several companies produce parallel plate flow chambers and each have advantages and disadvantages. If fluorescent imaging is needed, glass or an optically similar polymer needs to be used. Endothelial cells do not grow well on glass.
Here we present an easy and rapid method for phase-contrast, DIC and fluorescent imaging of neutrophil transmigration using a low volume ibidi channel slide made of a polymer that supports the rapid adhesion and growth of human endothelial cells and has optical qualities that are comparable to glass. In this method, endothelial cells were grown and stimulated in an ibidi &mu;slide. Neutrophils were introduced under flow conditions and transmigration was assessed. Fluorescent imaging of the junctions enabled real-time determination of the extent of paracellular versus transcellular transmigration.

This article first describes a procedure for isolating human endothelial cells from umbilical veins and then shows how to use these cells to examine neutrophil transmigration under flow conditions. By using a low-volume flow chamber made from a polymer with the optical characteristics of glass, live-cell fluorescent imaging of rare cell populations is also possible.

Isolement des cellules humaines endothéliales de veines ombilicales et leur utilisation dans l&#39;étude de la Transmigration des neutrophiles en conditions d&#39;écoulement

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, ...

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the phenotypic and functional differences between murine and human monocyte-derived macrophages. Therefore, we here describe an in vitro model to generate and study primary human macrophages. Briefly, after density gradient centrifugation of peripheral blood drawn from a forearm vein, monocytes are isolated from peripheral blood mononuclear cells using negative magnetic bead isolation. These monocytes are then cultured for six days under specific conditions to induce different types of macrophage differentiation or polarization. The model is easy to use and circumvents the problems caused by species-specific differences between mouse and man. Furthermore, it is closer to the in vivo conditions than the use of immortalized cell lines. In conclusion, the model described here is suitable to study macrophage biology, identify disease mechanisms and novel therapeutic targets. Even though not fully replacing experiments with animals or human tissues obtained post mortem, the model described here allows identification and validation of disease mechanisms and therapeutic targets that may be highly relevant to various human diseases.

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

Monocyte-derived macrophages are important cells of the innate immune system. Here, we describe an easy to use in vitro model to generate these cells. Using gradient centrifugation, negative bead isolation and specific cell culture conditions, monocyte-derived macrophages can be generated for phenotypic and functional studies.

Une<em&gt; In vitro</em&gt; Modèle pour étudier l&#39;hétérogénéité de la différenciation des macrophages humains et de la polarisation

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

The vascular endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are activated by host mediators or directly by conserved microbial components or host-derived danger molecules. Activated ECs express cytokines, chemokines and adhesion molecules that mobilize, activate and retain leukocytes at the site of infection or injury. Neutrophils are the first leukocytes to arrive, and adhere to the endothelium through a variety of adhesion molecules present on the surfaces of both cells. The main functions of neutrophils are to directly eliminate microbial threats, promote the recruitment of other leukocytes through the release of additional factors, and initiate wound repair. Therefore, their recruitment and attachment to the endothelium is a critical step in the initiation of the inflammatory response. In this report, we describe an in vitro neutrophil adhesion assay using calcein AM-labeled primary human neutrophils to quantitate the extent of microvascular endothelial cell activation under static conditions. This method has the additional advantage that the same samples quantitated by fluorescence spectrophotometry can also be visualized directly using fluorescence microscopy for a more qualitative assessment of neutrophil binding.

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Neutrophil adherence to the activated endothelium at sites of infection is an integral component of the host's inflammatory response. Described in this report is a neutrophil binding assay that allows for the in vitro quantitation of primary human neutrophil binding to endothelial cells activated by inflammatory mediators under static conditions.

Quantitative<em&gt; In vitro</em&gt; Test pour mesurer l&#39;adhésion des neutrophiles à Activé cellules endothéliales microvasculaires humaines primaires dans des conditions statiques

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

Humanized Mouse Model to Study Bacterial Infections Targeting the Microvasculature

Neisseria meningitidis causes a severe, frequently fatal sepsis when it enters the human blood stream. Infection leads to extensive damage of the blood vessels resulting in vascular leak, the development of purpuric rashes and eventual tissue necrosis. Studying the pathogenesis of this infection was previously limited by the human specificity of the bacteria, which makes in vivo models difficult. In this protocol, we describe a humanized model for this infection in which human skin, containing dermal microvessels, is grafted onto immunocompromised mice. These vessels anastomose with the mouse circulation while maintaining their human characteristics. Once introduced into this model, N. meningitidis adhere exclusively to the human vessels, resulting in extensive vascular damage, inflammation and in some cases the development of purpuric rash. This protocol describes the grafting, infection and evaluation steps of this model in the context of N. meningitidis infection. The technique may be applied to numerous human specific pathogens that infect the blood stream.

Neisseria meningitidis is a human specific pathogen that infects blood vessels. In this protocol human microvessels are introduced into a mouse by grafting human skin onto immunocompromised mice. Bacteria adhere extensively to the human vessels, leading to vascular damage and development of the purpuric rash typically observed in human cases.

Souris humanisée modèle pour étudier les infections bactériennes Cibler la microvascularisation

Neisseria meningitidis causes a severe, frequently fatal sepsis when it enters the human blood stream. Infection leads to extensive damage of the blood ...

A Flow Adhesion Assay to Study Leucocyte Recruitment to Human Hepatic Sinusoidal Endothelium Under Conditions of Shear Stress

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the development of fibrosis and progression to cirrhosis. Understanding the molecular mechanisms that mediate leucocyte recruitment to the liver could identify important therapeutic targets for liver disease. The key interaction during leucocyte recruitment is that of inflammatory cells with endothelium under conditions of shear stress. Recruitment to the liver occurs within the low shear channels of the hepatic sinusoids which are lined by hepatic sinusoidal endothelial cells (HSEC). The conditions within the hepatic sinusoids can be recapitulated by perfusing leucocytes through channels lined by human HSEC monolayers at specific flow rates. In these conditions leucocytes undergo a brief tethering step followed by activation and firm adhesion, followed by a crawling step and subsequent transmigration across the endothelial layer. Using phase contrast microscopy, each step of this &#39;adhesion cascade&#39; can be visualized and recorded followed by offline analysis. Endothelial cells or leucocytes can be pretreated with inhibitors to determine the role of specific molecules during this process.

Leucocyte recruitment to the liver occurs within the specialized channels of the hepatic sinusoids which are lined by unique hepatic sinusoidal endothelial cells. Phase contrast microscopy of leucocyte recruitment across human hepatic sinusoidal endothelium under conditions of physiological shear stress can facilitate the elucidation of the molecular mechanisms which underlie this process.

Un flux Essai d&#39;adhésion à étudier Leucocyte recrutement pour hépatiques humaines sinusoïdales endothélium dans des conditions de contrainte de cisaillement

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the ...

Assay of Adhesion Under Shear Stress for the Study of T Lymphocyte-Adhesion Molecule Interactions

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and interaction with antigen presenting cells (APC) in the formation of immunological synapses. These two contexts of T cell adhesion differ in that T cell-APC interactions can be considered static, while T cell-blood vessel interactions are challenged by the shear stress generated by circulation itself. T cell-APC interactions are classified as static in that the two cellular partners are static relative to each other. Usually, this interaction occurs within the lymph nodes. As a T cell interacts with the blood vessel wall, the cells arrest and must resist the generated shear stress.1,2 These differences highlight the need to better understand static adhesion and adhesion under flow conditions as two distinct regulatory processes. The regulation of T cell adhesion can be most succinctly described as controlling the affinity state of integrin molecules expressed on the cell surface, and thereby regulating the interaction of integrins with the adhesion molecule ligands expressed on the surface of the interacting cell. Our current understanding of the regulation of integrin affinity states comes from often simplistic in vitro model systems. The assay of adhesion using flow conditions described here allows for the visualization and accurate quantification of T cell-epithelial cell interactions in real time following a stimulus. An adhesion under flow assay can be applied to studies of adhesion signaling within T cells following treatment with inhibitory or stimulatory substances. Additionally, this assay can be expanded beyond T cell signaling to any adhesive leukocyte population and any integrin-adhesion molecule pair.

This flow adhesion assay provides a simple, high impact model of T cell-epithelial cell interactions. A syringe pump is used to generate shear stress, and confocal microscopy captures images for quantification. The goal of these studies is to effectively quantify T cell adhesion using flow conditions.

Dosage de Adhérence Sous contrainte de cisaillement pour l&#39;étude des lymphocytes T-Adhesion Molecule Interactions

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and ...

Assays for Studying the Role of Vitronectin in Bacterial Adhesion and Serum Resistance

Bacteria utilize complement regulators as a means of evading the host immune response. Here, we describe protocols for evaluating the role vitronectin acquisition at the bacterial cell surface plays in resistance to the host immune system. Flow cytometry experiments identified human plasma vitronectin as a ligand for the bacterial receptor outer membrane protein H of Haemophilus influenzae type f. An enzyme-linked immunosorbent assay was employed to characterize the protein-protein interactions between purified recombinant protein H and vitronectin, and binding affinity was assessed using bio-layer interferometry. The biological importance of the binding of vitronectin to protein H at the bacterial cell surface in evasion of the host immune response was confirmed using a serum resistance assay with normal and vitronectin-depleted human serum. The importance of vitronectin in bacterial adherence was analyzed using glass slides with and without vitronectin coating, followed by Gram staining. Finally, bacterial adhesion to human alveolar epithelial cell monolayers was investigated. The protocols described here can be easily adapted to the study of any bacterial species of interest.

This report describes protocols for characterizing interactions between bacterial outer membrane proteins and the human complement regulator vitronectin. The protocols can be used to study the binding reactions and biological function of vitronectin in any bacterial species.

Dosages pour étudier le rôle de la vitronectine dans adhésion bactérienne et la résistance au sérum

Bacteria utilize complement regulators as a means of evading the host immune response. Here, we describe protocols for evaluating the role vitronectin ...