Ce protocole fournit un moyen de culture des cellules bactériennes au niveau d’une seule cellule à l’intérieur des vésicules géantes. Il est facile de développer les vésicules géantes, et seul un très petit volume de solution d’échantillon est nécessaire pour préparer les vésicules. Yuri Ota, doctorant de notre laboratoire, démontrera la procédure.
Commencez par ajouter 20 microlitres de solution POPC fraîchement préparée et quatre microlitres de solution biotine-PEG-DSPE fraîchement préparée à un flacon de verre. Évaporer le solvant organique par flux d’air jusqu’à ce qu’un film lipidique soit formé. Placez le film dans un dessiccateur pendant une heure pour évaporer complètement le solvant organique.
Ajouter ensuite 200 microlitres d’huile minérale au flacon. Couvrir l’ouverture du flacon de film de paraffine en plastique et sonifier le contenu du flacon dans un bain ultrasonique à 120 watts pendant au moins une heure. Pour une petite préparation vésicule, créer un film lipidique, comme il vient de le démontrer, et ajouter 200 microlitres de glucose de 200 millimètres dans le milieu LB au film.
Puis sonicate le film à 120 watts pendant au moins une heure, suivie par l’extrusion des vésicules géantes résultantes en petites vésicules à l’aide d’un mini extrure et une membrane en polycarbonate avec une taille pore de 100 nanomètres. Pour la pré-culture des cellules bactériennes, inoculer E.coli à partir d’une plaque LB en millilitres de moyenne LB pour une culture nocturne à 37 degrés Celsius. Le lendemain matin, transférez 20 microlitres du supernatant de la culture à 1,98 millilitres de milieu LB frais pour deux heures supplémentaires de culture.
À la fin de l’incubation, vérifiez la densité optique à 600 nanomètres, ou valeur OD 600, de la solution de pré-culture sur un spectrophotomètre. Une solution pré-culture avec un OD 600 de un à 1,5 doit être utilisée. Mélangez ensuite la solution pré-culture avec une solution de saccharose fraîchement préparée et un milieu LB frais, selon le premier tableau.
Pour la formation de vésicules géantes, ajouter 50 microlitres d’une solution aqueuse extérieure fraîchement préparée de vésicules géantes à un tube en plastique liquéfié de 1,5 millilitre. Superposez délicatement 150 microlitres de la solution d’huile contenant des lipides sur la solution aqueuse externe des vésicules géantes. Incuber la solution résultante pendant 10 à 15 minutes à température ambiante, avant de vérifier pour s’assurer que l’interface de l’huile et des solutions aqueuse est plate.
Pour la cellule bactérienne d’eau et d’huile contenant la formation de gouttelettes, ajoutez deux microlitres d’une solution aqueuse intérieure fraîchement préparée des vésicules géantes à 50 microlitres de la solution d’huile lipidique sonicated dans un tube en plastique liquéfié de 0,6 millilitre. Ensuite, appuyez sur le tube pour émulsionner les deux composants. Ensuite, utilisez une pipette pour ajouter 50 microlitres de solution de gouttelette d’eau et d’huile à l’interface de l’huile et de la solution aqueuse, et sédimentez les vésicules géantes contenant des cellules bactériennes par centrifugation.
Aspirez ensuite la couche d’huile supérieure et recueillez les vésicules géantes. Pour préparer une chambre faite à la main, percer un trou de sept millimètres avec un poinçon creux sur un joint à double face de 10 x 10 par un millimètre, puis coller le joint à double face sur un verre de couverture de 30 x 40 millimètres. Pour préparer une membrane à deux couches soutenue, ajouter 30 microlitres de la petite solution vésicule au trou de la chambre faite à la main.
Incuber les vésicules à température ambiante pendant 30 minutes. À la fin de l’incubation, laver délicatement le trou deux fois avec 20 microlitres de LB moyen, complété par du glucose de 200 millimiller. Pour immobiliser les vésicules géantes sur la membrane bicouque supporteuse, introduisez 10 microlitres de neutravidine dans la solution externe de vésicule géante aqueuse au trou pendant une incubation de 15 minutes à température ambiante.
À la fin de l’incubation, laver délicatement le trou deux fois avec 20 microlitres de LB moyen, complété par du glucose de 200 millimiller, et ajouter tout le volume de solution vésicule géante au trou dans la chambre. Ensuite, sceller le trou avec un verre de couverture de 18 par 18 millimètres. Pour surveiller la croissance bactérienne dans les vésicules géantes, sélectionnez l’objectif 40X sur un microscope inversé et placez la chambre sur le système de chauffage au microscope.
Puis incuber les vésicules géantes contenant des cellules bactériennes dans la chambre dans des conditions statiques pendant six heures à 37 degrés Celsius, capturer et enregistrer des images de la croissance des cellules bactériennes toutes les 30 minutes, avec la caméra semi-conducteur d’oxyde métallique complémentaire scientifique. Les vésicules géantes contenant des cellules bactériennes varient généralement en taille de 10 à 30 micromètres. Pour les deux tailles de vésicules géantes, les cellules E.coli subissent des processus d’allongement et de division, certaines cellules E.coli se développent à un très grand nombre de cellules au cours de la période d’observation de six heures.
La fréquence relative des vésicules géantes contenant un seul niveau cellulaire est d’environ 10% des vésicules géantes obtenues, et les vésicules géantes encapsulées au niveau d’une seule cellule sont environ 50% des vésicules géantes contenant des cellules bactériennes. La stabilité de l’interface huile-eau est importante pour obtenir des vésicules géantes contenant des cellules bactériennes. Prenez soin d’aspirer l’huile soigneusement avant la correction vésicule géante.
Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de la culture des cellules bactériennes au niveau d’une seule cellule dans les vésicules géantes individuelles. Notre méthode de culture bactérienne est un nouvel outil de microbiologie pour la culture de bactéries environnementales inconnues pour obtenir ou analyser leurs produits métaboliques.
