La nanoprécipitation flash, ou techniques FNP démontrées ici offrent une plate-forme évolutive et simple pour encapsuler les composés hydrophobes ou hydrophiles à l’intérieur des nanoparticules polymériques. Pour plus de clarté, la technique utilisée pour encapsuler les produits biologiques est appelée nanoprécipitation flash inverse, ou IFNP. Les principes sous-jacents sont inchangés, mais la structure des nanoparticules qui en résulte est différente.
En général, les nouveaux utilisateurs ont besoin de pratique pour faire fonctionner systématiquement les seringues d’entrée lorsqu’ils font manuellement de petits lots de nanoparticules. De plus grands volumes peuvent être produits avec des pompes à seringues contrôlées par ordinateur. Notre protocole fournit également des détails concernant le post-traitement des solutions de nanoparticules, ce qui est souvent essentiel à la réussite de l’application d’une formulation.
Avant de commencer le processus, vérifiez les raccords du mélangeur CIJ et assurez-vous que le tube de sortie n’est pas serti. Ensuite, remplissez deux seringues sans polypropylène en caoutchouc Luer de cinq millilitres avec deux à trois millilitres d’acétone, ou un autre solvant nettoyant. Verrouillez les seringues dans les adaptateurs d’entrée et réglez l’assemblage sur un conteneur à déchets.
Déprimez régulièrement les pistons pour envoyer le solvant à travers la chambre de mélange pendant quelques secondes. Ensuite, retirez les seringues et séchez le mélange avec un jet de gaz azoté. Ensuite, pour commencer à préparer le flux d’entrée de solvants, pipette 0,25 millilitres d’une solution de 10 milligrammes par millilitre de vitamine E, dans le tétrahydrofuran libre stabilisateur, dans un tube de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre.
Ensuite, pipette 0,25 millilitres d’une solution de 10 milligrammes par millilitre d’un stabilisateur de copolymère bloc dans THF dans le même tube. Vortex le mélange pendant cinq à 10 secondes, puis le centrifuger à mille G pendant cinq à 10 secondes pour récupérer le liquide adhérant au bouchon. Préparez un tube de centrifugeuse de 1,5 millilitre contenant 0,525 millilitres d’eau déionisée comme antisolvant.
Puis, pipette quatre millilitres d’eau déionisée dans un flacon de scintillation de 20 millilitres pour faire le bain étanche. Placer un petit bar à remous dans le flacon. Placer le mélangeur CIJ propre sur le bain étanche dans une grille ou un bloc de tube à essai sur une plaque à remuer.
Commencez à remuer le bain étanche à environ 75% de la vitesse maximale possible. Ensuite, adaptez une aiguille à pointe émoussée à une seringue sans caoutchouc polypropylène d’un millilitre et tracez l’antisolvant. Expulsez soigneusement les bulles d’air de la seringue, puis retirez et jetez l’aiguille.
Ajustez le piston de sorte que le liquide arrive juste à l’extrémité de la seringue. Ensuite, attachez la seringue à l’une des entrées du CIJ. Dessiner le mélange de solvants dans une deuxième seringue de la même manière, et l’attacher à l’autre entrée.
Pour former les nanoparticules, déprimez simultanément les deux pistons avec un mouvement uniforme lisse en moins de 0,5 seconde. Il est essentiel de déprimer les seringues rapidement, uniformément et en douceur. Vous ne devriez pas frapper soudainement les seringues, mais devriez commencer le mouvement déjà en contact avec le dessus des seringues.
Ensuite, placez le mélangeur CIJ sur le conteneur à déchets, sans enlever les seringues pour s’assurer que le volume de hold-up ne s’écoule pas dans la dispersion. Retirer la barre de remue-remuer du flacon de scintillation et la capuchon. Ensuite, retirez et jetez les seringues solvantes et anti-solvants.
Nettoyez le mélangeur avant le prochain essai de nanoprécipation flash. Pour préparer un échantillon à l’analyse dynamique de la diffusion de la lumière, pipette 100 microlitres de la dispersion en cuvette. Ajouter 900 microlitres de solvant de bain étanche, et bien mélanger par pipetting avant de commencer l’analyse de l’échantillon.
Pour commencer à assembler le micro MIVM, placez l’anneau O dans le disque de géométrie de mélange. Alignez les trous dans le disque de mélange avec les chevilles sur le disque supérieur, et adaptez-les ensemble, en prenant soin de ne pas déplacer l’anneau O. Desserrez le raccord de tube de sortie dans le récepteur inférieur, puis vissez les disques connectés dans le récepteur.
Adapter une clé de clé aux chevilles du disque supérieur et serrer l’assemblage. Serrez le raccord de tube de sortie de sorte qu’il se repose fermement contre la face inférieure du disque de géométrie de mélange. Assurez-vous que les raccords de seringue sur le disque supérieur sont bien ajustés.
Soulevez la plaque mobile sur le support du mélangeur pour la garder à l’extérieur, puis placez le mélangeur assemblé sur le support, avec le tube de sortie fileté à travers la plaque de soutien. Ensuite, placez un tube centrifugeuse de 15 millilitres contenant 5,25 millilitres de chloroforme comme bain étanche sous le tube de sortie. Puis, dessiner 0,75 millilitres de solution A, qui est une solution de cinq milligrammes par millilitre d’ovalbumine dans le sulfure de diméthyle dans 10% d’eau par volume, dans une seringue de verrouillage Luer étanche à un millilitre de gaz avec une aiguille à pointes émoussées.
Expulsez soigneusement les bulles d’air, retirez l’aiguille et amorcez la solution à l’extrémité du raccord Luer. Connectez la seringue à une entrée de mélangeur. Répétez ce processus avec 0,75 millilitres chacun de la solution B, qui est de six milligrammes par millilitre de stabilisateur de copolymère bloc dans DMSO, et la solution C, qui est THF.
Connectez les seringues aux entrées du mélangeur dans le sens des aiguilles d’une montre, par ordre alphabétique. Préparez une seringue étanche au gaz de 2,5 millilitres contenant 1,85 millilitres de solution D, qui est chloroforme, et connectez-la à la quatrième entrée. Confirmez qu’il n’y a pas de différence significative dans la hauteur des seringues.
Ensuite, saisissez soigneusement le boîtier de roulement de chaque côté de la plaque mobile, et abaissez lentement la plaque jusqu’à ce qu’elle repose à peine uniformément sur les seringues. Pour produire les nanoparticules, déprimez régulièrement et en douceur la plaque en environ 0,5 à une seconde. Ensuite, retirez et plafonnez le tube de bain étanche.
Démonter et nettoyer le mélangeur une fois terminé. Pour travailler avec de plus grands volumes, chargez les solutions dans des seringues étanches au gaz et connectez des tubes en polytétrafluoroéthylène avec des raccords Luer aux seringues. Prime les solutions aux extrémités du tube.
Serrez les seringues dans des pompes à seringues et attachez le tube aux entrées de mélangeurs appropriées. Placez un petit flacon de déchets sous le tube de sortie pour la collecte du volume de démarrage. Préparez le bain étanche et gardez-le à proximité.
Simultanément, démarrez les pompes et laissez couler environ cinq millilitres d’effluents dans le flacon de déchets. Ensuite, commencer à recueillir les nanoparticules dans le bain étanche comme d’habitude. Une plaque à remuer peut être utilisée pour mélanger le bain étanche si désiré.
Quatre répliques de FNP des nanoparticules polymériques avec un noyau hydrophobe, préparées dans le mélangeur de CIJ, ont montré la réplicabilité élevée, et étaient relativement monodisperse, avec un diamètre moyen de 107 nanomètres. Un raté représentatif de la dépression de seringue lente ou inégale, a produit des particules légèrement plus grandes, tandis que la polydispersité n’a pas été affectée dans cet exemple, les ratés peuvent avoir comme conséquence plus de distributions de polydisperse. La fonction d’auto-corrélation DLS s’est détériorée en douceur pour un échantillon représentatif de nanoparticules polymériques.
Cette décomposition lisse n’a pas été observée quand la formulation a été essayée sans le stabilisateur de copolymère de bloc, qui a produit des gouttelettes d’huile à l’échelle de micron à la place. La quantité relative de matériau de base au stabilisateur contrôlait la taille des particules, comme on le voit ici, dans les nanoparticules avec un noyau de polystyrène. Le PDI était inférieur à 0,15 dans chaque formulation.
Nanoparticules avec des noyaux hydrophiles où produit par IFNP. Les particules avec un noyau de maltodextrine, préparées dans le mélangeur de CIJ, étaient environ 65 nanomètres de diamètre, et ont eu un PDI de 0.08. Les particules avec un noyau ovale préparé dans le micro MIVM étaient d’environ 125 nanomètres de diamètre, et avaient un PDI de 0,16.
FNP et IFNP sont des outils puissants pour le traitement des molécules et des nanoparticules. Avant d’effectuer l’une ou l’autre technique, assurez-vous de tenir compte des solubilités de chaque composant dans tous les solvants, ou mélanges de solvants, afin d’assurer une saturation super élevée pendant le mélange. La technique de base est simple, mais la maîtrise des étapes de dépression seringue prend une certaine pratique.
Si vous avez des problèmes avec cela, envisager d’utiliser une configuration de pompe seringue comme celle montrée dans cette vidéo pour améliorer la cohérence. Pour les molécules hydrophiles chargées, ou molécules avec la solubilité intermédiaire, FNP peut être combiné avec l’appariement hydrophobe d’ion pour permettre l’encapsulation efficace. FNP peut également être utilisé pour encapsuler plusieurs composés dans le même noyau de nanoparticules.
Consultez le texte et d’autres ressources de la littérature pour apprendre à éliminer au mieux les solvants organiques des dispersions de nanoparticules dans votre application désirée. Il existe également une gamme de techniques de stabilisation des nanoparticules pendant le stockage.
