Ce protocole utilise toutes les caractéristiques majeures de l’AFM, non-agréable à d’autres techniques molécule unique. En conséquence, nous sommes en mesure de résoudre la structure du nucléosome à l’échelle nanométrique. Fait important, la visualisation directe des nucléosomes s’est faite dans des conditions physiologiques.
En utilisant notre technique AFM, nous avons récemment révélé des propriétés uniques du noyau centromere qui peut jouer un rôle sur la fonction de l’ensemble du centromere. La méthode à montrer est actuellement appliquée dans notre laboratoire pour étudier l’auto-assemblage des protéines associées à la formation d’agrégats amyloïdes. Ces agrégats protéiques déclenchent le développement de maladies dévastatrices comme la maladie d’Alzheimer et la maladie de Parkinson pour n’en nommer que quelques-unes.
Les méthodes de préparation simples s’appliquent également à d’autres complexes protéines-ADN, y compris les grands systèmes tels que les machines de réplication de l’ADN. Bien que quelques modifications soient nécessaires. Afin de caractériser les particules nucléosomes au niveau d’une molécule unique à l’aide de microscopie statique et en accéléré de la force atomique, commencez par purifier, assembler et valider les nucléosomes tels que décrits dans le protocole texte qui l’accompagne.
Ensuite, préparez la surface mica pour l’imagerie statique AFM. Pour ce faire, préparez d’abord une solution de stock APS de cinquante millimolaires dans de l’eau déionisée. Conservez un millilitre aliquots de cette solution à quatre degrés Celsius, jusqu’à ce qu’elle soit nécessaire.
À partir de la solution stock, préparez une solution APS de travail pour la modification du mica en dissolvant 50 microlitres du stock aps de 50 micromolaires en 15 millilitres d’eau déionisée distillée. Mélanger la solution, puis remplir une cuvette avec la solution. Ensuite, coupez une par trois bandes de mica de feuilles de mica de haute qualité.
Vérifiez que la pièce s’adapte lorsqu’elle est placée en diagonale dans une cuvette. Ensuite, fendre les couches de la mica jusqu’à ce que les deux côtés soient fraîchement fendillés, et la pièce est aussi mince que 0,1 millimètre. Placez immédiatement le morceau de mica dans la cuvette remplie d’APS et incubez le mica pendant 30 minutes.
Transférer le morceau de mica dans une cuvette remplie d’eau déionisée distillée et la tremper pendant 30 secondes. Ensuite, utilisez l’argon pour sécher complètement les deux côtés de la bande de mica APS. Appliquez du ruban adhésif à double face sur plusieurs rondelles magnétiques et placez-les sur le côté.
Ensuite, coupez le substrat de mica APS à un centimètre par un centimètre carré, et couvrez-les dans une boîte de Pétri propre. Ensuite, préparez trois dilutions des nucléosomes assemblés à l’aide d’un tampon filtré de 0,22 micron contenant des hepes de 10 millimolaires et du chlorure de magnésium millimolaire à un PH de 7,5. Pour limiter la perte de nucléosomes, à la faible concentration finale, la dilution doit être faite une à la fois, immédiatement avant le dépôt sur la mica APS.
Déposez de cinq à dix microlitres de chaque échantillon de nucléosome au centre d’un morceau de mica APS et laissez-les incuber pendant deux minutes. Rincez ensuite doucement l’échantillon avec deux à trois millilitres d’eau déionisée distillée pour enlever les composants tampons. Et séchez l’échantillon déposé sous un léger flux d’argon.
Pour commencer, montez une pointe sur le support de pointe de la configuration AFM. Ensuite, montez le premier échantillon sur l’étape de l’AFM, en prenant soin de ne pas entrer en contact avec la surface de l’échantillon. Placez le laser au-dessus du porte-à-faux jusqu’à ce que sa somme soit au maximum et ajustez les valeurs de déflexion verticale et latérale à près de zéro.
Ensuite, réglez la sonde AFM pour trouver sa fréquence de résonance, ajustez l’amplitude du lecteur et réglez la taille de l’image à 100 par 100 nanomètres. Une fois mis en place, cliquez sur le bouton engager pour commencer l’approche. Lorsque l’approche est terminée, optimisez graduellement le point d’amplitude jusqu’à ce que la surface de l’échantillon soit clairement visible.
Ensuite, augmentez la taille de l’analyse à un micron par un micron et la résolution à 512 par 512 pixels. Enfin, cliquez sur le bouton capture pour commencer l’acquisition d’image. Utilisez de la colle de scanner de tige de verre pour fixer une tige de verre à l’étape du scanner AFM.
Laissez sécher pendant au moins 10 minutes. Entre-temps, faire des morceaux circulaires de mica de 0,1 millimètre d’épaisseur d’un diamètre de 1,5 millimètre en les frappant à partir d’une plus grande feuille de mica. Utilisez la colle à tige en verre Mica afm à grande vitesse pour fixer ce morceau de mica à la tige de verre sur l’AFM à grande vitesse, et lui permettre de rester intact pendant un minimum de 10 minutes pendant qu’il sèche.
Ensuite, fendez les couches du mica à l’aide d’un ruban sensible à la pression jusqu’à ce qu’une couche bien fendée soit visible sur la bande. Ensuite, diluer un microlitre de 50 millimillons de stock APS dans 99 microlitres d’eau déionisée distillée pour faire une solution APS de 500 micromolaires. Déposez 2,5 microlitres de la solution sur la surface fraîchement fendue de mica et laissez la surface fonctionnaliser pendant 30 minutes.
Après l’incubation, rincer le mica plusieurs fois à l’eau déionisée distillée en appliquant trois rinçages microlitres. Retirer complètement l’eau après chaque rinçage en plaçant un lingette non tissée au bord de la mica. Après le rinçage final, placez trois microlitres d’eau déionisée distillée à la surface et laissez-la reposer pendant au moins cinq minutes pour enlever tout APS non spécifiquement lié.
Ensuite, placez la sonde dans le support afm à grande vitesse, et placez le support sur l’étage AFM avec la pointe orientée vers le haut. Rincez le support à l’aide de 100 microlitres d’eau déionisée distillée, suivi de deux rinçages de 100 microlitres de tampon d’imagerie nucléosome filtré de 0,22 micron. Une fois les rinçages effectués, remplissez la chambre de 100 microlitres de tampon d’imagerie nucléosome, vantant la pointe.
Ajustez la position en porte-à-faux jusqu’à ce qu’elle soit touchée par le laser. Rincez ensuite la mica APS cinq fois à l’aide d’un tampon d’imagerie nucléosome filtré, à l’aide de quatre microlitres par rinçage. Diluer un microlitre du stock d’assemblage nucléosome en 250 microlitres de tampon d’imagerie nucléosome filtré pour une concentration nucléosome finale d’un nanomolaire.
Déposez 2,5 microlitres de cette dilution à la surface et laissez-le reposer pendant deux minutes. Rincez la surface deux fois à l’aide de quatre microlitres de tampon d’imagerie nucléosome pour éviter l’encombrement. Après le rinçage final, laissez la surface couverte d’un tampon d’imagerie.
Réglez le scanner et l’échantillon sur le support de pointe de sorte que l’échantillon est face vers le bas. Pour commencer l’approche, utilisez la fonction d’approche automatique avec l’amplitude du point défini près de l’amplitude d’oscillation libre. Ajustez le point de réglage jusqu’à ce que la surface soit bien suivie.
Ensuite, réglez la zone d’image autour de 150 par 150 nanomètres à 200 par 200 nanomètres avec le taux d’acquisition de données d’environ 300 millisecondes par image. En tant que contrôle de l’assemblage et du dépôt, les mononucléosomes H3 ont été préparés et photographiés à l’aide d’AFM statique. Cette image fournit un instantané de la population nucléosome telle qu’elle existait quelques instants avant le dépôt confirmant que les nucelosomes ont été assemblés avec succès.
Avec l’assemblage de contrôle H3 un succès, les méthodes présentées ont ensuite été appliquées à l’étude des nucléosomes CENP-A. L’imagerie statique d’AFM de cet échantillon a indiqué que son assemblage était un succès. À partir des images statiques de l’AFM, le nombre de mononucléosomes de hauteur et de tour pourrait être caractérisé.
L’angle entre les bras libres d’ADN et la longueur des bras libres d’ADN sont utilisés pour déterminer le nombre de tours d’ADN dans le nucléosome individuel. En revanche, l’imagerie AFM en accéléré des nucléosomes peut être utilisée pour visualiser le comportement global spontané de déballage des nucléosomes. Au fur et à mesure que le nombre de virages du nucléosome diminue, on observe également une diminution correspondante du volume du noyau nucléosome.
En plus de l’imagerie par laps de temps régulière, l’AFM à grande vitesse peut être utilisé pour sonder la dynamique nucléosome plus complexe qui est manquée à l’aide de l’imagerie standard time lapse. La capacité de cette technique à capturer la dynamique sur une longue période de temps était essentielle à la visualisation d’une translocation à longue distance d’un noyau nucléosome CENP-A, qui a été capturé au cours de 1200 images. Cette technique a également été critique en capturant le transfert rare d’un noyau nucléosome CENP-A d’un substrat d’ADN à un autre.
Le taux de capture rapide de l’image a rendu possible la visualisation de cet événement dynamique car il n’a fallu que plusieurs images à compléter. Dans le vaste domaine de la chromatine, il y a un ensemble de questions importantes relatives aux rôles des histones liger et au grossissement histone de la dynamique chromatine. Toutes ces questions peuvent être répondues en utilisant notre technique.
