La taille et la forme des particules de boue activées sont essentielles à l’efficacité du traitement des eaux usées. Pourtant, leur mesure est souvent ponctuelle. Ce protocole fournit une mesure reproductible, bien définie et semi-automatisable pour leur mesure.
Le principal avantage de ce protocole est qu’il peut mesurer une grande population de particules sur un large éventail de morphologies tout en réduisant les biais subjectifs et systématiques. Bien que cette technique soit axée sur les boues activées, techniquement tout ce qui a la même morphologie de particules comme les microplastiques peut être mesuré avec cette méthode. Lorsque vous essayez cette technique pour la première fois, essayez de faire une plaque à la fois et de pratiquer les mouvements physiques de la fabrication de cette seule plaque.
Aussi, prenez votre temps avec la microscopie. La version vidéo de cet article est importante parce que l’échantillonnage et la préparation des plaques nécessitent beaucoup de petites techniques qui sont mieux communiquées visuellement. En outre, montrer et voir de bonnes images des plaques sont importants pour assurer la reproductibilité.
Joseph Weaver, candidat au doctorat dans mon laboratoire, démontre ce protocole aujourd’hui. Pour commencer, obtenir un échantillon représentatif d’une partie bien mélangée du réacteur. Mélanger délicatement l’échantillon, puis verser immédiatement le volume déterminé de l’échantillon dans un tube de centrifugeuse de 15 millilitres.
Ajouter ensuite cinq microlitres d’un pour cent de bleu méthylène à chaque échantillon. Capuchon et mélanger l’échantillon en inversant doucement le tube au moins trois fois. Laisser les échantillons tacher pendant au moins cinq, mais pas plus de 30 minutes à température ambiante.
Une fois taché, transférer un volume suffisant d’agar fondu de 7,5 pour cent et d’eau déionisée dans le tube de centrifugeuse afin d’amener le volume total du tube entre 6,5 et 9 millilitres. Puis récapituler les tubes de centrifugeuse et les inverser doucement au moins trois fois pour mélanger l’échantillon dans l’agar. Tout en pointant le bouchon loin de soi, ouvrez le bouchon.
Verser le contenu du tube de chaque tube dans leur propre boîte de Pétri en plastique de 100 millilitres tout en berçant doucement le plat pour obtenir un revêtement complet et lisse et une distribution visuellement uniforme des particules. Laisser refroidir les assiettes à température ambiante pendant au moins 5 minutes, jusqu’à ce que l’agar se solidifie. Placez la plaque découverte face vers le haut sur le stade de microscope d’un microscope stéréo qui est capable de 10 à 20 fois grossissement.
Illuminez l’échantillon d’en bas avec même une lumière diffuse, à l’aide d’équipements tels qu’un support d’éclairage LED ou une plaque lumineuse. Ouvrez le logiciel de capture d’image et assurez-vous que la trajectoire de lumière du microscope est réglée sur la photo. Ensuite, sélectionnez l’appareil photo approprié à partir de la liste des caméras.
Ajustez le microscope de sorte que plusieurs particules apparaissent dans le plan focal avec de grands bords bien définis. Utilisez un grossissement de 10 à 20 fois pour mesurer les particules tout en maintenant un plan focal relativement profond. Retirez temporairement la plaque d’agar et placez le micromètre sur la scène.
Réglez la mise au point fine jusqu’à ce que les graduations sur le micromètre semblent fortement ciblées dans le logiciel de capture d’image. Et calibrer le rapport pixel/micron. Ensuite, réglez le zoom à 100 pour cent en cliquant sur afficher et en sélectionnant la taille réelle.
Ensuite, sélectionnez les options et allez calibrer. Ici, alignez la barre d’étalonnage rouge dans le viewport principal le long du long axe du micromètre. Avec les barres verticales centrées sur le zéro et 200 microns graduations.
Dans la boîte de dialogue calibré, entrez le niveau actuel de grossissement et la longueur réelle de 200 microns. S’il est déjà calibré, sélectionnez le grossissement de la barre de menu, puis sélectionnez le niveau de grossissement actuel pour confirmer l’étalonnage. Dans le menu des mesures, allez en ligne et sélectionnez la ligne arbitraire.
Cliquez sur l’intersection du zéro graduation et du long axe du micromètre. Puis cliquez à nouveau sur l’intersection à la ligne de 200 microns et le long axe. Un étalonnage correct doit s’afficher sous forme d’environ 200 microns.
Supprimez la ligne en cliquant sur le bouton objet sélectionné, en cliquant sur la ligne, en appuyant sur supprimer, et en appuyant oui sur la boîte de confirmation. Ensuite, remplacez la plaque d’agar et ajustez la mise au point fine pour obtenir un maximum de détails dans le logiciel d’imagerie. Pour ce faire, augmentez d’abord la profondeur du bit de la valeur maximale autorisée en sélectionnant le bouton radio dans le panneau de profondeur de bit de la barre latérale de la caméra.
En outre, réglez le logiciel pour acquérir des images à échelle grise en sélectionnant le bouton radio approprié dans le panneau de qualité couleur de la barre latérale de la caméra. Maintenant, l’effondrement de tous les panneaux latéraux ouverts entre l’exposition et l’histogramme. Réduisez le gain à un et augmentez l’exposition jusqu’à ce qu’une image claire apparaisse dans le viewport et jusqu’à ce que l’histogramme apparaisse comme une distribution qui n’est pas coupée à chaque extrémité de la boîte d’histogramme.
Ajustez l’histogramme pour éviter une exposition répétée et sous-exposition. Dans le panneau histogramme de la barre latérale de la caméra, faites glisser la limite gauche de l’histogramme juste à l’extérieur des valeurs les plus basses et de la limite droite à juste à l’extérieur des valeurs les plus élevées. Enregistrez l’image sous la forme d’un fichier TIF non compressé.
Incluez des informations de grossissement dans les métadonnées d’image en cochant l’enregistrement avec la boîte d’information d’étalonnage lors de l’enregistrement. Sélectionnez une autre zone qui ne chevauche pas les images précédentes en suivant un chemin qui alterne entre de gauche à droite et de droite à gauche lorsque l’on descend la plaque. Capturez au moins 500 particules visuellement estimées pour analyse.
Obtenez le code d’analyse des particules en clonage du référentiel GIT. À la ligne de commande, récupérez la dernière version du code en tapant la commande indiquée ici. Installez le code d’analyse en suivant les instructions dans le fichier texte lisez-moi trouvé dans le répertoire de haut niveau du référentiel cloné.
Ensuite, modifiez un fichier texte énumérant les répertoires à traiter avec des paramètres optionnels. Consultez les exemples et la sous-direction d’analyse pour une liste de paramètres et d’exemples. Maintenant, exécutez l’analyse sur la ligne de commande en tapant la commande indiquée ici.
Fidji chemin est le répertoire dans lequel imageJ-win64. exe est situé. Et paramsfile l’emplacement du fichier texte décrivant la configuration de l’analyse.
Le nom de l’exécuteur testamentaire peut différer selon le système d’exploitation sur lequel Fidji est installé. L’analyse s’exécutera automatiquement et prendra de quelques minutes à quelques heures selon la taille et le nombre d’images. Ensuite, examinez les fichiers de contrôle de la qualité situés dans la sous-direction de superposition de l’annuaire de sortie spécifié.
Notez les images avec une brume fallacieuse ou des particules mal capturées, toutes apparentes comme des contours ombragés qui ne correspondaient pas à l’arrière-plan. Voilà. Les données sont maintenant prêtes pour l’analyse spécifique de l’expérience et la génération de chiffres.
Bien qu’aucune méthode de seuil de particules ne soit parfaite, voici un exemple de résultats acceptables. Lors de l’évaluation des images QC, il ya trois erreurs courantes trouvées. Défaut de se conformer avec précision aux limites des particules, incapacité d’identifier les particules et inclusion d’artefacts.
Ici, les distributions de particules entre deux réacteurs expérimentaux au fil du temps sont affichées et combinées avec des métadonnées qualitatives notées par le chercheur. Ce graphique montre que dans ce cas, les réacteurs avaient généralement des distributions de taille de particules similaires qui tendaient vers une diffusion moyenne et plus large plus grande au fur et à mesure que le temps progressait. Lors de l’exécution de cette procédure, il est essentiel d’enduire uniformément la plaque d’une fine couche d’agar contenant des particules uniformément réparties.
Assurez-vous de vous entraîner et de prendre votre temps. Au-delà de cette procédure, des particules intéressantes pourraient être excisées de l’agar et étudiées. En termes de données, les fichiers résultant de ce protocole sont bien définis et le ciel est la limite analytiquement.
Cette technique a ouvert la voie à de nouvelles perspectives sur les boues granulaires aérobies. Sa morphologie est très importante et elle nous a permis de la mesurer de manière standard. Les eaux usées sont biologiquement actives.
Les pratiques de niveau 1 en matière de biosécurité sont encouragées. En outre, comment l’agar peut bouillonner au-dessus quand micro-ondes et peut pulvériser des gouttelettes chaudes en ouvrant le tube de centrifugeuse.
