Les auteurs remercient William Nance (Université du Michigan) pour l&#39;aide à la formulation des protocoles de croissance du biofilm et John Battista (Fluxion, San Francisco, CA) pour obtenir des conseils concernant les questions technologiques relatives au système Bioflux. Ce travail a été soutenu par le National Institutes of Health (NIH: R21DE018820 à la procréation assistée) et de l&#39;Université du Michigan fonds de démarrage à la procréation assistée

Le protocole de collecte de salive décrit ici a été examiné par l&#39;Université de l&#39;Institutional Review Board du Michigan pour la recherche sur des sujets humains. NOTE: En ce qui concerne les examens institutionnels pour le travail sur des sujets humains de ce type, des arrangements préalables et autorisations doivent être glanés au cours de l&#39;établissement d&#39;accueil. En particulier, selon l&#39;établissement, la CISR ou d&#39;approbation d&#39;éthique pourraient avoir besoin d&#39;être recherché et approuvé avant la collecte de salive de volontaires humains peut continuer. Comme une aide à la préparation d&#39;une demande, d&#39;un algorithme utile NIH / graphique peut être trouvée ici: <a href="http://grants1.nih.gov/grants/policy/hs/PrivateInfoOrBioSpecimensDecisionChart.pdf">http://grants1.nih.gov/grants/policy/hs/PrivateInfoOrBioSpecimensDecisionChart.pdf</a> 1. Préparation du Pooled salive pour une utilisation en tant que milieu de croissance écologiquement Germane <ol><li> Recruter&gt; 5 personnes pour la salive don. Ne prenez pas de renseignements permettant d&#39;identifier, de se assurer qu&#39;aucun individuals fera un don de la salive se ils sont malades ou ont pris des antibiotiques par voie orale dans les 3 derniers mois, ou ont consommé des aliments ou liquides, à l&#39;exception de l&#39;eau, dans la 2 h précédente avant le don. </li><li> Recueillir salive dans 50 ml tubes en plastique. Mutualiser la salive recueillie dans un bécher en plastique, le garder sur la glace. Ne pas utiliser le verre comme polymères dans la salive se adhérer aux surfaces de verre internes. </li><li> Ajouter dithiothréitol (DTT) à une concentration finale de 2,5 mM d&#39;un stock 100x. (Stock est gelé dans usage unique aliquotes à -20 ° C). Agiter pendant 10 min dans un bêcher en plastique de la glace. </li><li> Afin d&#39;éliminer les particules, la centrifugeuse de salive commun pendant 30 min à 17 500 x g. </li><li> Diluer la salive avec 3 volumes de dH 2 O pour donner un quart de salive concentré. </li><li> Filtre stériliser la salive aide de 0,22 um polyéthersulfone (PES), filtre à faible liaison protéique. Utiliser un filtre avec une grande surface, ou utiliser plusieurs filtres pour petits domaines. Gardez la salive dans unrécipient en plastique sur la glace tout en filtrant. </li><li> Geler la salive commun à -80 &#160; ° C dans des tubes en plastique de 50 ml jusqu&#39;à ce que nécessaire pour développer les bactéries. Chaque tube en plastique est à usage unique et ne doit pas contenir plus de 35 ml que chaque puits microfluidique est titulaire d&#39;un maximum de 1,2 ml (1,2 ml x 24 puits = 28,8 ml) et de l&#39;espace est nécessaire dans chaque tube que la salive se dilate lors de la congélation. </li><li> Pour l&#39;utilisation, la salive commun décongeler à température ambiante. Une fois décongelé, filtre stériliser une fois de plus (0,22 um polyéthersulfone, filtre à faible liaison protéique pour enlever les précipités). </li></ol> 2. Préparation du Pooled salive pour une utilisation comme inoculum <ol><li> Recruter&gt; 5 personnes pour la salive don. Ne prenez pas de renseignements permettant d&#39;identifier, assurer qu&#39;aucun individu fera un don de la salive se ils sont malades, ont pris des antibiotiques par voie orale dans les 3 derniers mois, ou ont consommé des aliments ou liquides, à l&#39;exception de l&#39;eau, dans la 2 h précédente avant le don. Recueillir SAmples plus de 30 min. </li><li> Recueillir la salive dans des tubes en plastique de 50 ml à la température ambiante et mettre en commun la salive recueillie dans un bêcher en matière plastique à la température ambiante. </li><li> Diluer la salive groupé avec autoclave glycérol de qualité générale de réactif pour obtenir un stock avec un rapport final de 25% de glycérol, de la salive contenant des cellules de 75% [CSC]. </li><li> Congeler la salive à -80 ° C dans 3 ml à usage unique aliquotes jusqu&#39;à utilisation. </li><li> Lorsque cela est nécessaire pour inoculer le système microfluidique, des aliquotes sont décongelées à température ambiante et agité doucement sur un agitateur vortex pendant 5 secondes, avant d&#39;être introduit à la pipette dans le système microfluidique, comme décrit dans l&#39;étape 3 de ce protocole, ci-dessous. </li></ol> 3. Croissance du orales biofilms multi-espèces <ol><li> Prétraitement SCF <ol><li> Première enrober les canaux microfluidiques Bioflux avec SCF. Ajouter 100 pi de SCF à chaque sortie ainsi. Utilisation du logiciel de contrôle Bioflux, sélectionnez flux &quot;manuel&quot; et définir des canaux tha &quot;B1-B24&quot;t doivent être utilisés. </li><li> Ensuite, définissez cisaillement à 1,0 dyne / cm² et commencer flux pendant 2 min à température ambiante pour assurer une répartition homogène du CSA à travers le canal. Assurez-vous qu&#39;il est fluide dans chaque canal d&#39;entrée afin de vérifier que le SCF a coulé à travers tous les canaux uniformément. </li><li> Incuber la plaque à température ambiante pendant 20 min. </li><li> Retirer la solution / détachant SCF qui reste dans les puits de sortie et transférer dans les puits d&#39;entrée. Ce volume total de 100 ul servira à équilibrer la contre pression appliquée à l&#39;inoculum de la prise ainsi. </li></ol></li><li> Inoculation <ol><li> Pour chaque sortie ainsi, ajouter 100 pi de CCS inoculum. Placer la plaque microfluidique sur la plaque de chaleur (température réglée à 37 ° C), sélectionnez manuelle dans le logiciel de contrôle, et de régler le débit des puits de sortie dans les puits d&#39;entrée (c.-à-arrière) à 1,0 dyne / cm² pour exactement 6 sec. </li><li> Incuber la plaque microfluidique à 37 ° C pendant 40 min pour permettrepour l&#39;adhésion initiale et la croissance des bactéries dans l&#39;inoculum. </li></ol></li><li> Croissance nuit <ol><li> Pour les canaux inoculés utilisés, l&#39;inoculum aspirer des déchets de chacun des puits de sortie. Ajoutez jusqu&#39;à 1 ml de volume total de SCF dans chacun des puits d&#39;entrée (qui peut être fait sur le dessus du SCF existant). </li><li> Incuber la plaque microfluidique à 37 ° C, sélectionnez manuel et régler le programme à exécuter à 0,2 dyne / cm² pendant 20 heures. </li></ol></li><li> Stain prélavage <ol><li> Aspirer tout liquide des puits d&#39;entrée et de sortie et ajouter 100 ul de PBS (pH 7,4) à chacun des puits d&#39;entrée. Écoulement pendant 20 min à 0,2 dynes / cm². </li></ol></li><li> Outre mélange Stain <ol><li> Pour la viabilité cellulaire coloration faire 100 ul de mélange de teinture pour chaque canal à teindre. Plus précisément, ajouter 3 ul de SYTO 9 et 3 ul d&#39;iodure de propidium par ml de PBS en utilisant le kit de coloration de viabilité cellulaire commercial tels que, LIVE / DEAD. Ceci génèreun mélange de coloration contenant 10 uM SYTO 9 et 60 uM de l&#39;iodure de propidium. </li><li> Aspirer le PBS restant dans les puits d&#39;entrée, puis ajouter 100 ul du mélange de colorant de viabilité cellulaire à chaque puits d&#39;entrée. Situé à écouler à 0,2 dyne / cm 2 et exécuter la solution de l&#39;entrée à la sortie pendant 45 min à température ambiante. </li></ol></li><li> Lavage post-coloration <ol><li> Aspirer le colorant restant dans chacun des puits d&#39;entrée et ajouter 100 ul de PBS dans chaque puits d&#39;entrée. Situé à écouler à 0,2 dyne / cm² et exécuter la solution PBS de l&#39;entrée à la sortie pendant 20 min à température ambiante pour éliminer tout excès de colorant. </li></ol></li></ol> 4. Collection Image, rendu 3D, et l&#39;analyse d&#39;image <ol><li> Utiliser un confocal à balayage laser microscope inversé (CLSM) pour collecter des données d&#39;image de biofilm à partir du système microfluidique. Assurez-vous que le CLSM est capable de supporter le poids de la plaque Bioflux, qui peut atteindre 150 g. NOTE: Compte tenu de la dimensions des canaux microfluidiques, la nécessité pour la sensibilité de discerner la structure du biofilm, et les exigences pour détecter le signal de fluorescence d&#39;intensité variable, se adapter à la CLSM avec un NA objectif ou l&#39;un avec une qualité similaire optique, grossissement, et l&#39;ouverture numérique 40X 1,25. </li><li> Normaliser les portes de capture des émissions avec gain et offset mesures étant maintenues constantes. Assurez-vous que la puissance du laser ne dépasse pas 25%, car cela peut entraîner des photo-blanchiment. </li><li> Convertir des fichiers CLSM de la L EICA je Mage F type ile (FRV) pour OME (O stylo M icroscopy E nvironnement) type de fichier. Cela permet une plus grande facilité d&#39;accès et la compatibilité entre les logiciels. Utilisez un logiciel disponible dans le commerce tels que, Imaris pour convertir les fichiers de ce type. </li></ol> Rendu 3D pour Images / Figures <ol start="4"><li> Une fois converti au format OME, utiliser un logiciel disponible dans le commerce tels que Imaris pour rendre les imagesen 3D. Effectuez cette utilisant une combinaison de &quot;Easy3D» et les options «surpasser». NOTE: Attention au signal de fond et d&#39;un seuil doit être faite. La fonction de l&#39;histogramme dans Imaris peut être utilisé pour obtenir l&#39;intervalle de collecte, ce qui devrait être maintenue constante entre les images en cours d&#39;analyse. </li><li> Enregistrer des images en utilisant la fonction &quot;snapshot&quot; et de faire un examen attentif de la résolution d&#39;image avant d&#39;enregistrer les types de fichiers. </li><li> Assemblez les images en chiffres en utilisant un logiciel de retouche d&#39;image telles que CorelDraw ou Adobe Illustrator. </li></ol> Analyse d&#39;image 3D pour les graphiques et tableaux <ol start="7"><li> Utiliser librement disponibles imagej 23 et COMSTAT / COMSTAT2 38 pour l&#39;analyse d&#39;image. Télécharger les paquets du http://rsb.info.nih.gov/ij/ et http://comstat.dk/, respectivement. Demandez à la plus récente mise à jour de Java installé. NOTE: La plate-forme de logiciels JAVA devra être installé prior à l&#39;utilisation du logiciel d&#39;analyse d&#39;image. <ol><li> Utilisez le logiciel ImageJ avec COMSTAT2 plug-in pour importer les fichiers OME pour chaque image de biofilm en mode &quot;HyperStack&quot; et vue avec des «canaux split&quot;. </li><li> Analyser individuellement les deux canaux (rouge / propidium-iodure / morts être le canal 0, vert / SYTO-9 / être vivant canal 1) en utilisant la fonction «histogramme» de ImageJ. Cette fonction indique le nombre total de pixels de fichiers OME 8-bit (indiqué que &quot;count&quot;) à chaque intensité de la couleur 0 à 255 (présentée comme «valeur»), avec 0 étant pixels avec aucun signal (arrière-plan) et 255 être pixels avec complète saturation du signal. </li><li> Exporter les données dans un tableur et de normaliser toutes les valeurs de signal en pondérant chaque pixel par l&#39;intensité du signal correspondant. Ceci est réalisé en multipliant le nombre total à une intensité de signal donnée par la valeur numérique de 8 bits (0 à 255), de ladite intensité de signal. </li><li> La somme de toutes les valeurs pondérées, 0-255, pour les deux canaux pour chaque image capturée biofilm. Prendre la somme des valeurs pondérées pour les deux canaux pour déterminer le signal total pour cent par deux canaux. Pour ce faire, pour déterminer le rapport parent ou pour cent rouge et signal vert pour cent (ce est à dire le pour cent &quot;DEAD&quot; et pour cent &quot;LIVE&quot; pour chaque traitement). </li><li> Effectuer des analyses statistiques, par exemple en utilisant bilatéral test t de Student modifié pour variance inégale. Les valeurs de p &lt;0,05 sont considérées comme significatives et les valeurs de p &lt;0,01 sont considérées comme très importante. </li></ol></li></ol> 5. Les cellules récolte biofilms pour l&#39;analyse indépendante de la culture <ol start="1"><li> Retirez tous passé la salive et inutilisé entrée et de sortie du puits. Laver les puits avec 1 ml d&#39;eau distillée stérile trois fois. </li><li> Ajouter 100 ul d&#39;eau distillée stérile aux puits d&#39;entrée et, en utilisant l&#39;interface de commande du logiciel, passer lede l&#39;eau distillée stérile avant à travers les canaux à&gt; 8,0 dyne / cm 2 (débit&gt; 745 ul / h, de cisaillement de 800 sec -1) pendant au moins 5 min. Répétez dans le sens inverse pendant au moins cinq minutes, puis répéter l&#39;avant et processus d&#39;étape de lavage inverser. </li><li> Vérifier par la lumière ou par microscopie à épifluorescence (si les cellules ont été colorées / étiqueté) pour l&#39;élimination de biofilm complète (figure 2). Recueillir le 100 pi suspension cellulaire et conserver à -80 ° C pour la culture indépendante analyse. Une analyse coût-efficacité de la composition de la communauté peut être atteint grâce à l&#39;utilisation bactérienne FLX amplicon pyroséquençage d&#39;étiquette codée (bTEFAP) en utilisant l&#39;approche décrite dans Nance et al. 20 </li></ol>

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	<li>Stoodley, P., Sauer, K., Davies, D. G., Costerton, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilms+as+complex+differentiated+communities.">Biofilms as complex differentiated communities.</a> Annual review of microbiology. 56, 187-209 (2002).</li><li>Wimpenny, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+metropolis.">Microbial metropolis.</a> Advances in microbial physiology. 56, 29-84 (2009).</li><li>Jakubovics, N. S., Kolenbrander, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+road+to+ruin:+the+formation+of+disease-associated+oral+biofilms.">The road to ruin: the formation of disease-associated oral biofilms.</a> Oral diseases. 16 (8), 729-739 (2010).</li><li>Mah, T. F., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+biofilm+resistance+to+antimicrobial+agents.">Mechanisms of biofilm resistance to antimicrobial agents.</a> Trends in microbiology. 9 (1), 34-39 (2001).</li><li>Cate, J. M., Zaura, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+numerous+microbial+species+in+oral+biofilms:+how+could+antibacterial+therapy+be+effective.">The numerous microbial species in oral biofilms: how could antibacterial therapy be effective.</a> Advances in dental research. 24 (2), 108-111 (2012).</li><li>Gilbert, P., Maira-Litran, T., McBain, A. J., Rickard, A. H., Whyte, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+physiology+and+collective+recalcitrance+of+microbial+biofilm+communities.">The physiology and collective recalcitrance of microbial biofilm communities.</a> Advances in microbial physiology. 46, 202-256 (2002).</li><li>Anon, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Centers for Disease Control and Prevention (CDC): Oral health: Preventing cavities, gum disease, tooth loss, and oral cancers. , (2011).</li><li>Smith, H., Smith, H., Taylor, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Microbial behavior, 'in vivo' and 'in vitro. , 1-29 (1964).</li><li>Haffajee, A. D., Socransky, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+to+microbial+aspects+of+periodontal+biofilm+communities,+development+and+treatment.">Introduction to microbial aspects of periodontal biofilm communities, development and treatment.</a> Periodontology. 42, 7-12 (2000).</li><li>McBain, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+4:+In+vitro+biofilm+models:+an+overview.">Chapter 4: In vitro biofilm models: an overview.</a> Advances in applied microbiology. 69, 99-132 (2009).</li><li>Baehni, P. C., Takeuchi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-plaque+agents+in+the+prevention+of+biofilm-associated+oral+diseases.">Anti-plaque agents in the prevention of biofilm-associated oral diseases.</a> Oral diseases. 9 Suppl 1, 23-29 (2003).</li><li>Graves, D. T., Kang, J., Andriankaja, O., Wada, K., Rossa, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+to+study+host-bacteria+interactions+involved+in+periodontitis.">Animal models to study host-bacteria interactions involved in periodontitis.</a> Frontiers of oral biology. 15, 117-132 (2012).</li><li>Chun, J., Kim, K. Y., Lee, J. H., Choi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+analysis+of+oral+microbial+communities+of+wild-type+and+toll-like+receptor+2-deficient+mice+using+a+454+GS+FLX+Titanium+pyrosequencer.">The analysis of oral microbial communities of wild-type and toll-like receptor 2-deficient mice using a 454 GS FLX Titanium pyrosequencer.</a> BMC microbiology. 10, 101 (2010).</li><li>Diaz, P. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+of+subject-specific+oral+microflora+during+initial+colonization+of+enamel.">Molecular characterization of subject-specific oral microflora during initial colonization of enamel.</a> Applied and environmental microbiology. 72 (4), 2837-2848 (2006).</li><li>Auschill, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+two+antimicrobial+agents+on+early+in+situ+biofilm+formation.">Effect of two antimicrobial agents on early in situ biofilm formation.</a> Journal of clinical periodontology. 32 (2), 147-152 (2005).</li><li>Coenye, T., Nelis, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+and+in+vivo+model+systems+to+study+microbial+biofilm+formation.">In vitro and in vivo model systems to study microbial biofilm formation.</a> Journal of microbiological. 83 (2), 89-105 (2010).</li><li>Donlan, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+biofilms+in+antimicrobial+resistance.">Role of biofilms in antimicrobial resistance.</a> ASAIO journal. 46 (6), 47-52 (2000).</li><li>Wimpenny, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+validity+of+models.">The validity of models.</a> Advances in dental research. 11 (1), 150-159 (1997).</li><li>Umland, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo-validated+essential+genes+identified+in+Acinetobacter+baumannii+by+using+human+ascites+overlap+poorly+with+essential+genes+detected+on+laboratory+media.">In vivo-validated essential genes identified in Acinetobacter baumannii by using human ascites overlap poorly with essential genes detected on laboratory media.</a> 3 (4), (2012).</li><li>Nance, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+microfluidic+dental+plaque+biofilm+system+to+visualize+and+quantify+the+effect+of+antimicrobials.">A high-throughput microfluidic dental plaque biofilm system to visualize and quantify the effect of antimicrobials.</a> The Journal of antimicrobial chemotherapy. 68 (11), 2550-2560 (2013).</li><li>Werner, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stratified+growth+in+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms.">Stratified growth in Pseudomonas aeruginosa biofilms.</a> Applied and environmental microbiology. 70 (10), 6188-6196 (2004).</li><li>Rueden, C. T., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+approaches+for+multidimensional+biological+image+data.">Visualization approaches for multidimensional biological image data.</a> BioTechniques. 43 (1 Suppl), 33-36 (2007).</li><li>Collins, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ImageJ+for+microscopy.">ImageJ for microscopy.</a> BioTechniques. 43, 25-30 (2007).</li><li>Rao, D., Arvanitidou, E., Du-Thumm, L., Rickard, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+of+an+alcohol-free+CPC-containing+mouthwash+against+oral+multispecies+biofilms.">Efficacy of an alcohol-free CPC-containing mouthwash against oral multispecies biofilms.</a> The Journal of clinical dentistry. 22 (6), 187-194 (2011).</li><li>Rusconi, R., Garren, M., Stocker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics+expanding+the+frontiers+of+microbial+ecology.">Microfluidics expanding the frontiers of microbial ecology.</a> Annual review of biophysics. 43, 65-91 (2014).</li><li>Kim, J., Park, H. D., Chung, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+approaches+to+bacterial+biofilm+formation.">Microfluidic approaches to bacterial biofilm formation.</a> Molecules. 17 (8), 9818-9834 (2012).</li><li>Mosier, A. P., Cady, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+bacterial+surface+interactions+using+microfluidic+systems.">Analysis of bacterial surface interactions using microfluidic systems.</a> Science progress. 94 (4), 431-450 (2011).</li><li>Foster, J. S., Kolenbrander, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+multispecies+oral+bacterial+community+in+a+saliva-conditioned+flow+cell.">Development of a multispecies oral bacterial community in a saliva-conditioned flow cell.</a> Applied and environmental microbiology. 70 (7), 4340-4348 (2004).</li><li>Cuadra-Saenz, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoinducer-2+influences+interactions+amongst+pioneer+colonizing+streptococci+in+oral+biofilms.">Autoinducer-2 influences interactions amongst pioneer colonizing streptococci in oral biofilms.</a> Microbiology. 158 (7), 1783-1795 (2012).</li><li>Rickard, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoinducer+2:+a+concentration-dependent+signal+for+mutualistic+bacterial+biofilm+growth).">Autoinducer 2: a concentration-dependent signal for mutualistic bacterial biofilm growth).</a> Molecular microbiology. 60 (6), 1446-1456 (2006).</li><li>Corbin, A., Pitts, B., Parker, A., Stewart, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimicrobial+penetration+and+efficacy+in+an+in+vitro+oral+biofilm+model.">Antimicrobial penetration and efficacy in an in vitro oral biofilm model.</a> Antimicrobial agents and chemotherapy. 55 (7), 3338-3344 (2011).</li><li>Diggle, M. A., Clarke, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyrosequencing:+sequence+typing+at+the+speed+of+light.">Pyrosequencing: sequence typing at the speed of light.</a> Molecular biotechnology. 28 (2), 129-137 (2004).</li><li>Hiyari, S., Bennett, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dental+diagnostics:+molecular+analysis+of+oral+biofilms.">Dental diagnostics: molecular analysis of oral biofilms.</a> Journal of dental hygiene : JDH / American Dental Hygienists' Association. 85 (4), 256-263 (2011).</li><li>Filoche, S., Wong, L., Sissons, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+biofilms:+emerging+concepts+in+microbial+ecology.">Oral biofilms: emerging concepts in microbial ecology.</a> Journal of dental research. 89 (1), 8-18 (2010).</li><li>Xu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+ecology+in+the+age+of+genomics+and+metagenomics:+concepts,+tools,+and+recent+advances.">Microbial ecology in the age of genomics and metagenomics: concepts, tools, and recent advances.</a> Molecular ecology. 15 (7), 1713-1731 (2006).</li><li>Rogers, G. B., Carroll, M. P., Bruce, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+bacterial+infections+through+culture-independent+approaches.">Studying bacterial infections through culture-independent approaches.</a> Journal of medical microbiology. 58 (11), 1401-1418 (2009).</li><li>Socransky, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microbiota+of+the+gingival+crevice+area+of+man.+I.+Total+microscopic+and+viable+counts+and+counts+of+specific+organisms.">The microbiota of the gingival crevice area of man. I. Total microscopic and viable counts and counts of specific organisms.</a> Archives of oral biology. 8, 275-280 (1963).</li><li>Heydorn, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+biofilm+structures+by+the+novel+computer+program+COMSTAT.">Quantification of biofilm structures by the novel computer program COMSTAT.</a> Microbiology. 146 (10), 2395-2407 (2000).</li><li>Nobbs, A. H., Lamont, R. J., Jenkinson, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streptococcus+adherence+and+colonization.+Microbiology+and+molecular+biology+reviews).">Streptococcus adherence and colonization. Microbiology and molecular biology reviews).</a> MMBR. 73 (3), 407-450 (2009).</li><li>Hope, C. K., Clements, D., Wilson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+the+spatial+distribution+of+viable+and+nonviable+bacteria+in+hydrated+microcosm+dental+plaques+by+viability+profiling.">Determining the spatial distribution of viable and nonviable bacteria in hydrated microcosm dental plaques by viability profiling.</a> Journal of applied microbiology. 93 (3), 448-455 (2002).</li><li>Adams, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+laboratory+model+to+assess+the+removal+of+biofilm+from+interproximal+spaces+by+powered+tooth+brushing.">Development of a laboratory model to assess the removal of biofilm from interproximal spaces by powered tooth brushing.</a> American journal of dentistry Spec No 12B-17B. 15, 12-17 (2002).</li><li>Ledder, R. G., McBain, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vitro+comparison+of+dentifrice+formulations+in+three+distinct+oral+microbiotas.">An in vitro comparison of dentifrice formulations in three distinct oral microbiotas.</a> Archives of oral biology. 57 (2), 139-147 (2012).</li></ol>

A. H. R. and N.S.J. have received research awards from a variety of sources such as the National Institutes of Health (NIDCR), Colgate-Palmolive (Piscataway, NJ) and the Society for Applied Microbiology to fund research studies in their lab over the past five years. All other authors: none to declare.

Ce document met en évidence les méthodes les étapes de base nécessaires pour configurer et exécuter un système microfluidique de manière à permettre le développement de biofilms multi-espèces orales provenant de la salive humaine regroupées et cultivés dans stérilisée par filtration 25% mis en commun la salive humaine. Approches pour caractériser le biofilm sont donnés, mais il faut se rappeler que ces approches décrites sont modifiables et technologies supplémentaires telles que, par exemple, des tach...

<html> Les biofilms sont architecturalement communautés complexes de bactéries qui sont regroupés sur des surfaces 1. Ces communautés contiennent typiquement de nombreuses espèces qui interagissent avec une autre à l&#39;intérieur du biofilm 2. Biofilms buccaux, le plus remarquable à la vue étant la plaque dentaire, sont un problème persistant chez les humains et les résultats de leur développement incontrôlé dans la génération de taxonomique diverses communautés multi-espèces 3. Les bactéries composant de ces diverses communautés peuvent être jusqu&#39;à 1000 fois plus résistants aux antimicrobiens que leurs homologues (planctoniques) flottant librement 4-6. Défaut de traiter ces communautés des biofilms oraux, qui peuvent causer la carie dentaire et les maladies parodontales, a donné lieu à un fardeau de santé publique important: plus de 500 millions de visites au bureau de dentiste par an aux États-Unis et un d&#39;environ 108 milliards de dollars pour traiter ou prévenir parodontale les maladies et les caries dentaires 7. contenu &quot;&gt;&quot; Alors que de nombreux microbiologistes préconisent d&#39;étudier le comportement microbien dans les conditions naturelles, peu d&#39;entre eux le font. Ce est parce que leur moral pour surmonter les difficultés est constamment sapé par la facilité attractif de travailler avec des cultures de laboratoire. &quot;-Smith 8. À l&#39;heure actuelle, la recherche de biofilm orale est effectuée en utilisant une variété de in vivo et in vitro des approches, chacun avec leurs propres avantages et inconvénients 9,10. Approches in vitro utilisent souvent modèle systèmes de biofilm qui sont relativement faciles à mettre en place, mais peuvent manquer clinique / monde réel pertinence 10,11. In vivo approches reposent généralement sur ​​des systèmes de modèles animaux qui peuvent reproduire certains aspects de l&#39;environnement buccal humain, mais encore une fois souffrir de limitations dues à des différences dans l&#39;anatomie, la physiologie, de la microbiologie et de l&#39;immunologie entre animaux et humains 12, 13. Il convient de noter que les biofilms orauxpeuvent également être développés sur des surfaces d&#39;émail détenus dans un stent dans la bouche des volontaires humains, mais cette approche est actuellement relativement coûteux et main-d&#39;œuvre 14,15. En fin de compte, de nouveaux agents ou des technologies pour améliorer la santé bucco-dentaire sont testés chez l&#39;homme dans des conditions d&#39;essais cliniques contrôlés 11. À l&#39;heure actuelle, un modus operandi souvent utilisée pour identifier et évaluer de nouveaux agents de santé bucco-dentaire est d&#39;abord de réaliser des études de laboratoire pour discerner efficacité potentielle, puis de réaliser des études sur les animaux et les «essais sur le terrain» qui emploient des cliniciens pour évaluer le succès de la technologie 9, 16,17. Malheureusement, les études de laboratoire ont tendance à se appuyer sur des systèmes modèles qui occupent une grande empreinte, sont technologiquement difficile à utiliser, et contiennent souvent simplifiées communautés de l&#39;un ou tout au plus quelques espèces de tirer le potentiel signifiant 10,18 monde réel. Étant donné que les biofilms de la plaque dentaire contiennent plusieurs espèces et la forme dans un complex coule milieu salivaire, le développement de biofilms qui contiennent une ou quelques espèces dans les médias artificielle est peu probable pour générer communautés qui se comportent d&#39;une manière similaire à celles d&#39;un scénario réel 10,19. Pour faire face à l&#39;époque, le coût, les besoins de formation, et de la nature représentant pauvres de systèmes de biofilm modèle de laboratoire par rapport à l&#39;environnement dans le monde réel, nous avons récemment développé un débit élevé et germane environnement système de biofilm 20 (Figure 1). Le système bénéficie de l&#39;utilisation de la salive acellulaire groupée humaine (SCF) en commun la salive contenant des cellules bactérienne humaine à moyen et non traitée (CCS) comme inoculum. Unique, le système combine également la technologie microfluidique, un confocal à balayage laser microscope, et indépendante de la culture bactérienne diversité technologie d&#39;analyse. Ainsi, le système de modèle de l&#39;environnement est germane (salive en utilisant comme inoculum pour la croissance des biofilms multi-espèces à 37 ° C dans le filtre stérilisé coulesalive) et les biofilms buccaux contiennent des espèces (y compris Streptococcus, Neisseria, Veillonella et Porphyromonas espèces) dans l&#39;abondance représentant de ceux trouvés au début de la plaque dentaire supra 20. Lorsque l&#39;on considère que ce travail décrit l&#39;utilisation du système de modèle nouvellement développé, une attention particulière doit être accordée à la fusion d&#39;une confocal microscope à balayage laser (CLSM) microfluidique, et les technologies d&#39;analyse de la diversité de la culture indépendante. L&#39;union de ces technologies par notre groupe de recherche était intentionnelle et non seulement ajoute une capacité à haut débit pour le système modèle nouvellement développé, mais permet aussi des questions à poser qui ne pouvaient pas être facilement résolus avant avec d&#39;autres systèmes. Tout d&#39;abord, CLSM a des avantages distincts sur la microscopie classique car elle permet l&#39;analyse tridimensionnelle de biofilms. Souvent incompris, ce est extrêmement important que les biofilms sont esprit hétérogèneh qui concerne la composition des espèces et la position spatiale ainsi que les conditions physiologiques imposées à différents emplacements spatiaux dans le biofilm 6,21. De concert avec le logiciel de rendu en trois dimensions et le logiciel d&#39;analyse d&#39;image, l&#39;architecture du biofilm, les relations spatiales entre les espèces qui le composent, et l&#39;étendue de l&#39;abattage antimicrobien peut être analysée 22-24. Ces capacités ne sont pas possibles en utilisant la norme lumière transmise ou microscopie à épifluorescence. Ensuite, la microfluidique a attiré l&#39;attention notamment dans le domaine de la microbiologie car elle permet l&#39;étude des biofilms dans des conditions soigneusement contrôlées (débit, température, pH, etc.) et ne nécessite faibles volumes de liquide 25-27. Comme point de comparaison, la croissance d&#39;une biofilm orale dans la salive humaine dans un système de modèle de cellule d&#39;écoulement (un système qui est sans doute considéré comme le modèle de base pour de nombreuses études de biofilm orale) pendant 20 heures à un débit et de cisaillement similaire à celui atteintdans un système microfluidique nécessite au moins 200 ml, au lieu de 800 ul dans le dispositif microfluidique 28-31. Ainsi, un système modèle de biofilm microfluidique permet l&#39;étude de la matière de quantité limitée dans des conditions définies. Enfin, la technologie de pyroséquençage a été optimisée dans la dernière décennie d&#39;exiger que de petites quantités de matière pour effectuer une analyse de la communauté et est suffisamment polyvalent pour contrôler la profondeur de séquençage pour obtenir l&#39;identité des espèces de biofilm même rares. L&#39;utilisation de cette technologie, comme bactérienne tag codé FLX amplicon pyroséquençage (bTEFAP), a permis de questions pertinentes concernant l&#39;écologie des biofilms à aborder 32,33. Ces questions imprégnés des difficultés dans le passé, lorsque pyroséquençage ne ​​était pas disponible en raison du temps et des coûts nécessaires pour créer des bibliothèques de plasmides et les étapes technologiques et analytiques complexes nécessaires pour obtenir des données 33,34. Bien sûr, un grand avantage avec la culture indépendante apapproches, telles que pyroséquençage, ce est que les espèces de bactéries qui ne peuvent pas être cultivés en isolement au sein des milieux de laboratoire conventionnel (espèces à-dire viables mais non cultivables) peuvent être cultivées et identifiés dans le système de modèle et leur abondance relative dans la communauté quantifiés 35, 36 . Pour ajouter perspective, dès 1963, la fin de Sigmund Socransky estime qu&#39;environ 50% des bactéries isolées à partir de matériel de la crevasse gingivale humain par voie orale n&#39;a pas pu être mis en culture en utilisant des conditions de croissance de 37 laboratoire. L&#39;objectif de ce document sur les méthodes est de décrire l&#39;approche de développer biofilms multi-espèces orales dans un système microfluidique disponible dans le commerce (Bioflux) en vertu: (i) des conditions représentatives de la cavité buccale humaine et (ii) avec une composition des espèces et l&#39;abondance que est comparable à la plaque dentaire supra. En outre, en utilisant les logiciels freeware et commerciale, nous soulignons biofilm faire de basemesures d&#39;architecture peuvent être tirées des données CLSM, avec un accent sur les approches pour quantifier la biomasse biofilm, la rugosité et la viabilité (basés sur direct coloration / Dead). Enfin, les mesures nécessaires pour récolter la matière biofilm pour l&#39;analyse de la diversité en bTEFAP sont décrits.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="951">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:525px;">SUPPLIES AND EQUIPMENT</td>
			<td style="width:224px;">AVAILABLE FROM COMPANY</td>
			<td style="width:203px;">CATALOG NUMBER</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-49D</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dithiothreitol (White Crystals or Powder/Electrophoresis), Fisher BioReagents</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP172-5</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sorval ultracentrifuge&#160; (SS-34 compatible)</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td>Unit-dependent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Thermo Scientific SS-34 Rotor&#160;</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td>28-020</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Thermo Scientific Type 1 Reagent Grade Deionized Water</td>
			<td>Thermo&#160; Scientific Inc</td>
			<td>23-290-065</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nalgene Rapid-Flow Filter Units and Bottle Top Filters, PES Membrane, Sterile.</td>
			<td>VWR</td>
			<td>73520-986&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glycerol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc</td>
			<td>NC0542269</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">BioFlux microfluidic system</td>
			<td>Fluxion</td>
			<td>Bioflux 200 system</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bioflux 24-channel plate</td>
			<td>Fluxion</td>
			<td>910-0004</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PBS (Gibco)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc</td>
			<td>10010023</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">LIVE/DEAD stain (Invitrogen)&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L7012</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Confocal Laser Scanning Microscope</td>
			<td>Lecia</td>
			<td>SPE or eqivalent system</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Epifluorescence Microscope</td>
			<td>Multiple choices</td>
			<td>Multiple choices</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pyrosequencing facilities</td>
			<td>Multiple choices</td>
			<td>Multiple choices</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Decon SaniHol 70 Ethanol Solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>04-355-122</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#160;Ultra Low Temperature Freezer -80&#176;C</td>
			<td>Multiple choices</td>
			<td>Multiple choices</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tips (20, 200, and 1000uL)</td>
			<td>Multiple choices</td>
			<td>Multiple choices</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Single Channel Variable Volume Pipettors (20, 200, 1000uL)</td>
			<td>Multiple choices</td>
			<td>Multiple choices</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SOFTWARE</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bioflux dedicated software</td>
			<td>Bioflux</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Imaris</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Leica SPE</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ImageJ</td>
			<td>Freeware (http://imagej.nih.gov/ij/)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">COMSTAT/COMSTAT 2</td>
			<td colspan="2">Freeware (http://www.comstat.dk/)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of a high-throughput in vitro microfluidic system to develop oral multi-species biofilms

Il ya peu à haut débit dans des systèmes in vitro qui facilitent le développement de biofilms multi-espèces qui contiennent de nombreuses espèces souvent détectés dans les biofilms buccaux in vivo. En outre, un système qui utilise la salive humaine naturelle comme source nutritif, au lieu d&#39;un milieu artificiel, est particulièrement souhaitable afin de soutenir l&#39;expression des propriétés cellulaires et spécifiques à biofilm qui imitent les communautés in vivo. Nous décrivons une méthode pour le développement de multiples espèces de biofilms oraux qui sont comparables, par rapport à la composition spécifique, de la plaque dentaire supragingival, dans des conditions semblables à la cavité buccale humaine. Plus précisément, cet article de méthodes décrira comment un système microfluidique disponible dans le commerce peut être adaptée pour faciliter le développement de multi-espèces provenant de biofilms buccaux et cultivé au sein de la salive commun. En outre, une description de la façon dont le système peut être utilisé en conjonction avec un confocal laser microscope à balayage pour générer 3-D reconstructions du biofilm pour analyses architecturales et de viabilité sera présenté. Compte tenu de la grande diversité des micro-organismes qui se développent au sein des biofilms dans le système microfluidique (y compris Streptococcus, Neisseria, Veillonella, Gemella et Porphyromonas), un protocole sera également présenté décrivant comment récolter les cellules du biofilm pour plus sous-culture ou l&#39;extraction d&#39;ADN et d&#39;analyse. Les limites à la fois le système de biofilm microfluidique et les analyses de données actuelles sur l&#39;état de l&#39;art seront abordés. En fin de compte, il est prévu que cet article va fournir une technique de référence qui permettra d&#39;améliorer l&#39;étude des biofilms buccaux et d&#39;aider dans le développement de technologies supplémentaires qui peuvent être intégrés à la plate-forme microfluidique.

Rendu 3D des biofilms Les résultats représentatifs sont présentés dans la figure 3. Un outil utile dans les logiciels de Imaris est l&#39;option à examiner chaque tranche de la pile de biofilm recueillies et de les combiner pour créer des reconstructions tridimensionnelles. En outre, les effets d&#39;ombrage artificiels peuvent être ajoutés pour aider à interpréter visuellement des structures tridimensionnelles. Les biofilms rendus peuvent...

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Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms

Le but de ce document sur les méthodes est de décrire l&#39;utilisation d&#39;un système microfluidique pour le développement de biofilms multi-espèces qui contiennent généralement des espèces identifiées dans la plaque dentaire supra-gingival humain. Méthodes pour décrire l&#39;architecture du biofilm, biofilm viabilité, et une approche de la récolte biofilm pour les analyses de culture-dépendante ou indépendante de la culture sont mis en évidence.

Utilisation d&#39;un haut-débit<em&gt; In Vitro</em&gt; Système microfluidique pour développer orales biofilms multi-espèces

There are few high-throughput in vitro systems which facilitate the development of multi-species biofilms that contain numerous species commonly detected ...

use-high-throughput-vitro-microfluidic-system-to-develop-oral-multi

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms

13.4K vues.  The University of Michigan.  Le but de ce document sur les méthodes est de décrire l'utilisation d'un système microfluidique pour le développement de biofilms multi-espèces qui contiennent généralement des espèces identifiées dans la plaque dentaire supra-gingival humain. Méthodes pour décrire l'architecture du biofilm, biofilm viabilité, et une approche de la récolte biofilm pour les analyses de culture-dépendante ou indépendante de la culture sont mis en évidence. 

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Microfluidic Device for Recreating a Tumor Microenvironment in Vitro

We have developed a microfluidic device that mimics the delivery and systemic clearance of drugs to heterogeneous three-dimensional tumor tissues in vitro. Nutrients delivered by vasculature fail to reach all parts of tumors, giving rise to heterogeneous microenvironments consisting of viable, quiescent and necrotic cell types. Many cancer drugs fail to effectively penetrate and treat all types of cells because of this heterogeneity. Monolayers of cancer cells do not mimic this heterogeneity, making it difficult to test cancer drugs with a suitable in vitro model. Our microfluidic devices were fabricated out of PDMS using soft lithography. Multicellular tumor spheroids, formed by the hanging drop method, were inserted and constrained into rectangular chambers on the device and maintained with continuous medium perfusion on one side. The rectangular shape of chambers on the device created linear gradients within tissue. Fluorescent stains were used to quantify the variability in apoptosis within tissue. Tumors on the device were treated with the fluorescent chemotherapeutic drug doxorubicin, time-lapse microscopy was used to monitor its diffusion into tissue, and the effective diffusion coefficient was estimated. The hanging drop method allowed quick formation of uniform spheroids from several cancer cell lines. The device enabled growth of spheroids for up to 3 days. Cells in proximity of flowing medium were minimally apoptotic and those far from the channel were more apoptotic, thereby accurately mimicking regions in tumors adjacent to blood vessels. The estimated value of the doxorubicin diffusion coefficient agreed with a previously reported value in human breast cancer. Because the penetration and retention of drugs in solid tumors affects their efficacy, we believe that this device is an important tool in understanding the behavior of drugs, and developing new cancer therapeutics.

Microfluidic Device for Recreating a Tumor Microenvironment in Vitro

We present the procedure for fabrication and operation of a microfluidic device that recreates heterogeneous tumor microenvironments in vitro. The variability in apoptosis within tumor tissue was quantified using fluorescent stains and the effective diffusion coefficient of the chemotherapeutic drug doxorubicin into tumor tissue was evaluated.

Dispositif microfluidique pour Recréer un microenvironnement des tumeurs<em&gt; In vitro</em

We have developed a microfluidic device that mimics the delivery and systemic clearance of drugs to heterogeneous three-dimensional tumor tissues in ...

Recherche

Bio-ingénierie

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and high-fidelity measurements of large systems. Microfluidics promises to fulfill many of these requirements, such as performing high-throughput screening experiments on-chip, encompassing biochemical, biophysical, and cell-based assays1. Since the early days of microfluidics devices, this field has drastically evolved, leading to the development of microfluidic large-scale integration2,3. This technology allows for the integration of thousands of micromechanical valves on a single device with a postage-sized footprint (Figure 1). We have developed a high-throughput microfluidic platform for generating in vitro expression of protein arrays (Figure 2) named PING (Protein Interaction Network Generator). These arrays can serve as a template for many experiments such as protein-protein 4, protein-RNA5 or protein-DNA6 interactions.
The device consist of thousands of reaction chambers, which are individually programmed using a microarrayer. Aligning of these printed microarrays to microfluidics devices programs each chamber with a single spot eliminating potential contamination or cross-reactivity Moreover, generating microarrays using standard microarray spotting techniques is also very modular, allowing for the arraying of proteins7, DNA8, small molecules, and even colloidal suspensions. The potential impact of microfluidics on biological sciences is significant. A number of microfluidics based assays have already provided novel insights into the structure and function of biological systems, and the field of microfluidics will continue to impact biology.

We present a microfluidic approach for the expression of protein arrays. The device consists of thousands of reaction chambers controlled by micro-mechanical valves. The microfluidic device is mated to a microarray-printed gene library. These genes are then transcribed and translated on-chip, resulting in a protein array ready for experimental use.

À haut débit Générateur expression des protéines utilisant une plate-forme microfluidique

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

High Throughput Microfluidic Rapid and Low Cost Prototyping Packaging Methods

In this work, 3 different packaging and assembly techniques are presented. They can be classified into two categories: one-time use and reusable packaging techniques.
The one-time use packaging technique employs UV-based and temperature curing epoxies to connect microtubes to access holes, wire-bonding for integrated circuit connections, and silver epoxy for electrical connections. This method is based on a robust assembly technique that can support relatively high pressure close to 1 psi and does not need any support to strengthen the microfluidic architecture.
Reusable packaging techniques consist of PDMS-based microtube interconnectors and anisotropic adhesive films for electrical connections. These devices are more sensitive and fragile. Consequently, Plexiglas support is added to the microfluidic structure to improve the electrical contact when anisotropic adhesive films are used, and also to strengthen the microfluidic architecture. In addition, a micromanipulator is needed to maintain tubes while using a thin PDMS layer to connect them to the access holes. Different PDMS layer thicknesses, ranging from 0.45-3 mm, are tested to compare the best adherence versus injection rates. Applied injection rates are varied from 50-300 &#956;l/hr for 0.45-3 mm PDMS layers, respectively. These techniques are mainly applicable for low-pressure applications. However, they can be extended for high-pressure ones through plasma-oxygen process to permanently seal the PDMS to glass substrates. The main advantage of this technique, besides the fact that it is reusable, consists of keeping the device observable when the microchannel length is very short (in the range of 3 mm or lower).

In this article we describe different techniques for microfluidic rapid prototyping platforms. The proposed techniques are based on ultraviolet (UV) sensitive and temperature curing epoxies, polydimethylsiloxane (PDMS) based tubing, wire-bonding, and anisotropic adhesive films. The assembling procedures presented are developed for both one-time use devices as well as reusable microfluidic systems.

In this work, 3 different packaging and assembly techniques are presented. They can be classified into two categories: one-time use and reusable packaging ...

Systematic Analysis of In Vitro Cell Rolling Using a Multi-well Plate Microfluidic System

A major challenge for cell-based therapy is the inability to systemically target a large quantity of viable cells with high efficiency to tissues of interest following intravenous or intraarterial infusion. Consequently, increasing cell homing is currently studied as a strategy to improve cell therapy. Cell rolling on the vascular endothelium is an important step in the process of cell homing and can be probed in-vitro using a parallel plate flow chamber (PPFC). However, this is an extremely tedious, low throughput assay, with poorly controlled flow conditions. Instead, we used a multi-well plate microfluidic system that enables study of cellular rolling properties in a higher throughput under precisely controlled, physiologically relevant shear flow1,2. In this paper, we show how the rolling properties of HL-60 (human promyelocytic leukemia) cells on P- and E-selectin-coated surfaces as well as on cell monolayer-coated surfaces can be readily examined. To better simulate inflammatory conditions, the microfluidic channel surface was coated with endothelial cells (ECs), which were then activated with tumor necrosis factor-&#945; (TNF-&#945;), significantly increasing interactions with HL-60 cells under dynamic conditions. The enhanced throughput and integrated multi-parameter software analysis platform, that permits rapid analysis of parameters such as rolling velocities and rolling path, are important advantages for assessing cell rolling properties in-vitro. Allowing rapid and accurate analysis of engineering approaches designed to impact cell rolling and homing, this platform may help advance exogenous cell-based therapy.

Systematic Analysis of In Vitro Cell Rolling Using a Multi-well Plate Microfluidic System

This study used a multi-well plate microfluidic system, significantly increasing throughput of cell rolling studies under physiologically relevant shear flow. Given the importance of cell rolling in the multi-step cell homing cascade and the importance of cell homing following systemic delivery of exogenous populations of cells in patients, this system offers potential as a screening platform to improve cell-based therapy.

Analyse systématique des<em&gt; In Vitro</em&gt; Cellule de roulement en utilisant un système microfluidique plaque multi-puits

A major challenge for cell-based therapy is the inability to systemically target a large quantity of viable cells with high efficiency to tissues of ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and accurate assessment of ocular toxicity in man are needed. To address this need, we have developed an eye irritation test (EIT) which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model that is based on normal human cells. The EIT is able to separate ocular&#160;irritants and corrosives (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category). The test utilizes two separate protocols, one designed for liquid chemicals and a second, similar protocol for solid test articles. The EIT prediction model uses a single exposure period (30 min for liquids, 6 hr for solids) and a single tissue viability cut-off (60.0% as determined by the MTT assay). Based on the results for 83 chemicals (44 liquids and 39 solids) EIT achieved 95.5/68.2/ and 81.8% sensitivity/specificity and accuracy (SS&#38;A) for liquids, 100.0/68.4/ and 84.6% SS&#38;A for solids, and 97.6/68.3/ and 83.1% for overall SS&#38;A. The EIT will contribute significantly to classifying the ocular irritation potential of a wide range of liquid and solid chemicals without the use of animals to meet regulatory testing requirements. The EpiOcular EIT method was implemented in 2015 into the OECD Test Guidelines as TG 492.

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

We have developed an eye irritation test which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model. The test is able to discriminate between ocular irritant and corrosive materials (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category).

Irritation des yeux Test (IET) pour l&#39;identification des dangers des produits chimiques irritants oculaires utilisant épithélial (RHCE) Tissue modèle reconstruit humain Cornea-like

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet high-throughput, method to perform single-cell culture experiments. Here, we report a microfluidic chip-based strategy for high-efficiency single-cell isolation (~77%) and demonstrate its capability of performing long-term single-cell culture (up to 7 d) and cellular heterogeneity analysis using clonogenic assay. These applications were demonstrated with KT98 mouse neural stem cells, and A549 and MDA-MB-435 human cancer cells. High single-cell isolation efficiency and long-term culture capability are achieved by using different sizes of microwells on the top and bottom of the microfluidic channel. The small microwell array is designed for precisely isolating single-cells, and the large microwell array is used for single-cell clonal culture in the microfluidic chip. This microfluidic platform constitutes an attractive approach for single-cell culture applications, due to its flexibility of adjustable cell culture spaces for different culture strategies, without decreasing isolation efficiency.

Here, we present a protocol for isolating and culturing single cells with a microfluidic platform, which utilizes a new microwell design concept to allow for high-efficiency single cell isolation and long-term clonal culture.

Une plate-forme microfluidique pour l&#39;isolement à haut débit unique cellule et Culture

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

Optimizing the Use of a Liquid Handling Robot to Conduct a High Throughput Forward Chemical Genetics Screen of Arabidopsis thaliana

Chemical genetics is increasingly being employed to decode traits in plants that may be recalcitrant to traditional genetics due to gene redundancy or lethality. However, the probability of a synthetic small molecule being bioactive is low; therefore, thousands of molecules must be tested in order to find those of interest. Liquid handling robotics systems are designed to handle large numbers of samples, increasing the speed with which a chemical library can be screened in addition to minimizing/standardizing error. To achieve a high-throughput forward chemical genetics screen of a library of 50,000 small molecules on Arabidopsis thaliana (Arabidopsis), protocols using a bench-top multichannel liquid handling robot were developed that require minimal technician involvement. With these protocols, 3,271 small molecules were discovered that caused visible phenotypic alterations. 1,563 compounds induced short roots, 1,148 compounds altered coloration, 383 compounds caused root hair and other, non-categorized, alterations, and 177 compounds inhibited germination.

Optimizing the Use of a Liquid Handling Robot to Conduct a High Throughput Forward Chemical Genetics Screen of Arabidopsis thaliana

A high throughput screen of synthetic small molecules was conducted on the model plant species, Arabidopsis thaliana. This protocol, developed for a liquid handling robot, increases the speed of forward chemical genetics screens, accelerating the discovery of novel small molecules affecting plant physiology.

Optimisation de l’utilisation d’un Robot de manutention liquide pour mener un haut débit avant chimique génétique écran d’Arabidopsis thaliana

Chemical genetics is increasingly being employed to decode traits in plants that may be recalcitrant to traditional genetics due to gene redundancy or ...

Use of High-Throughput Automated Microbioreactor System for Production of Model IgG1 in CHO Cells

Automated microscale bioreactors (15 mL) can be a useful tool for cell culture engineers. They facilitate the simultaneous execution of a wide variety of experimental conditions while minimizing potential process variability. Applications of this approach include: clone screening, temperature and pH shifts,&#160;media and supplement optimization. Furthermore, the small reactor volumes are conducive to large Design of Experiments that investigate a wide range of conditions. This allows upstream processes to be significantly optimized before scale-up where experimentation is more limited in scope due to time and economic constraints. Automated microscale bioreactor systems offer various advantages over traditional small scale cell culture units, such as shake flasks or spinner flasks. However, during pilot scale process development&#160;significant care must be taken to ensure that these advantages are realized. When run with care, the system can enable high level automation, can be programmed to run DOE&#39;s with a higher number of variables&#160;and can reduce sampling time when integrated with a nutrient analyzer or cell counter. Integration of the expert-derived heuristics presented here, with current automated microscale bioreactor experiments can minimize common pitfalls that hinder meaningful results. In the extreme, failure to adhere to the principles laid out here can lead to equipment damage that requires expensive repairs. Furthermore, the microbioreactor systems have small culture volumes&#160;making characterization of cell culture conditions difficult. The number and amount of samples taken in-process in batch mode culture is limited as operating volumes cannot fall below 10 mL. This method will discuss the benefits and drawbacks of microscale bioreactor systems.

A detailed protocol for the concurrent operation of 48 parallel cell cultures under varied conditions in a microbioreactor system is presented. Cell culture process, harvest and subsequent antibody titer analysis are described.

Utilisation du haut débit MICROBIOREACTEUR système automatisé pour la Production d’IgG1 de modèle dans les cellules CHO

Automated microscale bioreactors (15 mL) can be a useful tool for cell culture engineers. They facilitate the simultaneous execution of a wide variety of ...

High-Throughput Identification of Resistance to Pseudomonas syringae pv. Tomato in Tomato using Seedling Flood Assay

Tomato is an agronomically important crop that can be infected by Pseudomonas syringae, a Gram-negative bacterium, resulting in bacterial speck disease. The tomato-P. syringae pv. tomato pathosystem is widely used to dissect the genetic basis of plant innate responses and disease resistance. While disease was successfully managed for many decades through the introduction of the Pto/Prf gene cluster from Solanum pimpinellifolium into cultivated tomato, race 1 strains of P. syringae have evolved to overcome resistance conferred by the Pto/Prf gene cluster and occur worldwide.
Wild tomato species are important reservoirs of natural diversity in pathogen recognition, because they evolved in diverse environments with different pathogen pressures. In typical screens for disease resistance in wild tomato, adult plants are used, which can limit the number of plants that can be screened due to their extended growth time and greater growth space requirements. We developed a method to screen 10-day-old tomato seedlings for resistance, which minimizes plant growth time and growth chamber space, allows a rapid turnover of plants, and allows large sample sizes to be tested. Seedling outcomes of survival or death can be treated as discrete phenotypes or on a resistance scale defined by amount of new growth in surviving seedlings after flooding. This method has been optimized to screen 10-day-old tomato seedlings for resistance to two P. syringae strains and can easily be adapted to other P. syringae strains.

High-Throughput Identification of Resistance to Pseudomonas syringae pv. Tomato in Tomato using Seedling Flood Assay

The seedling flood assay facilitates rapid screening of wild tomato accessions for the resistance to the Pseudomonas syringae bacterium. This assay, used in conjunction with the seedling bacterial growth assay, can assist in further characterizing the underlying resistance to the bacterium, and can be used to screen mapping populations to determine the genetic basis of resistance.

Identification à haut débit de la résistance aux seringues Pseudomonas pv. Tomate dans la tomate à l’aide de semis Flood Assay

Tomato is an agronomically important crop that can be infected by Pseudomonas syringae, a Gram-negative bacterium, resulting in bacterial speck disease. ...

Generation of Dynamical Environmental Conditions using a High-Throughput Microfluidic Device

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and organs are either highly expensive, like robotics, or lack nanoliter volume and millisecond time accuracy in liquid manipulation. We herein present the design and fabrication of a microfluidic system, which consists of 1,500 culture units, an array of enhanced peristaltic pumps and an on-site mixing modulus. To demonstrate the capacities of the microfluidic device, neural stem cell (NSC) spheres are maintained in the proposed system. We observed that when the NSC sphere is exposed to CXCL in day 1 and EGF in day 2, the round-shaped conformation is well maintained. Variation in the input order of 6 drugs causes morphological changes to the NSC sphere and the expression level representative marker for NSC stemness (i.e., Hes5 and Dcx). These results indicate that dynamic and complex environmental conditions have great effects on NSC differentiation and self-renewal, and the proposed microfluidic device is a suitable platform for high throughput studies on the complex life machinery.

We present a microfluidic system for high throughput studies on complex life machinery, which consists of 1500 culture units, an array of enhanced peristaltic pumps and an on-site mixing modulus. The microfluidic chip allows for the analysis of the highly complex and dynamic micro-environmental conditions in vivo.

Génération de conditions environnementales dynamiques à l’aide d’un dispositif microfluidique à haut débit

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and ...