L’objectif global de cette procédure est de présenter une approche expérimentale optimisée pour isoler les tissus embryonnaires des embryons de caille et de poulet. Avec cette technique, nous obtenons des tissus embryonnaires purs qui peuvent être utilisés dans les études d’expression génétique et les analyses fonctionnelles. Les tissus des embryons de caille et de poulet sont isolés par microchirurgie et sujets à une digestion enzymatique in vitro tout en préservant ses propriétés biologiques.
Après isolement, les tissus préservés tridimensionnels peuvent être utilisés pour l’analyse des modèles d’expression topographique à haute résolution des gènes. Cette approche est particulièrement utile pour détailler l’expression in situ des gènes dans les territoires embryonnaires autrement inaccessibles par les méthodes conventionnelles. En outre, les approches d’analyse transcriptome peuvent également être appliquées dans les tissus isolés sans nécessiter de marqueurs génétiques, tout en fournissant une analyse omique à haut débit spécifique aux tissus.
Alternativement, les tissus isolés des deux espèces peuvent être associés dans un essai organotypique in vitro pendant 48 heures. Cette approche permet d’étudier les interactions tissulaires, puisque les cellules de caille et de poulet peuvent être discriminées par des caractéristiques nucléaires distinctes et des marqueurs moléculaires. La capacité des tissus de culture à former des organes peut être encore testée par assay ovo.
Cette méthode est donc un outil utile pour étudier les interactions tissulaires complexes dans les processus de développement avec des modifications spaciales très dynamiques et peut également aider à révéler le potentiel de territoires embryonnaires spécifiques à la formation d’organes. À titre d’exemple, on décrit ci-après la formation du thymus chimérique caille-poulet à partir de tissus embryonnaires isolés. Tout d’abord, l’endoderm des troisième et quatrième poches pharyngéales, le rudiment thymique potentiel est isolé de la région pharyngéale des embryons de caille avec trois jours de développement.
Ensuite, ce tissu est associé à un mésenchyme capable de soutenir son développement, le mésoderm somatopleura. Enfin, l’association hétérospécifique des tissus est cultivé in vitro et in ovo pour former un thymus chimérique. Effectuez toutes les procédures de manipulation des œufs dans des conditions stériles à l’aide d’une hotte d’écoulement laminaire horizontale et d’instruments et de matériaux stérilisés.
Des oeufs fertilisés de caille ont été incubés avec la chambre d’air faisant face vers le haut. Pour commencer, retirer les œufs de caille de l’incubateur. Préparer un grand bol en verre borosilicate rempli de PBS froid.
À l’aide de ciseaux incurvés, appuyez sur et coupez un trou circulaire dans la coquille d’un œuf de caille avec trois jours d’incubation. Faire le trou dans le côté opposé de l’œuf émoussé, et transférer le jaune dans le bol avec pbs froid. Retirer l’embryon du jaune en coupant la membrane vitelline à l’extérieur aux vaisseaux extraembryoniques.
À l’aide de forceps minces, transférer l’embryon dans un petit bol rempli de PBS froid, puis déplacer l’embryon dans une boîte de Pétri à base noire avec un écumoire. Enlevez la région pharyngéale contenant les troisième et quatrième sachets pharyngéels comme décrit dans la ligature précédente de SPA de Jove. Ensuite, transférez la troisième et quatrième région de l’arc pharyngeal dans un verre rempli de pancréatine froide et incubez pendant une heure, sur la glace, pour une digestion enzymatique.
Notez que la période d’incubation de la digestion enzymatique dépend du stade de développement. Placez le plat en verre sous le microscope stéréo et isolez l’endoderm de la troisième et quatrième région de l’arc pharyngeal, à l’aide de deux micro-scalpel dans un support. Placez d’abord la région pharyngéale avec le côté dorsal vers le haut, montrant intérieurement l’endoderm et l’ectoderm dans la surface externe.
Observez l’ectoderm, l’endoderm, le mésenchyme, le tube cardiaque et la partie ventrale du tube neural. Retirez le tube neural et le mésoderm fixé à la surface dorsale de l’endoderm pharyngéal. Observez l’endoderm du pharynx, les quatrième et troisième poches pharyngéales, et le tube cardiaque.
Avec le côté dorsal vers le haut, détachez soigneusement et enlevez le mesenchyme entre les arcs pharyngeal et exposez les poches pharyngeal. Effectuez cette procédure de l’autre côté de la région pharyngéale. Retirez le mesenchyme attaché à la partie la plus postérieure de l’endoderm et observez la quatrième poche pharyngéale.
Avec le côté postérieur vers le haut, observez les poches pharyngeal de quatrième gauche et droite. Continuer en enlevant le mésenchyme attaché à la partie la plus postérieure de l’endoderm et à la deuxième poche. Retirer le tube cardiaque et le mesenchyme entourant les poches intérieures.
Avec le côté ventral vers le haut, observez l’endoderm de pharynx, et le côté droit du deuxième arc pharyngeal. À ce stade, l’endoderm du rudiment thyroïdien doit être visible. Détachez l’ectoderme des deuxième et troisième arcs pharyngéels et retirez soigneusement le mésenchyme des arcs.
Observez l’enlèvement du mesenchyme du deuxième arc pharyngeal sur le côté droit. Notez l’emplacement des quatrième et troisième poches et rudiment thyroïdien. Enlever les restes aux cellules mésenchymales attachées aux poches pharyngéales.
Observez les troisième et quatrième pochettes du côté droit et la quatrième poche du côté gauche. Répétez le détachement mesenchyme du côté gauche. Observez maintenant la troisième poche du côté gauche.
Observez le détachement mesenchyme de la deuxième arche sur le côté gauche. Notez que toutes les surfaces et solutions doivent être maintenues au froid pendant cette procédure. Passer à une nouvelle solution de pancréatine froide et plat en cas de prendre beaucoup de temps pour disséquer les tissus.
Enfin, faire une coupe transversale entre la deuxième et la troisième poches pharyngéales pour enlever les deuxièmes poches et le rudiment thyroïdien. À ce stade, l’endoderm isolé est composé des troisième et quatrième poches pharyngéales et de la pointe postérieure du pharynx. Retirer les restes détachés mesenchyme à l’aide de deux micro-scalpels.
Transférer l’endoderme isolé dans un plat en verre rempli de sérum bovin fœtal froid et le garder sur la glace pendant la préparation de l’essai in vitro. Les oeufs ont été placés en position horizontale et le côté supérieur marqué pour l’utilisation d’un charbon de bois. Pour commencer, retirer les œufs de l’incubateur.
À l’aide d’un ciseaux incurvé, ouvrir un petit trou dans la coquille, insérer une aiguille et aspirer deux millilitres d’albumine à l’aide d’une seringue de 10 millilitres. Ouvrez un trou circulaire dans la région marquée de la coquille et coupez la membrane vitelline à l’extérieur aux vaisseaux embryonnaires supplémentaires tout en tenant l’embryon avec de minces forceps. Au microscope stéréo, placer l’embryon dans une boîte de Pétri avec une base noire contenant du PBS froid.
Utilisez quatre broches à insectes pour maintenir l’embryon au fond de la plaque. Placez les broches dans la région extraembryonique formant une forme carrée. Effectuer deux coupures entre les somites 19 et 24 transversalement à l’axe embryonnaire et traverser l’embryon.
Relâchez cette section en coupant les bords embryonnaires marginaux. Observez la plaque latérale, le tube neural et les somites. Aspirer et transférer les tissus dans un plat en verre rempli de pancréatine froide.
Incuber pendant 30 minutes sur la glace pour une digestion enzymatique. Sous le microscope stéréo, isoler le mésoderm des tissus environnants à l’aide de deux micro-scalpels chez les détenteurs. Observez le mesoderm somatopleura, le splanchnopleura, le tube neural et l’ectoderm.
Tout d’abord, retirez l’ectoderm à la surface. Observez le mesoderm somatopleura dissocié de l’ectoderme. Puis, détachez soigneusement le splanchnopleura ventrally situé de la somatopleura.
Observez le mésoderm latéral droit de la somatopleura. Relâchez-le en le coupant dans un mouvement parallèle au tube neural. Notez que toutes les surfaces et solutions doivent être maintenues au froid pendant cette procédure.
Passer à une nouvelle solution de pancréatine froide et plat en cas de prendre beaucoup de temps pour disséquer les tissus. Observez le mésoderm latéral gauche du somatopleura, des somites, du tube neural et de l’ectoderm. Répétez la libération mesoderm de ce côté.
Faites des mouvements lents avec le micro-scalpel. Les protéines de matrice extracellulaires exposées se trouvent à travers les tissus et les instruments, empêchant les mouvements des fluides. Couper délicatement le somatopleura en mouvement parallèle au tube neural.
Transférer le mésoderm isolé dans un plat en verre rempli de sérum bovin fœtal froid et le garder sur la glace pendant la préparation de l’analyse in vitro. Placer une grille en métal fine dans une boîte de Pétri et remplir de milieu de culture. Retirer les liquides excessifs pour niveler la surface moyenne avec le dessus de la grille.
À l’aide de forceps minces, trempez un filtre membranaire dans le milieu de culture et placez-le soigneusement sur le dessus de la grille pour avoir une surface en contact avec elle. Sous le microscope stéréo, transférer l’endoderm isolé du plat en verre au filtre membranaire en glissant doucement à l’aide de spatules et de forceps minces. Répétez cette procédure pour le mésoderm isolé.
À l’aide d’un micro-scalpel, mélanger les tissus pour maximiser son association. Placez soigneusement les tissus associés dans un incubateur humidifié à 37 degrés avec 5% de CO2 pendant 48 heures. Après la période d’incubation, greffer les tissus de culture sur la membrane de type coriolan et lui permettre de se développer en ovale pendant encore 10 jours pour compléter la formation d’organes comme décrit précédemment.
Voici la méthode réticulaire qui permet d’utiliser l’isolement des tissus embryonnaires aviaires dans des approches expérimentales distinctes. À titre d’exemple, l’expression de gènes connus pour être impliqués dans la formation des poches pharyngéales a également été évaluée un endoderm isolé contenant les deuxième, troisième et quatrième sachets pharyngéels des embryons de poulet au troisième jour embryonnaire et demi par hybridation in situ de montage entier. L’expression de Sonic Hedgehog a été détectée dans l’endoderm du pharynx central et exclue des sachets, tandis que BMP7 a été exprimée dans l’endoderm des deuxième et troisième poches pharyngéales et exclue du pharynx central et de la quatrième poche pharyngéale.
Les tissus isolés peuvent également être associés in vitro pendant 48 heures, greffer sur la membrane de type coriolan, et laisser se développer pendant encore 10 jours. Les explantations peuvent être analysées par histologie conventionnelle et immunohistochimie. Quelques résultats représentatifs de l’association de l’endoderm de caille des troisième et quatrième sachets pharyngeal avec le mesoderm de somatopleura de poulet sont les suivants-Greffes ont montré un thymus chimérique entièrement formé avec des cellules épithéliales thymiques dérivées de caille positives pour QCPN et cellules lymphoïdes de poulet.
En outre, l’épithélium thymique positif de cytokeratin a montré des dispositifs morphologiques normaux, affichant une architecture réticulaire typique. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’isoler les tissus embryonnaires de caille et de poulet qui peuvent être utilisés dans les études d’expression génétique et en formant des organes chimériques peuvent également aider à déchiffrer la complexité de la génétique des organes.
