الهدف العام لهذا الإجراء هو تقديم نهج تجريبي أفضل لعزل الأنسجة الجنينية من السمان وأجنة الدجاج. مع هذه التقنية، نحصل على الأنسجة الجنينية النقية التي يمكن استخدامها في دراسات التعبير الجيني والتشايس الوظيفي. يتم عزل الأنسجة من السمان وأجنة الدجاج عن طريق الجراحة الدقيقة وتخضع لعملية الهضم الانزيمية في المختبر مع الحفاظ على خصائصها البيولوجية.
بعد العزل، يمكن استخدام الأنسجة المحفوظة ثلاثية الأبعاد لتحليل أنماط التعبير الجيني الطبوغرافي عالية الدقة. وهذا النهج مفيد بصفة خاصة في تفصيل التعبير الجيني في الموقع في الأراضي الجنينية، وإلا فإن الطرق التقليدية لا يمكن الوصول إليها. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أيضا تطبيق نُهج تحليل النسخ في الأنسجة المعزولة دون الحاجة إلى علامات جينية، مع توفير تحليل عام عالي الإنتاجية خاص بالنسج.
بدلا من ذلك، يمكن أن ترتبط الأنسجة المعزولة من كلا النوعين في فحص organotypic في المختبر لمدة 48 ساعة. ويسمح هذا النهج بدراسة تفاعلات الأنسجة، حيث يمكن التمييز بين خلايا السمان والدجاج من خلال ميزات نووية مميزة وعلامات جزيئية. القدرة من الثقافة الأنسجة لتشكيل أعضاء يمكن اختبارها كذلك من قبل في اختبار ovo.
ولذلك فإن هذه الطريقة هي أداة مفيدة لدراسة تفاعلات الأنسجة المعقدة في العمليات التنموية مع تعديلات ديناميكية للغاية يمكن أن تساعد أيضًا على الكشف عن إمكانات مناطق جنينية محددة لتشكيل الأعضاء. كمثال، في هذه الوثيقة يوصف تشكيل السمان-الدجاج thymus chimeric من الأنسجة الجنينية المعزولة. أولا ، إندديرم من الحقائب البلعوم الثالث والرابع ، يتم عزل rudiment الزعتر المحتملين من المنطقة البلعوم من أجنة السمان مع ثلاثة أيام من التطور.
ثم, ويرتبط هذا النسيج مع mesenchyme قادرة على دعم تطورها, وssoderm somatopleura. وأخيرا، يتم استزراع الرابطة غير المحددة للأنسجة في المختبر وفي الأوفو لتشكيل الغدة الصعترية الشيمية. تنفيذ جميع إجراءات التلاعب البيض في ظروف معقمة باستخدام غطاء تدفق الفارني الأفقي والأجهزة والمواد المعقمة.
تم احتضان بيض السمان المخصب مع غرفة الهواء التي تواجه ما يصل. للبدء، وإزالة بيض السمان من الحاضنة. إعداد وعاء زجاجي بوروسيليكات كبيرة مليئة PBS الباردة.
مع مقص منحني، اضغط وقطع حفرة دائرية في قذيفة من بيضة السمان مع ثلاثة أيام من الحضانة. جعل ثقب في الجانب الآخر من البيضة حادة، ونقل صفار إلى وعاء مع برنامج تلفزيوني الباردة. إزالة الجنين من صفار عن طريق قطع غشاء vitelline خارجيا إلى الأوعية خارج المقصف.
مع مساعدة من ملقط رقيقة، ونقل الجنين إلى وعاء صغير مملوءة PBS الباردة، ثم نقل الجنين إلى طبق بيتري مع قاعدة سوداء مع مقشطة. إزالة المنطقة البلعوم تحتوي على الحقائب البلعوم الثالث والرابع كما هو موضح في السابق Jove SPA الربط. ثم، نقل المنطقة الثالثة والرابعة قوس البلعوم إلى كوب مليء البنكرياس الباردة واحتضان لمدة ساعة واحدة، على الجليد، للهضم الأنزيمي.
لاحظ أن فترة حضانة الهضم الأنزيمي تعتمد على مرحلة التطور. ضع الطبق الزجاجي تحت المجهر الاستريو وعزل الـ endoderm عن المنطقة الثالثة والرابعة قوس البلعوم، باستخدام اثنين من مشرط صغير في حامل. المقام الأول في المنطقة البلعوم مع الجانب الظهري، وتبين داخليا اعمد و ectoderm في السطح الخارجي.
مراقبة ectoderm، إندودم، mesenchyme، أنبوب القلب، والجزء البطني من الأنبوب العصبي. إزالة الأنبوب العصبي وميسدرم تعلق على سطح الظهرية من endoderm البلعوم. مراقبة endoderm من البلعوم، والحقائب البلعوم الرابع والثالث، وأنبوب القلب.
مع الجانب الظهري، قم بفصل وإزالة mesenchyme بين الأقواس البلعوم وفضح الحقائب البلعوم. تنفيذ هذا الإجراء في الجانب الآخر من المنطقة البلعوم. إزالة mesenchyme تعلق على الجزء الخلفي من معظم endoderm ومراقبة الحقيبة البلعوم الرابع.
مع الجانب الخلفي حتى، لاحظ كل من الحقائب البلعوم الرابع الأيسر والأيني. الاستمرار عن طريق إزالة mesenchyme تعلق على الجزء الخلفي معظم endoderm والحقيبة الثانية. إزالة أنبوب القلب وmesenchyme المحيطة الحقائب الداخلية.
مع الجانب البطني، ومراقبة endoderm البلعوم، والجانب الأيمن من قوس البلعوم الثاني. في هذه المرحلة ، يجب أن يكون endoderm من بدين الغدة الدرقية مرئية. فصل ectoderm من الأقواس البلعوم الثاني والثالث وإزالة بعناية mesenchyme من الأقواس.
مراقبة إزالة mesenchyme من قوس البلعوم الثاني على الجانب الأيمن. لاحظ موقع الحقائب الرابعة والثالثة وروادية الغدة الدرقية. إزالة بقايا إلى الخلايا المينزية تعلق على الحقائب البلعوم.
مراقبة الحقائب الثالثة والرابعة من الجانب الأيمن والحقيبة الرابعة من الجانب الأيسر. كرر مفرزة mesenchyme من الجانب الأيسر. لاحظ الآن الحقيبة الثالثة من الجانب الأيسر.
مراقبة مفرزة mesenchyme من القوس الثاني على الجانب الأيسر. لاحظ أنه يجب أن تبقى جميع الأسطح والحلول باردة أثناء هذا الإجراء. تغيير إلى محلول جديد البنكرياس الباردة وطبق في حالة من أخذ وقتا طويلا لتشريح الأنسجة.
وأخيرا، جعل قطع عرضية بين الحقائب البلعوم الثاني والثالث لإزالة الحقائب الثانية وrudidiment الغدة الدرقية. عند هذه النقطة، وsoderm معزولة يتكون من الحقائب البلعوم الثالث والرابع والتلميح الخلفي من البلعوم. إزالة ما تبقى mesenchyme منفصلة بمساعدة اثنين من مشرط الصغرى.
نقل إندديرم معزولة إلى طبق زجاجي مملوءة مصل البقر الجنين الباردة والاحتفاظ بها على الجليد أثناء إعداد مقايسة في المختبر. وضعت البيض في وضع أفقي والجانب العلوي ملحوظ لاستخدام الفحم. للبدء، إزالة البيض من الحاضنة.
مع مقص منحني، وفتح ثقب صغير في قذيفة، وإدراج إبرة، وpirerate اثنين من milliliters من الألبومين مع حقنة 10 ملليلتر. افتح ثقباً دائرياً في المنطقة المميزة للقذيفة وقطع غشاء الفيتيلين خارجياً إلى الأوعية الجنينية الإضافية أثناء حمل الجنين مع ملقط رقيقة. تحت مجهر ستيريو، ضع الجنين في طبق بيتري مع قاعدة سوداء تحتوي على PBS الباردة.
استخدم أربعة دبابيس حشرة للاحتفاظ بالجنين إلى أسفل الطبق. ضع الدبابيس في المنطقة الخارجية التي تشكل شكل مربع. إجراء شقين بين النيمت 19 و 24 عرضية إلى محور الجنين وعبور الجنين.
حرر هذا القسم عن طريق قطع الحواف الجنينية الهامشية. مراقبة لوحة الجانبي، أنبوب عصبي، و somites. التعرق ونقل الأنسجة إلى طبق زجاجي مملوءة البنكرياس الباردة.
احتضان لمدة 30 دقيقة على الجليد للهضم الأنزيمي. تحت المجهر ستيريو، عزل mesoderm من الأنسجة المحيطة بها باستخدام اثنين من مشرط الصغرى في أصحاب. مراقبة ميسودرم somatopleura، وssopleura، أنبوب عصبي، و ectoderm.
أولا، إزالة ectoderm على السطح. مراقبة سوماتوبلوورا ميسوديرم من انفصالها عن ectoderm. ثم، فصل بعناية في بنترالي تقع 1000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000
مراقبة ميسوديرم الجانبي الأيمن من سوماتوبلوورا. حرره عن طريق قطعه في حركة موازية للأنبوب العصبي. لاحظ أنه يجب أن تبقى جميع الأسطح والحلول باردة أثناء هذا الإجراء.
تغيير إلى محلول جديد البنكرياس الباردة وطبق في حالة من أخذ وقتا طويلا لتشريح الأنسجة. مراقبة ميسوديرم الجانبي الأيسر من somatopleura، somites، الأنبوب العصبي، و ectoderm. كرر الافراج عن mesoderm من هذا الجانب.
جعل الحركات البطيئة مع مشرط الصغرى. البروتينات مصفوفة خارج الخلية المكشوفة الجلوس من خلال الأنسجة والأدوات، ومنع حركات السوائل. قطع بعناية somatopleura في حركة موازية للأنبوب العصبي.
نقل mesoderm معزولة إلى طبق زجاجي مملوءة مصل البقر الجنين الباردة والاحتفاظ بها على الجليد أثناء إعداد في المختبر. ضع صرًا معدنيًا ناعمًا في طبق بيتري وملأه بوسيلة الثقافة. إزالة السوائل المفرطة لمستوى السطح المتوسط مع الجزء العلوي من صر.
مع مساعدة من ملقط رقيقة، تراجع مرشح غشاء في وسط الثقافة ووضعها بعناية على الجزء العلوي من صر أن يكون سطح في اتصال معها. تحت المجهر ستيريو، نقل الإنددير المعزول من الطبق الزجاجي إلى مرشح الغشاء عن طريق الانزلاق لطيف مع مساعدة من ملعقة ملقط رقيقة. كرر هذا الإجراء للميسوديرم المعزول.
مع مساعدة من مشرط صغير، مزيج الأنسجة لتحقيق أقصى قدر من انها جمعية. ضع الأنسجة المرتبطة بعناية في حاضنة مرطبة عند 37 درجة مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 48 ساعة. بعد فترة الحضانة، الكسب غير المشروع الأنسجة الثقافة على غشاء نوع كوريولان والسماح لها لتطوير في البيضاوي لمدة 10 أيام أخرى لاستكمال تشكيل الجهاز كما وصف سابقا.
هنا هو الأسلوب الخلوي الذي يسمح لعزل أنسجة جنينية الطيور لاستخدامها في نهج تجريبية متميزة. وكمثال على ذلك، تم تقييم التعبير عن الجينات المعروفة بالمشاركة في تكوين الحقائب البلعومية أيضاً في إندودم معزول يحتوي على الحقائب البلعومية الثانية والثالثة والرابعة من أجنة الدجاج في اليوم الجنيني ثلاثة ونصف عن طريق التركيب الكامل في التهجين. تم الكشف عن التعبير عن القنفذ سونيك في endoderm من البلعوم المركزي واستبعد من الحقائب، في حين تم التعبير عن BMP7 في endoderm من الحقائب البلعوم الثاني والثالث واستبعد من البلعوم المركزي والحقيبة البلعوم الرابع.
يمكن أن تكون الأنسجة المعزولة أيضا في المختبر المرتبطة على وجه التحديد في المختبر لمدة 48 ساعة، والكسب غير المشروع على غشاء نوع كوريولان، ويسمح لتطوير لأيام أخرى 10. يمكن تحليل Explants بواسطة علم الأنسجة التقليدي والكيمياء المناعية. بعض النتائج التمثيلية لرابطة السمان endoderm من الحقائب البلعوم الثالث والرابع مع الدجاج somatopleura mesoderm هي التالية-Grafts أظهرت الغدة الصعترية الشيمية شكلت بالكامل مع السمان المشتقة الخلايا الظهارية الغدية إيجابية ل QCPN والخلايا اللمفاوية الدجاج.
بالإضافة إلى ذلك، أظهرت السيتوكيراتين ظهارة الزعتر الإيجابية ميزات مورفولوجية طبيعية، وعرض بنية شبكة نموذجية. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد كيفية عزل أنسجة السمان والدجاج الجنينية التي يمكن استخدامها في دراسات التعبير الجيني وعن طريق تشكيل أعضاء تشيميرك يمكن أن تساعد أيضا في فك تعقيد علم الوراثة الجهاز.
