この手順の全体的な目標は、ウズラおよび鶏の胚から胚組織を単離するための最適化された実験的アプローチを提示することです。この技術により、遺伝子発現研究や機能アッセイに用いることができる純粋な胚組織を得る。ウズラおよび鶏の胚からの組織はマイクロサージャストによって単離され、その生物学的特性を維持しながら体外酵素消化を受ける。
分離後、3次元保存組織を使用して、高解像度の地形遺伝子発現パターン解析を行うことができます。このアプローチは、従来の方法ではアクセスできない胚領域におけるsitu遺伝子発現の詳細化に特に有用である。さらに、トランスクリプトーム解析アプローチは、遺伝子マーカーを必要とせずに単離された組織に適用され、組織固有の高スループットオミック分析を提供する。
あるいは、両方の種からの単離された組織は、48時間のインビトロ・オルガヌティピックアッセイに関連付けることができる。ウズラと鶏の細胞は、別個の核特徴と分子マーカーによって識別することができるので、このアプローチは、組織の相互作用を研究することができます。培養組織が器官を形成する能力は、ovoアッセイで更に試験することができる。
したがって、この方法は、非常に動的な容量修飾を伴う発達過程における複雑な組織相互作用を研究するのに有用なツールであり、また、臓器形成に対する特定の胚領域の可能性を明らかにするのに役立つ。一例として、本明細書では、単離胚組織からのウズラ-ニワトリキメラ胸腺の形成について説明する。第1に、第3および第4咽頭パウチの内因性は、前向きの胸腺初歩が、3日間の発達を伴うウズラ胚の咽頭領域から単離される。
そして、この組織は、その発達を支えることができる間質と関連している、ソマトプレウラ中皮。最後に、組織の異物性関連は、キメラ胸腺を形成するために、インビトロおよびオボで培養される。水平ラミナルフローフードと滅菌された器具および材料を使用して、滅菌条件ですべての卵の操作手順を実行します。
受精したウズラの卵は、空気室を上に向けてインキュベートした。まず、ウズラの卵を保育器から取り除きます。冷たいPBSで満たされた大きなホウケイ酸ガラスボウルを準備します。
湾曲したはさみで、3日間のインキュベーションでウズラの卵の殻に円形の穴をタップしてカットします。卵の反対側の穴を鈍くし、冷たいPBSでボウルに黄身を移します。卵黄から胚を取り除き、ビテリン膜を胚外の血管に外から切断する。
薄い鉗子の助けを借りて、冷たいPBSで満たされた小さなボウルに胚を移し、その後、スキマーで黒いベースを持つペトリ皿に胚を移動します。前のJove SPAライゲーションに記載されているように、第3および第4咽頭パウチを含む咽頭領域を除去する。次に、冷たい膵臓で満たされたガラスに第3および第4の咽頭アーチ領域を移し、氷上で酵素消化のために1時間インキュベートする。
酵素消化のインキュベーション期間は、開発段階に依存する。ガラス皿をステレオ顕微鏡の下に置き、ホルダーに2つのマイクロメスを使用して、第3および第4咽頭アーチ領域から内臓を分離する。第1位の咽頭領域を裏側を上にして、内外面に内胚葉と外胚葉を内部に示す。
神経管の外胚葉、内胚葉、間質、心臓管、および腹側部分を観察する。咽頭内膜の後面に付着した神経管と中胚葉を取り除く。咽頭の内胚葉、第4咽頭のパウチ、心臓管を観察する。
背側を上にして、慎重に取り外し、咽頭のアーチの間の間葉を取り除き、咽頭のパウチを露出させる。咽頭領域の反対側で、この手順を実行する。内胚葉の最も後部に取り付けられた間葉を取り除き、第4咽頭袋を観察する。
後部側を上にして、左右の4番目の咽頭パウチを観察します。内胚葉の最も後部および第2のポーチに取り付けられた間質を取り除くことによって続ける。心臓チューブと内部ポーチを囲む間分煙を取り除きます。
腹側を上にして、咽頭の内臓と第2咽頭弓の右側を観察する。この段階では、甲状腺の初歩の内胚葉が目に見えるはずです。第2および第三咽頭アーチの外皮を取り外し、慎重にアーチの間質を取り除きます。
右側の第2咽頭アーチの間葉の除去を観察する。4番目と3番目のパウチと甲状腺の初歩の位置に注意してください。咽頭袋に付着した間葉系細胞に残った細胞を除去する。
右側の3番目と4番目のポーチと左側から4番目のポーチを観察します。左側の間葉剥離を繰り返します。左側の3番目のポーチを観察してください。
左側の第2アーチの間葉剥離を観察します。この手順では、すべてのサーフェスとソリューションを冷たく保つ必要があります。組織を解剖するのに長い時間がかかる場合には、新しい冷たい膵臓溶液と皿に変更します。
最後に、第2咽頭のパウチと第3咽頭パウチの間で横断的な切断を行い、2番目のパウチと甲状腺の初歩を取り除きます。この時点で、孤立した内胚葉は、咽頭の第3および第4咽頭のパウチおよび後端から構成される。2つのマイクロメスの助けを借りて、剥離された間分煙を取り除きます。
分離された内胚葉を冷たい牛の血清で満たされたガラス皿に移し、インビトロアッセイの準備中に氷の上に保管します。卵を水平位置に置き、上側は炭を使用するためにマークしました。まず、インキュベーターから卵を取り出します。
湾曲したはさみで、シェルに小さな穴を開け、針を挿入し、10ミリリットルの注射器で2ミリリットルのアルブミンを吸引する。シェルのマークされた領域に円形の穴を開け、薄い鉗子で胚を保持しながら、余分な胚性血管に外的にビテリン膜を切断します。ステレオ顕微鏡の下で、冷たいPBSを含む黒いベースのペトリ皿に胚を入れます。
4本の昆虫ピンを使用して、胚をプレートの底まで保持します。正方形の形状を形成する胚外領域にピンを置きます。スマイト19と24の間で、胚軸に横切って、胚を横切る2つの切り傷を行う。
このセクションをリリースするために、周辺の胚エッジを切断します。横板、神経管、およびスマイトを観察します。吸引し、冷たい膵臓で満たされたガラス皿に組織を移す。
酵素消化のために氷の上で30分間インキュベートする。ステレオ顕微鏡の下で、ホルダーに2つのマイクロメスを使用して周囲の組織から中皮を分離します。ソマトプレウラ中皮、スプランチノプレラ、神経管、外皮を観察する。
まず、表面の外皮を取り除きます。外皮から解離したソマトプレウラ中皮を観察する。その後、腹腔内に位置するスプランチノプレラを体性胸膜から慎重に取り外します。
ソマトプレラの右横中皮を観察する。神経管に平行な動きでそれを切断することによってそれを解放する。この手順では、すべてのサーフェスとソリューションを冷たく保つ必要があります。
組織を解剖するのに長い時間がかかる場合には、新しい冷たい膵臓溶液と皿に変更します。ソマトプレラ、スマイト、神経管、外皮の左横中皮を観察する。この側の中皮解放を繰り返します。
マイクロメスでゆっくりと動きます。露出した細胞外マトリックスタンパク質は組織や器具を通して座り、流体の動きを防ぎます。慎重に神経管に平行運動で体細胞腫をカット.
分離した中皮を冷たい牛の血清で満たされたガラス皿に移し、インビトロアッセイの準備中に氷の上に保管します。ペトリ皿に細かいメッシュの金属格子を入れ、培養液で満たします。過剰な液体を取り除き、中程度の表面を格子の上部に当てはめます。
薄い鉗子の助けを借りて、培養培地に膜フィルターを浸し、慎重に彼女と接触する表面を持っている火格子の上に置きます。ステレオ顕微鏡の下で、スパチュラと薄い鉗子の助けを借りて穏やかに滑ることによって、ガラス皿から膜フィルターに孤立した内胚を移す。分離した中皮についてこの手順を繰り返します。
マイクロメスの助けを借りて、組織を混ぜて、それが関連付けを最大化します。関連する組織を37度の加湿インキュベーターに慎重に入れ、5%CO2を48時間置きます。インキュベーション期間の後、培養組織をコリオラン型膜に移植し、先に述べたように臓器形成を完了するためにさらに10日間楕円形で発達することを可能にする。
ここでは、鳥の胚組織の単離を明確な実験アプローチで使用することを可能にする網状法があります。一例として、咽頭パウチの形成に関与することが知られている遺伝子の発現は、胚の3日目における鶏の胚からの第2、第3、および第4咽頭パウチを含む単離された内胚をその現場での全てのマウントによって評価した。ソニックヘッジホッグの発現は中央咽頭の内胚葉で検出され、パウチから除外され、BMP7は第2咽頭および第3咽頭パウチの内胚葉で発現し、中央咽頭および第4咽頭ポーチから除外された。
単離された組織はまた、48時間のインビトロで特異的に関連付けられたvitro、コリオラン型膜上への移植、およびさらに10日間の発達を許すことができる。外植は、従来の神学と免疫検査によって分析することができます。鶏のソマトプレウラ中胚葉との第3および第4咽頭のパウチからのウズラ内胚葉の関連のいくつかの代表的な結果は、以下のグラフトはQCPNおよび鶏リンパ球細胞に陽性のウズラ由来の胸腺由来の完全に形成されたキメラ胸腺を示した。
さらに、サイトケラチン陽性胸腺上皮は正常な形態学的特徴を示し、典型的な網状体系を示した。このビデオを見た後、あなたは遺伝子発現研究で使用することができるウズラと鶏胚組織を分離する方法をよく理解している必要があり、キメラ臓器を形成することによって、臓器遺伝学の複雑さを解読するのにも役立ちます。
