המטרה הכוללת של הליך זה היא להציג גישה ניסיונית ממוטבת לבודד רקמות עובריות מהעוברים השלווים והעוף. בעזרת טכניקה זו, אנו משיגים רקמות עובריות טהורות שניתן להשתמש בהן במחקרים על ביטוי גנים ובראיות תפקודיות. רקמות מעוברים שליו ועוף מבודדות על ידי מיקרוכירורגיה וכפופות לעיכול אנזימטי במבחנה תוך שמירה על תכונותיו הביולוגיות.
לאחר הבידוד, ניתן להשתמש ברקמות המשומרות התלת מימדיות לניתוח דפוסי ביטוי גנים טופוגרפיים ברזולוציה גבוהה. גישה זו שימושית במיוחד עבור פירוט ביטוי גנים situ בשטחים עובריים אחרת נגיש על ידי שיטות קונבנציונליות. בנוסף, גישות ניתוח transcriptome ניתן ליישם גם ברקמות מבודדות ללא צורך סמנים גנטיים, תוך מתן ניתוח omic תפוקה גבוהה ספציפית לרקמות.
לחלופין, הרקמות המבודדות משני המינים יכולות להיות קשורות בהבטחה איברים במבחנה במשך 48 שעות. גישה זו מאפשרת לחקור אינטראקציות רקמות, שכן שליו ותאי עוף יכולים להיות מופלים על ידי תכונות גרעיניות נפרדות סמנים מולקולריים. היכולת של רקמות התרבות כדי ליצור איברים ניתן לבדוק עוד יותר על ידי ovo בדיקה.
שיטה זו היא אפוא כלי שימושי לחקר אינטראקציות רקמות מורכבות בתהליכים התפתחותיים עם שינויים ספאתיים דינמיים מאוד והוא יכול גם לעזור לחשוף את הפוטנציאל של שטחים עובריים ספציפיים להיווצרות איברים. כדוגמה, להלן מתואר היווצרות של התימוס כימרי עוף שליו מרקמות עובריות מבודדות. ראשית, endoderm של שקיות הלוע השלישי והרביעי, היסודות התימית הפוטנציאליים מבודדים מאזור הלוע של עוברי שליו עם שלושה ימים של התפתחות.
לאחר מכן, רקמה זו קשורה mesenchyme מסוגל לתמוך בהתפתחות שלה, mesoderm somatopleura. לבסוף, הקשר ההטרוסקופי של רקמות הוא מתורבת במבחנה וב ovo כדי ליצור תימוס כימרי. בצע את כל הליכי מניפולציית הביצים בתנאים סטריליים באמצעות מכסה המנוע של זרימה למינארית אופקית ומכשירים וחומרים מעוקרים.
ביצי שליו מופרות הודגרו כאשר תא האוויר פונה כלפי מעלה. כדי להתחיל, להסיר את ביצי שליו מהחממה. הכינו קערת זכוכית בורוסיליקט גדולה מלאה ב-PBS קר.
עם מספריים מעוגלים, הקש וגזור חור עגול בקליפת ביצת שליו עם שלושה ימים של דגירה. הפוך את החור בצד הנגדי של הביצה קהה, ולהעביר את החלמון לקערה עם PBS קר. הסר את העובר מהחלמון על ידי חיתוך קרום הויטללין חיצונית לכלי חוץ.
בעזרת מלקחי דק, מעבירים את העובר לקערה קטנה מלאה ב- PBS קר, ואז מעבירים את העובר לצלחת פטרי עם בסיס שחור עם רחפן. הסר את אזור הלוע המכיל את שקיות הלוע השלישית והרביעית כמתואר ב קשירה קודמת של Jove SPA. לאחר מכן, מעבירים את אזור קשת הלוע השלישי והרביעי לזכוכית המלאה בלבלב קר ודגירה למשך שעה, על קרח, לעיכול אנזימטי.
שים לב כי תקופת הדגירה של עיכול אנזימטי תלוי בשלב ההתפתחות. מניחים את צלחת הזכוכית מתחת למיקרוסקופ הסטריאו ומבודדים את האנדרודרמה מאזור קשת הלוע השלישי והרביעי, באמצעות שני מיקרו-אזמל במחזיק. ראשית את אזור הלוע עם הצד הגבי למעלה, מראה באופן פנימי את endoderm ואת ectoderm על פני השטח החיצוניים.
שימו לב לאקטודרמה, אנדודרמה, סנצ'ים, צינור לב וחלק גחון של הצינור העצבי. הסר את הצינור העצבי ואת mesoderm מחובר לפני השטח הגביים של endoderm הלוע. שימו לב לאנודרמה של הלוע, לשישי הלוע הרביעי והשלישי, וצינור הלב.
כשהצד הגבי למעלה, ניתוק בזהירות והסרה של המזנצ'ים בין קשתות הלוע וחושפים את שקיות הלוע. בצע הליך זה בצד השני של אזור הלוע. הסר את mesenchyme המצורפת לחלק האחורי ביותר של endoderm ולצפות כיס הלוע הרביעי.
עם צד אחורי למעלה, להתבונן גם שמאלה וגם ימינה שקיות הלוע הרביעי. המשך על ידי הסרת mesenchyme המצורפת לחלק האחורי ביותר של endoderm ואת הכיס השני. הסר את צינור הלב ואת mesenchyme המקיף את השקיות הפנימיות.
עם הצד הגחוני למעלה, להתבונן אנדודורם הלוע, ואת הצד הימני של קשת הלוע השנייה. בשלב זה, endoderm של היסוד של בלוטת התריס צריך להיות גלוי. נתק את האקטודרמה של קשתות הלוע השני והשלישי והסר בזהירות את המיזנצ'ים של הקשתות.
שימו לב להסרת המיזנצ'ים של קשת הלוע השנייה בצד ימין. שימו לב למיקום השקיות הרביעית והשלישית ובסיס בלוטת התריס. הסר את השרידים לתאי mesenchymal המחוברים לשקיות הלוע.
שימו לב לשקית השלישית והרביעית של הצד הימני ולשקית הרביעית מצד שמאל. חזור על ניתוק mesenchyme של הצד השמאלי. שימו לב עכשיו לשקית השלישית של הצד השמאלי.
שימו לב לניתוק המנשים של הקשת השנייה בצד שמאל. שים לב כי כל המשטחים והפתרונות צריכים להישמר קרים במהלך הליך זה. עבור לתתס לבלב קר חדש צלחת במקרה של לוקח הרבה זמן לנתח את הרקמות.
לבסוף, לעשות חתך רוחבי בין השקיות הלוע השני והשלישי כדי להסיר את השקיות השני ואת היסודות בלוטת התריס. בנקודה זו, endoderm מבודד מורכב שקיות הלוע השלישי והרביעי ואת הקצה האחורי של הלוע. הסר את השרידים mesenchyme מנותק בעזרת שני מיקרו אזמלים.
מעבירים את האנדודרמה המבודדת לצלחת זכוכית מלאה בסרום בקר עוברי קר ולשמור אותה על קרח במהלך הכנת ההקדמה במבחנה. ביצים הונחו במצב אופקי ובפלגן העליון סומנו לשימוש בפחם. כדי להתחיל, להסיר את הביצים מן החממה.
עם מספריים מעוגלים, לפתוח חור קטן במעטפת, להכניס מחט, ולזעור שני מיליליטר של אלבומין עם מזרק 10 מיליליטר. פתח חור עגול באזור המסומן של הקליפה וחתוך את קרום הויטליין חיצונית לכלי העובר הנוספים תוך החזקת העובר במטלות דקות. תחת מיקרוסקופ סטריאו, מניחים את העובר בצלחת פטרי עם בסיס שחור המכיל PBS קר.
השתמש בארבעה סיכות חרקים כדי להחזיק את העובר לתחתית הצלחת. מניחים את הפינים באזור ההיסטריוני ויוצרים צורה מרובעת. בצע שני חתכים בין somites 19 ו 24 רוחבי לציר העובר לחצות את העובר.
שחרר סעיף זה על ידי חיתוך הקצוות העובריים השוליים. שימו לב לצלחת ההיבראלית, הצינור העצבי והשמיץ. שאף והעבר את הרקמות לצלחת זכוכית מלאה בלבלב קר.
דגירה במשך 30 דקות על קרח לעיכול אנזימטי. תחת מיקרוסקופ הסטריאו, לבודד את mesoderm מהרקמות שמסביב באמצעות שני מיקרו אזמלים במחזיקים. שימו לב לסומאטופלורה מזודורם, הפלנצ'נופלורה, הצינור העצבי והקטודרמה.
ראשית, להסיר את ectoderm על פני השטח. שימו לב לסומטופלורה מסודרם המנותק מהקטודרם. לאחר מכן, נתק בזהירות את הפלנצ'נופלורה הממוקמת באופן ונטרי מהסומטופלורה.
שימו לב למוסודרמה בצד ימין של הסמטופלורה. שחרר אותו על ידי חיתוך אותו בתנועה מקבילה לצינור העצבי. שים לב כי כל המשטחים והפתרונות צריכים להישמר קרים במהלך הליך זה.
עבור לתתס לבלב קר חדש צלחת במקרה של לוקח הרבה זמן לנתח את הרקמות. שימו לב למסודרמה השמאלית של הסמטופלורה, הסמיטות, הצינור העצבי והקטודרמה. חזור על שחרור mesoderm של הצד הזה.
בצע תנועות איטיות עם המיקרו-אזמל. חלבוני המטריצה החוץ-תאית החשופים יושבים דרך רקמות ומכשירים, ומונעים תנועות נוזלים. בזהירות לחתוך את somatopleura בתנועה מקבילה לצינור העצבי.
מעבירים את המוסודורם המבודד לצלחת זכוכית מלאה בסרום בקר עוברי קר ולשמור אותו על קרח במהלך הכנת ההתנסויות במבחנה. מניחים סריג מתכת רשת עדין בצלחת פטרי וממלאים במדיום תרבות. הסר את הנוזלים המוגזמים כדי ליישר את המשטח הבינוני עם החלק העליון של המחרט.
בעזרת מדפים דקים, טובלים מסנן קרום במדיום התרבות ומציבים אותו בזהירות על גבי המשגר כדי שיהיה משטח במגע איתה. מתחת למיקרוסקופ הסטריאו, מעבירים את האנדרודרמה המבודדת מצלחת הזכוכית למסנן הממברנה על ידי החלקה עדינה בעזרת מרית ומדפים דקים. חזור על הליך זה עבור mesoderm מבודד.
בעזרת מיקרו-אזמל, מערבבים את הרקמות כדי למקסם את הקשר שלהן. שים בזהירות את הרקמות הקשורות באינקובטור לח ב 37 מעלות עם 5%CO2 במשך 48 שעות. לאחר תקופת הדגירה, השתל את רקמות התרבות על קרום סוג קוריולאן ולאפשר לו להתפתח אליפסה במשך 10 ימים נוספים כדי להשלים היווצרות איברים כפי שתואר קודם לכן.
הנה השיטה הרשתית המאפשרת בידוד של רקמות עובריות עופות לשמש בגישות ניסיוניות נפרדות. כדוגמה, הביטוי של גנים הידועים כמעורבים בהיווצרות שקיות הלוע הוערך גם אנדודרמה מבודדת המכילה את שקיות הלוע השני, השלישי והרביעי מהעוברים של העוף ביום העוברי שלוש וחצי על ידי הר שלם בהכלאה במקום. הביטוי של קיפוד סוניק זוהה ב endoderm של הלוע המרכזי ולא נכלל השקיות, בעוד BMP7 בא לידי ביטוי אנדודרם של שקיות הלוע השני והשלישי ולא נכלל הלוע המרכזי ואת כיס הלוע הרביעי.
רקמות מבודדות יכול גם להיות vitro הקשורים במיוחד במבחנה במשך 48 שעות, השתל על קרום סוג קוריולאן, מותר לפתח עוד 10 ימים. Explants ניתן לנתח על ידי היסטולוגיה קונבנציונלית אימונוהיסטוכימיה. כמה תוצאות מייצגות של הקשר של אנדודרמה שליו מן השקיות הלוע השלישי והרביעי עם עוף somatopleura mesoderm הם הבאים-שתלים הראו תימוס כימרית מעוצבת במלואה עם שליו נגזר תאי אפיתל תימי חיובי עבור QCPN ותאי לימפה עוף.
בנוסף, אפיתל תיסמי חיובי cytokeratin הראה תכונות מורפולוגיות נורמליות, המציג ארכיטקטורה רשתית טיפוסית. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה צריך הבנה טובה כיצד לבודד שליו ורקמות עובריות עוף שניתן להשתמש בהם במחקרים ביטוי גנים ועל ידי יצירת איברים כימריים יכול גם לעזור לפענח את המורכבות של גנטיקה איברים.
