Le micro CT n’a pas été largement appliqué aux invertébrés marins en raison de leur diversité en morphologie. Notre méthode permet un montage facile d’échantillons à n’importe quel angle adapté à sa morphologie. Il peut être effectué avec des matériaux communs, tels que l’eau, l’argile et les tubes, et le cas échéant, aux échantillons avec une variété de formes, d’un ver long à une boule ronde.
Akiteru Maeno, technicien à l’Institut national de génétique du Japon, démontrera la procédure. Pour commencer, préparez 0,5 % d’agarose en dissolvant 500 milligrammes d’agarose dans 100 millilitres d’eau distillée dans un flacon conique de 250 millilitres et placez le flacon dans un four à micro-ondes à puissance de 800 watts pour chauffer environ une à trois minutes. Refroidir le flacon à température ambiante.
Pour monter de gros échantillons qui ne rentrent pas dans une pointe bleue de micropipette de 1000 microlitres, comme A.equina, placez d’abord l’échantillon taché dans un plat de 60 millimètres avec de l’eau distillée pour laver la solution de coloration excessive de la surface. Dans un tube de 50 millilitres, verser doucement cinq millilitres de 0,5% d’agarose sans faire de bulles. Placer le tube sur la glace pour durcir l’agarose.
Ajouter ensuite 20 millilitres de 0,5 % d’agarose au tube, placer sur la glace jusqu’à ce que l’agarose commence à durcir et utiliser des forceps pour placer le spécimen dans l’agarose. Ajustez la position du spécimen de sorte que son axe corporel soit vertical. Durcir l’agarose sur la glace.
Placez l’argile sur la scène de montage microCT et placez le tube de 50 millilitres sur l’argile. Pour monter de petits échantillons qui s’insérant dans une pointe bleue micropipette de 1000 microlitres, comme Harmothoe sp. et X.japonica, décantez l’échantillon taché dans un plat de 60 millimètres sans utiliser de forceps.
À l’aide d’une pince à épiler, transférer délicatement les échantillons dans un autre plat de 60 millimètres rempli d’eau distillée pour laver la solution de coloration excessive de la surface. Ensuite, dessinez 100 microlitres de 0,5% agarose dans une pointe bleue micropipette de 1000 microlitres et placez-les sur la glace pour durcir. Lors de la manipulation Harmothoe sp.
ajouter 1000 microlitres de 0,5% agarose dans la prise d’agarose dans la pointe. Utilisez des pinces à épiler pour transférer doucement harmothoe sp. du plat de 60 millimètres dans la solution agarose dans la pointe.
À l’aide d’une aiguille de pétiole ou d’une pince de précision, ajustez la position et l’orientation de l’Harmothoe sp. de façon à ce que les chaetae ne soient pas pliées anormalement. Assurez-vous qu’il n’y a pas de bulles, puis placez la pointe sur la glace pour durcir l’agarose.
Lorsque vous manipulez des échantillons fragiles comme X.japonica, utilisez une micropipette pour ajouter 1000 microlitres d’eau distillée dans la pointe bleue avec le bouchon d’agarose durci. Placez le X.Japonica dans l’eau distillée afin qu’il soit stable entre les parois de la pointe. Pour les échantillons plus petits, une pointe jaune micropipette de 200 microlitres peut être utilisée.
Dans ce cas, utilisez 30 microlitres d’agarose pour la prise, et ajoutez 200 microlitres d’agarose ou d’eau distillée. Ensuite, coupez la pointe d’une nouvelle pointe bleue micropipette de 1000 microlitres et insérez la pointe de la pointe branchée dans la nouvelle pointe. Placez l’argile sur la scène de montage microCT et réglez les pointes avec l’échantillon à l’intérieur sur l’argile.
Rapidement après avoir monté les échantillons, allumez le faisceau de rayons X à 80 kilovolts et 100 microampes. Tout en observant l’image de transmission aux rayons X, déplacez la scène de façon à ce que l’ensemble de l’échantillon puisse être vu en cliquant sur les boutons x et z-axe, et en ajustant manuellement le bouton y-axe sur la scène de montage. Ajustez les conditions de contraste de l’image afin que les structures internes puissent être observées.
Ajustez l’orientation de l’échantillon en changeant l’angle du tube dans l’argile. Faites pivoter l’étape à 90 degrés en fixant l’axe de rotation à 90 et en cliquant sur le bouton Mouvement relatif. Effectuez la même manœuvre quatre fois pour effectuer une rotation complète.
Éteignez manuellement le faisceau de rayons X chaque fois que la porte de l’échantillon est ouverte, à moins que le système ne l’éteigne automatiquement. Maintenant, cliquez sur le bouton z-axe et ajustez manuellement le bouton y-axe pour déplacer la scène de montage de sorte que l’échantillon est au centre de la vue. Tournez la scène de 90 degrés et ajustez l’échantillon au centre à nouveau.
Tournez la scène 90 degrés trois fois de plus, et ajuster au besoin pour être sûr que l’échantillon est au centre de la vue de toutes les directions. Ensuite, cliquez sur le bouton x-axe pour déplacer la scène le long de l’axe X vers la source de faisceau de rayons X pour agrandir l’échantillon, et ajuster au besoin de sorte qu’il s’intègre juste dans la vue. Tournez la scène et ajustez au besoin pour vous assurer que l’échantillon s’inscrit dans la vue de toutes les directions.
Ajustez les conditions de numérisation, puis commencez à numériser. Dans cette expérience, la formation image de microCT a été exécutée sur Actinia equina, Harmothoe sp. et Xenoturbella japonica après coloration avec 25%Lugol' solution de s.
La coloration a amélioré avec succès le contraste des structures internes dans tous les spécimens, permettant des observations des tissus mous internes. Cette méthode s’applique aux spécimens fragiles, même avec des dommages externes, comme on peut le voir sur le spécimen X.japonica avec épiderme gravement endommagé. Un seul ensemble de données haute résolution d’un spécimen entier a été reconstruit pour Harmothoe sp.
et X.japonica à partir de multiples scans effectués sur différentes parties du spécimen, mais qui se chevauchent. Assurez-vous de régler l’échantillon dans le tube ou la pointe et de monter le tube ou la pointe dans le microCT afin qu’il ne bouge pas pendant la numérisation. Les données obtenues à partir de cette procédure peuvent être utilisées pour des reconstructions d’images 3D, ce qui permet au chercheur de bien comprendre la morphologie interne et externe de l’échantillon.
Tous les systèmes microCT utilisent des rayons X, mais les spécificités peuvent être différentes d’un système à l’autre, alors assurez-vous de suivre de près les instructions de chaque système.
