Bonjour, je m’appelle Bartolomeo Bosco, et je suis doctorant au Laboratoire de réseau transcriptionnel du Centre de biologie intégrative de l’Université de Trento en Italie. Comme vous le savez, la transcription est un processus extrêmement complexe impliquant l’organisation spatiale et temporelle du facteur de transcription et du cofacteur. La plupart d’entre eux, y compris le P53 humain, reconnaissent des éléments spécifiques cis-agissant, appelés éléments de réponse, et la liaison sur ce séquençage de l’ADN est nécessaire pour la modulation de la transcription des gènes cibles.
Dans ce travail, nous aimerions vous montrer le protocole pour étudier la séquence P53 spécifique dans les fonctions de transactivation en utilisant la levure comme un système modèle comme protéine dans un gène reporter de couleur ou la luciferase ou sur la quantification de la croissance cellulaire pour mettre en évidence les principales étapes expérimentales et la polyvalence de ces approches. Protocole 1, construction de souches de levure reporter qui contiennent un élément spécifique de réponse P53 en amont de l’adénone-2 ou le gène luciferase firefly. Pour construire une souche reporter, suivez d’abord les étapes 1.1 à 1.15 pour transformer les cellules de levure avec des oligonucléotides ciblant la région promoteur désirée.
La transformation est basée sur le protocole standard basé sur l’acétate de lithium. Une fois que les transformateurs apparaissent sur les plaques 5-FOA, généralement après trois jours d’incubation à 30 degrés, répliquez-les sur des plaques YPDA non sélectives et aussi sur des plaques YPDA contenant G418, marquant chaque plaque pour faciliter leur comparaison ultérieure. Incuber les assiettes toute la nuit à 30 degrés.
Le lendemain, identifiez les souches de journalistes candidats des colonies sensibles au G418 mais qui ont grandi sur les plaques de la YPDA. Stries les colonies identifiées sur une nouvelle plaque YPDA pour obtenir des isolats de colonie unique, et les laisser croître pendant deux jours à 30 degrés. Vérifiez l’intégration correcte de l’élément de réponse P53 désiré, en effectuant une réaction PCR avec les conditions mentionnées à l’étape 1.20.
Chargez un aliquot du produit PCR sur du gel d’agarose pour vérifier la longueur d’amplicon correcte avant le séquençage Sanger. Protocole deux, nous présentons un exemple de la façon d’évaluer la capacité de transactivation des protéines P53 en utilisant l’analyse qualitative de levure à base de couleur adénoine-2. Transformez les cellules de levure avec des vecteurs d’expression P53 suivant le même protocole à base d’acétate de lithium décrit dans la première section.
Stries colonies transformatrices de levure unique, jusqu’à six par plaque, sur une nouvelle plaque sélective, et laissez-les croître pendant la nuit à 30 degrés. Le lendemain, à l’aide de velours stériles, répliquez les stries sur de nouvelles plaques sélectives qui permettent d’évaluer le phénotype de couleur, c’est-à-dire les plaques sélectives contenant une quantité limitative d’adénone.
Incuber à 30 degrés pendant trois jours. Les mêmes stries peuvent être plaquées réplique plusieurs fois. Protocole trois, nous présentons maintenant un exemple de l’évaluation de la capacité de transactivation des protéines P53 à l’aide de l’analyse quantitative de levure LUC1 à base de luminescence.
Tout d’abord, transformer les cellules de levure avec des vecteurs d’expression P53 suivant, encore une fois, le protocole à base d’acétate de lithium décrit dans la section deux. Patch transformants simples sur de nouvelles plaques sélectives contenant du glucose comme source de carbone, et laissez-les croître à 30 degrés pendant la nuit. Pour chaque type de transformation, faire cinq à sept correctifs différents.
Après la croissance pendant la nuit, résuspendez une petite quantité de cellules à l’aide d’un cure-dent stérile ou d’une pointe de pipette dans un milieu sélectif synthétique contenant du raffinose comme source de carbone. Ces suspensions cellulaires devraient avoir une densité optique à 600 nanomètres autour de 0,4 et peuvent ensuite être divisées en plusieurs plaques de 96 puits pour incubation à des températures, traitements, ou pour exposer les cellules à une quantité variable de galactose pour activer l’expression P53. Pour mesurer l’activité du journaliste firefly, transférez 10 à 20 microlitres de suspension cellulaire de la plaque transparente de 96 puits dans une plaque blanche de 384 puits, et mélangez les cellules avec un volume égal de tampon de lyse, en incubation pendant 10, 15 minutes à température ambiante sur un shaker.
Ajouter 10, 20 microlitres de substrat luciferase firefly. Et mesurez les unités lumineuses à l’aide d’un lecteur de plaques multilabel. Mesurer également la densité optique des cultures dans la plaque de 96 puits.
Protocole quatre, nous présentons maintenant un exemple de la façon d’exploiter l’inhibition de la croissance de la levure induite par P53. Transformez les cellules de levure avec des vecteurs d’expression P53, ou cotransformez-les avec des vecteurs d’expression pour coexprimer P53 et l’un de ses cofacteurs, tels que MDM2, suivant, encore une fois, le protocole basé sur l’acétate de lithium décrit dans la première section. Cultiver des cellules transformatrices dans un milieu sélectif à environ une densité optique.
Et diluer à 0,05, et ajouter une molécule choisie à la concentration appropriée. Incuber les cellules à 30 degrés sur un shaker pendant 42 heures. Ensuite, les graines 100 microlitres de la culture cellulaire de levure dans les plaques moyennes sélectives minimales.
Incuber pendant deux jours à 30 degrés. L’intégration re correcte à la place de la cassette ICORE peut être vérifiée par la colonie PCR, à partir d’une petite quantité de cellules à partir de clones de levure candidats et en utilisant des amorces décrites dans le tableau trois pour amplifier le locus ciblé. Les produits PCR, une bande d’environ 500 nucléotides, peuvent ensuite être vérifiés par séquençage Sanger pour confirmer la séquence de l’emplacement génomique modifié pour la présence de la séquence d’élément de réponse P53 correcte.
La souche reporter est prête à être utilisée dans les tests fonctionnels. Pour évaluer la capacité de transactivation des protéines P53, vérifiez la couleur des colonies de levures. Par exemple, nous présentons une comparaison entre p53 de type sauvage et les mutants R175H et R282W en utilisant deux reporters différents, P21-5-prime et PUMA, et deux températures différentes, 30 degrés et 37 degrés.
Fait intéressant, alors que le R175H est un allèle P53 en perte de fonction, colonies rouges dans toutes les conditions, R282W montre une sensibilité à la température avec une activité de transactivation résiduelle à 30 degrés, entraînant des colonies blanches, mais une perte d’activité à 37 degrés, entraînant des colonies rouges ou roses. Un ensemble de données étendu est présenté dans la figure deux B.Wild-type P53 dans quatre allèles mutants ont été testés pour la transactivation en utilisant 10 différentes souches de reporter élément de réponse P53, trois températures, et les niveaux d’expression constitutive. Les résultats sont résumés dans un code de couleur qui rappelle le phénotype de couleur de colonie de levure.
L’allèle mutant P53 K139E conserve une activité partielle et est sensible au froid. Par exemple, les colonies sont rouges dans la souche de journaliste GADD45 à 24 et 30 degrés, mais elles sont blanches à 37 degrés. Ici, nous présentons un exemple de résultats obtenus avec cette méthode, comparant la spécificité de transactivation de la levure humaine et C.elegans P53.
Les résultats dans le graphique à barres sont exprimés en unités moyennes de lumière relative avec erreur standard de quatre répétitions. Cinq éléments de réponse P53 différents ont été comparés. Trois niveaux différents d’expression protéique P53 ont été testés en variant la concentration de galactose dans le milieu.
Les deux orthologs P53 montrent une spécificité de transactivation nettement différente. Ceci est illustré par les résultats avec des éléments de réponse ced13 et V1 qui partagent la même séquence, à l’exception de la présence ou de l’absence d’un espaceur de 28 nucléotides. Human P53 présente une transactivation beaucoup plus élevée avec le site de liaison V1, tandis que C.elegans P53 montre le contraire.
Les résultats sont indépendants du niveau d’expression P53 sous le promoteur galactose-inducible. Mesurer la croissance de la levure en comptant le nombre de colonies obtenues dans la culture des 100 microlitres diminue. Calculer l’effet de réactivation mutante des composés considérant la croissance de type sauvage P53 exprimant la levure comme l’effet maximal possible, fixé à 100%, tandis que la croissance des cellules exprimant mutant P53 représentent zéro niveau de réactivation.
Dans cet exemple, Nutlin-3a soulage l’inhibition du P53 de type sauvage causée par la coexpression de MDM2, tandis que PhiKan083 réactive partiellement le mutant Y220C P53. Dans les deux cas, il en résulte une réduction de la croissance de levure dépendante du P53. Les cellules basales de levure se sont avérées utiles pour étudier les valeurs, aspects des fonctions protéiques P53.
Le protocole décrit dans ce travail est particulièrement sensible pour évaluer le potentiel de transactivation du P53 mutant de type sauvage ou associé au cancer aux variantes des sites cibles. En outre, l’approche peut être utilisée pour identifier les petites molécules affectant les fonctions P53 et pour étudier l’interaction P53 avec le cofacteur. L’utilisation des reporters de couleur, la miniaturisation de la luciferase, ainsi que le test d’inhibition de la croissance aboutit à des analyses rentables et évolutives potentiellement susceptibles de dépistage de la bibliothèque chimique.
Enfin, le système décrit dans ce travail peut être facilement adopté avec l’étude d’autres facteurs de transcription spécifiques à la séquence.
