Ce protocole offre une stratégie rapide et efficace pour utiliser simultanément deux analyses pour filtrer plusieurs centaines de composés pour leurs effets sur la croissance cellulaire. Les analyses peuvent nous fournir des informations sur la question de savoir si des composés spécifiques sont cytotoxiques, inhibent la croissance cellulaire ou améliorent la croissance cellulaire. En utilisant les deux analyses ensemble, nous sommes en mesure d’augmenter la précision et d’identifier les composés cytotoxiques.
Dans les cas où les résultats des deux analyses divergent, cette stratégie peut nous permettre d’identifier le composé avec des effets uniques sur la fonction cellulaire qui peuvent être examinés plus avant par d’autres moyens. Le principal avantage de cette stratégie est qu’elle est rapide, peu coûteuse et non intensive en main-d’œuvre. Une fois maîtrisé, il permet aux chercheurs d’effectuer facilement un écran primaire de jusqu’à 200 composés en une semaine, puis d’effectuer une courbe de réponse de dose exhaustive sur 10 à 15 composés dans une autre semaine.
Rohini Manickam, scientifique du personnel et boursier post-baccalauréat du laboratoire, fera la démonstration de la procédure. Tout d’abord, dans un cabinet de sécurité biologique, les cellules de culture dans un flacon T75 avec milieu NSC de sorte qu’ils seront au moins 80% confluent au début de l’essai. Et placez le flacon dans un incubateur de culture cellulaire fixé à 37 degrés Celsius et cinq pour cent de dioxyde de carbone.
Une fois que les cellules atteignent 80% de confluence, retirez le flacon de l’incubateur et aspirez le milieu NSC. Ajouter trois millilitres de réaccente de dissociation cellulaire et incuber pendant cinq minutes dans l’incubateur. Après l’incubation, ajouter sept millilitres de milieu NSC dans le flacon, et pipette vigoureusement pour s’assurer que toutes les cellules se détachent.
Transférer la solution cellulaire dissociée dans un tube de 15 millilitres et la centrifugeuse à 200 fois G pendant cinq minutes. Retirer le supernatant du tube et suspendre à nouveau les cellules en 10 millilitres de milieu NSC. Utilisez un compteur de cellules automatisé ou un hémocytomètre pour compter les cellules, et ajoutez un milieu NSC dans le tube pour réajuster la concentration des cellules à 200 000 cellules par millilitre.
Ensuite, en utilisant six des huit fentes d’un pipettor multicanal à huit canaux pour plaquer 100 microlitres de la colonne de mélange cellulaire par colonne dans 60 puits intérieurs de trois 96 plaques de puits qui ont été enduits par matrice extracellulaire. Ajouter 100 microlitres de milieu de base ou de milieu NSC à tous les puits sans cellules afin de minimiser l’évaporation potentielle des puits ultrapériphériques contenant des cellules. Sous un microscope à culture cellulaire, inspectez visuellement au moins 10 puits sur chacune des trois 96 plaques du puits pour confirmer que les cellules sont assises à la densité prévue.
Incuber à 37 degrés Celsius et cinq pour cent de dioxyde de carbone. Retirez les plaques de culture cellulaire de l’incubateur 16 à 24 heures après le fractionnement et aspirez la colonne moyenne NSC par colonne avec un pipettor multi-puits à huit canaux, en utilisant seulement six des huit fentes multi-puits. Ajouter 95 microlitres de milieu NSC frais à chaque puits des trois plaques de répétition, et remettre les plaques dans l’incubateur.
Avec un pipettor multi-puits à huit canaux, ajouter 49 microlitres de milieu NSC dans chacun des 60 puits intérieurs d’une plaque de puits vide à fond U, à fond V ou à fond rond de 96 puits. Désécèlez la plaque composée principale préparée. Pipette un microlitre du composé de la plaque principale dans chacun des 60 puits intérieurs contenant nsc moyen, et mélanger le composé dilué trois fois avec un pipettor dessus de banc.
Ensuite, retirez les trois 96 plaques de puits de NSC de l’incubateur et distribuez cinq microlitres du composé dilué dans chaque puits des trois plaques qui contiennent des cellules pour produire une dilution d’un à 1000 pour la concentration composée finale de 10 micromolaires avec une concentration de DMSO de 0,1% cellules d’incubation avec composé pendant 72 heures, et procéder à des analyses de cytotoxicité. Pour effectuer l’analyse de réponse de dose, installez un puits 96. Utilisez la colonne deux pour six répliques de contrôle DMSO, et testez les triplicates de jusqu’à trois composés différents à deux dilutions en série, à six doses, en commençant par une dose élevée de 10 micromolaires.
Diluer quatre microlitres de 100% DMSO ou composé d’essai dans DMSO en 196 microlitres de milieu NSC dans un tube de microcentrifugeuse de 0,5 ou 1,5 millilitre. Ajouter 25 microlitres du DMSO dilué pour contrôler les puits, et 50 microlitres des composés d’essai dilués à leurs puits correspondants. Pipette 25 microlitres de NSC moyens aux puits vides restants dans la partie intérieure de la plaque de puits 96.
À l’aide d’un pipettor multicanal, transférer 25 microlitres du composé des puits de 10 micromolaires vers les cinq puits micromolaires et mélanger au moins cinq fois. Remplacez les pointes de pipette et répétez le processus en mélangeant les rangées restantes pour générer des triplicates à deux dilutions pour un total de six doses pour chacun des composés. Transférer cinq microlitres de chaque dilution dans une nouvelle plaque avec des cellules de culture qui sont testées.
Placez la plaque dans l’incubateur à 37 degrés Celsius et à 5 % de dioxyde de carbone. Une fois que les cellules ont été incubées pendant 72 heures, retirez la plaque de l’incubateur et placez-la à l’intérieur du lecteur de plaque. Ouvrez le logiciel d’imageur pour configurer des fichiers de protocole et d’expérience pour l’étude.
Passez au mode Manuel imager sur Task Manager et cliquez sur Capture Now. Choisissez 96 plaques de puits comme type de navire. Sélectionnez 10 fois pour le grossissement, et la protéine fluorescente rouge 531 et 593 pour l’imagerie tdTomato.
Cliquez sur un puits. Cliquez ensuite sur Autofocus pour concentrer l’image, et Exposer automatiquement pour un temps d’exposition approprié. Ajustez manuellement la mise au point et l’exposition si nécessaire.
Cliquez sur l’icône de la caméra pour capturer l’image. Cliquez ensuite sur Processus Analyser l’image ci-dessus pour continuer à construire le protocole. Et sélectionnez l’onglet Analyse.
À droite de l’image, cliquez sur Analyse cellulaire dans Ajouter l’étape d’analyse et cliquez sur Démarrer. L’image montre les cellules surlignées pour indiquer chaque cellule individuelle. Cliquez sur la sélection Options pour modifier les paramètres afin de mieux sélectionner les cellules en fonction du seuil de fluorescence ou de la taille des cellules.
Si l’imageur compte correctement les cellules, cliquez sur Ajouter étape en bas de l’écran. Cliquez sur l’icône en haut de l’écran pour créer une expérience à partir de l’ensemble d’images. Et sur la fenêtre ouverte, cliquez sur Procédure sous l’onglet Protocole.
Ensuite, dans la nouvelle fenêtre qui s’ouvre, sélectionnez Lire. Cliquez sur Plaque complète pour sélectionner uniquement les 60 puits qui contiennent les cellules. Cliquez sur OK pour enregistrer les modifications.
Cliquez ensuite sur OK dans la fenêtre Procédure. Cliquez sur l’icône Lecture pour exécuter la plaque. Dans l’invite, enregistrer le fichier, puis dans l’invite plaque de chargement, cliquez sur OK. À la fin de l’imagerie, téléchargez les données du nombre de cellules du logiciel imageur sur une feuille de calcul pour analyse.
Dans les deux heures suivant l’achèvement de l’imagerie tdTomato, commencez l’analyse MTT. Pesez 25 milligrammes de MTT et suspendez-le en cinq millilitres de milieu NSC pour faire cinq milligrammes par millilitre de solution de stock MTT. Vortex la solution pendant plusieurs minutes, jusqu’à ce qu’il n’y ait pas de précipités visibles de MTT.
Retirer les plaques de culture cellulaire de l’incubateur et aspirer hors milieu de culture cellulaire. Diluer le MTT de un à 10 dans le milieu frais du NSC et ajouter 100 microlitres du MTT dilué à chaque puits de cellules. Incuber les cellules à 37 degrés Celsius pendant deux heures.
Un précipité violacé est visible à peu près proportionnellement au nombre de cellules dans le puits. Aspirez la solution MTT des plaques et ajoutez 50 microlitres de 100% DMSO à chaque puits. Déposer les assiettes sur un shaker à température ambiante pendant 10 minutes à 400 rPM.
Après cela, transférez la plaque à un lecteur de plaque. Lisez l’absorption de chaque puits à la longueur d’onde prédéfinie de 595 nanomètres et exportez des données vers une feuille de calcul pour analyse, exactement comme pour les données sur le dénombrement cellulaire. L’examen des images de fluorescence de tdTomato a indiqué deux puits discordants pour la toxicité entre le MTT et l’essai de compte de cellules.
Pour un puits, les données sur le dénombrement cellulaire ne laissaient aucune toxicité. Mais les données du MTT l’ont fait. Un autre puits avait surestimé le nombre de cellules par MTT par rapport au nombre de tdTomato, et semblait avoir de plus grandes cellules, tandis que dans les puits où MTT sous-estimait le nombre de cellules par rapport à tdTomato, les cellules semblaient plus petites.
En résumé, l’essai de tdTomato a classé 11 composés comme toxiques, 11 comme inhibiteur de croissance, et un comme amélioration de croissance, avec 34 n’ayant aucun effet apparent sur la croissance cellulaire. L’essai de MTT a classé 13 composés comme toxiques, deux comme inhibiteur de croissance, et un comme amélioration de croissance, avec 41 n’ayant aucun effet apparent sur la croissance cellulaire. Le graphique des cellules viables pour le composé WP1066 montre une courbe relativement plate sans toxicité pour les quatre concentrations les plus faibles.
La courbe tombe rapidement à la dose de cinq micromolaires, et tombe à la toxicité presque complète à 10 micromolaire, ce qui conduit à la dose létale 50 comme 4,4 et 6,0 micromolaire pour l’essai tdTomato et l’essai MTT. Il est essentiel que les composés soient correctement dilués dans l’écran de réponse à la dose afin que la courbe de réponse à la dose correcte soit générée. Les composés identifiés par cette procédure pour affecter la croissance cellulaire peuvent être davantage caractérisés par des analyses fonctionnelles pour identifier des voies de signalisation potentiellement nouvelles qui contrôlent la croissance cellulaire.
Les composés toxiques pour les cellules souches neurales ont été testés comme agents thérapeutiques potentiels pour les cancers du cerveau, tels que le glioblastome et le neuroblastome. Portez toujours des gants et un manteau de laboratoire lorsque vous manipulez des cellules mammifères, du DMSO et du MTT. Éliminez DMSO et MTT selon les directives sur les déchets chimiques de votre établissement.
