Ce protocole peut être utilisé pour mesurer les modèles de respiration chez la souris. Fait important, il peut minimiser l’impact des comportements actifs dans les souches génétiquement modifiées qui peuvent confondre les résultats. Les principaux avantages de cette technique sont qu’elle n’est pas invasive et qu’elle ne nécessite pas l’utilisation de contentions anesthésiques ou induisant le stress.
Commencez par vous assurer que tous les tuyaux et tubes sont reliés à la chambre pléthysmographe barométrique et en connectant un tube d’entrée de gaz et un tube de sortie sous vide directement à la chambre de pléthysmographie barométrique. Pour calibrer le faible débit dans la chambre, réglez le flux dans et hors de la chambre à zéro et retirez le tube d’écoulement dans la chambre. Éteignez le vide et entrez un zéro dans la cellule de l’unité basse pour enregistrer le flux zéro dans la configuration de l’amplificateur 7700 du logiciel pléthysmographe barométrique.
Puis rattacher le tube d’entrée et activer le flux de vide pour calibrer le débit élevé et permettre à 20,93% de gaz azoté équilibré en oxygène de circuler à travers la chambre de pléthysmographie barométrique du mélangeur à gaz. Ensuite, convertissez la valeur d’entrée mesurée à partir du débitmètre à partir de litres par minute en millilitres par seconde et cliquez sur la cellule unitaire élevée pour entrer la valeur en millilitres par seconde. Double-cliquez sur cal élevé, changer l’heure à trois secondes et cliquez sur Mesurer.
Laissez ensuite l’onglet d’installation de l’amplificateur 7700 ouvert pour calibrer les analyseurs métaboliques vers le logiciel de pléthysmographie barométrique. Pour calibrer l’analyseur métabolique, dans le programme de mélangeur de gaz, réglez le mélangeur à gaz à 20,93% d’oxygène et 79,07% d’azote. Et sur l’analyseur métabolique, réglez le niveau d’étalonnage de l’oxygène à 20,93% et le dioxyde de carbone à 0%Retournez le cadran à l’échantillon une fois que les valeurs appropriées ont été saisies sur les analyseurs de gaz pour définir le pourcentage élevé d’oxygène et de dioxyde de carbone faible.
Cliquez sur l’onglet ABCD 4 du logiciel de pléthysmographie barométrique et entrez 20,93 sous l’unité haute de la ligne C2 pour obtenir de l’oxygène. Sous cal élevé, changer l’heure en trois secondes et cliquez sur Mesurer. Entrez zéro sous le cal bas de la ligne C3 pour le dioxyde de carbone.
Ensuite, changez l’heure en trois secondes et cliquez sur Mesurer sous cal faible. Dans le cadre du programme de mélangeur à gaz, changer la valeur de l’oxygène à 10 % et la valeur du dioxyde de carbone à 5 % et attendre plusieurs minutes que le débit de gaz s’adapte à ces valeurs. Sur les analyseurs métaboliques, tournez les boutons d’ajustement pour calibrer le dioxyde de carbone à 5%, en prenant soin de retourner le cadran à l’échantillon une fois que les valeurs ont été calibrées.
Après avoir vérifié que les lectures de l’analyseur sont stables, cliquez sur unité haute sous C3 et entrez cinq pour le dioxyde de carbone. Ensuite, changez le cal élevé en trois secondes et cliquez sur Mesurer. Cliquez sur unité basse sous l’option C2 et entrez 10 pour l’oxygène et cliquez sur cal faible, entrez trois secondes et cliquez sur Mesurer.
Changez le mélangeur à gaz à 20,93% d’oxygène et 79,07% d’azote et attendez plusieurs minutes pour que la chambre s’adapte à ces valeurs. Exécutez régulièrement des étalonnages supplémentaires avec des réservoirs de gaz certifiés pour confirmer que le mélangeur d’écoulement et les analyseurs de dioxyde de carbone oxygène fonctionnent correctement. Lorsque les analyseurs métaboliques ont été calibrés, revérifiez les compteurs d’écoulement reliés à la chambre pléthysmographe barométrique et ajustez le flux d’air dans et hors de la chambre aux taux appropriés pour l’expérience.
Lorsque tous les paramètres ont été appliqués au logiciel de pléthysmographie barométrique, cliquez sur Fermer dans l’onglet Acquisition. Hit Start Acquisition, nommez le fichier et cliquez sur OK pour commencer l’enregistrement. Pour une pléthysmographie barométrique sans restriction, enregistrez le poids et la température corporelle initiale de la souris avant de retourner la souris dans sa cage d’origine.
Attendez 10 minutes pour recueillir les données de fond sur l’oxygène et le dioxyde de carbone de la chambre vide avant de placer la souris dans la chambre. Au cours de la première heure, documentez le comportement de l’animal prenant des notes détaillées qui incluent les valeurs spécifiques de l’entrée et de la sortie de la chambre. À la fin de l’accoutumabilité de la chambre, surveillez les segments de respiration tranquille pendant les 60 prochaines minutes en prenant des mesures de température corporelle toutes les 10 minutes lors de l’utilisation d’un dispositif implantable.
Prenez soin de vous familiariser avec les comportements généraux de la souris afin que les cas de respiration calme sans reniflement, toilettage ou exploration peuvent être identifiés de façon appropriée. À la fin de l’expérience, remettre la souris dans sa cage et bien nettoyer et essuyer l’équipement. Pour une analyse du métabolisme, ouvrez le panneau métabolique dans le logiciel et obtenez la moyenne des 10 premières minutes des niveaux d’oxygène et de dioxyde de carbone à partir du moment où la chambre était vide.
Consultez le panneau d’écoulement du logiciel de pléthysmographie barométrique et cliquez à droite Sur Analyser l’attribut pour définir les paramètres appropriés. Pour un modèle d’analyse de la respiration, confirmez les temps pendant les 15 secondes de respiration tranquille à l’aide de notes sur le comportement des animaux ainsi que le traçage du panneau d’écoulement. Entrez ensuite les temps sous le dialogue parser ouvert à partir de l’onglet analyseur de données et cliquez sur le mode Afficher Parser pour afficher uniquement les segments d’intérêt spécifiques de 15 secondes.
Pour analyser les apnées et le souffle augmenté, dans le fichier d’examen ouvert, quittez le mode vue analyseur et cliquez sur Configuration P3 setup et graph setup pour sélectionner Page View comme type et cinq comme nombre de volets. Entrez moins deux dans la boîte étiquetée basse et deux dans la boîte étiquetée haute pour les mesures d’écoulement en millilitres par seconde et appliquez les modifications. Faites ensuite défiler jusqu’à la marque de 30 minutes sur le panneau de traçage du débit et comptez manuellement les apnées et les respirations augmentées pendant la période de 30 à 60 minutes suivant la mise de la souris dans la chambre.
Pour cette analyse, les périodes de respiration suspendue de plus de 0,5 seconde ou égales à 0,5 seconde sont révélatrices d’une apnée. Les respirations augmentées sont indiquées par une forte augmentation de la trace respiratoire supérieure à 1,25 millilitres par seconde suivie d’une forte diminution inférieure à moins 0,75 millilitres par seconde. Ce tracé représentatif de flux de respiration calme chez une souris de 22 mois est typique d’un modèle dans lequel la respiration est compatible avec aucun comportement respiratoire actif.
Ce modèle respiratoire est d’un segment plus actif au cours duquel les souris exploraient le reniflement de chambre et /ou le toilettage et n’est pas idéal pour le type de collecte de respiration utilisé pour cette méthodologie. Le paramètre choisi pour l’évaluation du modèle possible de différences respiratoires entre les deux points de temps était la fréquence respiratoire, le volume des marées, la ventilation minute, le rapport de temps inspiratoire du volume de marée et le rapport de dioxyde de carbone expulsé par ventilation minute. Une analyse plus poussée a été effectuée avec chacun des quatre segments de référence de 15 secondes pour la fréquence, le volume des marées, la ventilation minute, le rapport de temps d’inspiration du volume des marées et le rapport de dioxyde de carbone expulsé par ventilation minute.
Aucune différence significative entre l’un ou l’autre des points de temps et aucune différence dans la variabilité entre l’un des quatre segments de temps pour n’importe quel modèle de mesure de respiration n’ont été trouvées. La quantification du nombre d’apnées et de respirations augmentées observées pour chaque animal pendant les minutes 30 à 60 du protocole de pléthysmographie barométrique non retenue a révélé que les animaux âgés présentaient un grand nombre d’apnées et la présence de respirations augmentées dans un délai de 30 minutes. Les chercheurs peuvent également utiliser des défis gaziers tels que l’hypoxie ou l’hypercapnie pour documenter tout changement dans le modèle respiratoire résultant d’une intervention ou d’une thérapie.
Cette technique fournit un moyen de caractériser les modèles de respiration chez les petits rongeurs et les souches animales génétiquement modifiées qui peuvent présenter des différences comportementales distinctes.
