L’objectif global de cette procédure est d’améliorer les études secondaires sur la pneumonie bactérienne en fournissant une voie simple et non invasive de l’inoculation bactérienne dans les voies respiratoires inférieures suivie de la récupération bactérienne et la purification de l’ARN pour l’analyse des transcriptions. Ceci sera accompli en anesthésiant d’abord profondément une souris et en insérant une aiguille pliée émoussée préchargée dans la trachée d’une souris qui a été verticalement suspendue des incisives maxillaires. Deuxièmement, à la suite d’une infection réussie, les unités bactériennes formant des colonies sont récupérées par excision et homogénéisation des poumons.
L’homogénéisation pulmonaire qui en résulte est diluée en série et plaquée sur une agar nutritive pour énumérer les unités formant des colonies. Enfin, l’ARN est purifié à partir de l’homogénéisation pulmonaire. Les avantages de cette procédure est qu’elle permet une livraison contrôlée directement dans les voies respiratoires inférieures.
Cela nous permet d’examiner à la fois les contributions combinatoires et individuelles de l’agent pathogène vers l’issue de la maladie. Les progrès récents dans ce domaine ont démontré que la régulation des gènes bactériens peut avoir un rôle important dans la détermination des résultats de l’infection. Cette technique bénéficie de la capacité de récupérer à la fois les FC bactériennes, puis l’ARN.
Une fois que l’ARN est isolé, nous pouvons alors évaluer les contributions de gènes de virulence spécifiques vers l’infection. En outre, cette technique bénéficie d’être non chirurgicale. Cela permet de mettre un minimum de stress sur tous les animaux utilisés dans le cadre de cette procédure et leur permet d’avoir un rétablissement immédiat.
Cette procédure bénéficie de l’utilisation d’équipements de laboratoire communs sans l’utilisation de tout type de cannulas, fils de guidage ou câbles à fibre optique. Les personnes nouvelles à cette technique peuvent lutter dans un premier temps avec l’installation réelle à travers la trachée. Une fois cette technique conceptualisée, elle devient une procédure simple et efficace pour interroger la pneumonie bactérienne secondaire au sein d’un hôte murin.
Avant de commencer la procédure, préparez l’espace de travail avec les fournitures suivantes : une plate-forme d’intubation, une seringue stérile d’un mL, des forceps stériles à pointe émoussée, une aiguille stérile à pointe émoussée de calibre 21 et deux tubes coniques pour ranger la seringue et les forceps. Commencez la procédure en préparant les inoculums pathogènes de sorte que la concentration finale désirée soit obtenue dans un volume de 50 microlitres. Ensuite, à l’aide de gants stériles préparer une aiguille de 1 à 1,5 pouce de 21 jauges à pointe émoussée en la pliant à un angle d’environ 35 degrés.
Après avoir fixé l’aiguille à la seringue, dessiner un coussin d’air de 100 microlitres, suivi de 50 microlitres de l’agent infectieux. Le coussin d’air de 100 microlitres assure la pleine livraison de la charge pathogène une fois que la seringue est déprimée. Placez l’aiguille et la seringue chargées dans un endroit facilement accessible par la main dominante.
Retirer et anesthésier la souris de la chambre d’anesthésie et suspendre la souris sur la plate-forme d’intubation des incisives maxillaires. À l’aide des forceps à pointe émoussée, saisir délicatement et étendre la langue. Transférer la langue des forceps dans le pouce et l’index de la main non dominante.
Maintenez la langue dans la main non dominante et prenez la seringue préchargée. Pointez l’extrémité pliée de l’aiguille loin du corps. Insérer l’aiguille dans la cavité buccale.
À la base de la langue, inclinez doucement le poignet pour provoquer une légère poussée de l’aiguille loin du corps. Cette action garantit que l’aiguille sera insérée dans la trachée et non dans l’œsophage. Guidez lentement l’aiguille vers le bas dans la trachée.
Souvent, une légère tique se fait sentir lorsque l’aiguille traverse le pli vocal. Passer l’aiguille à travers la trachée jusqu’à ce qu’une légère résistance se fait sentir lorsque l’aiguille rencontre la carina. Soulevez légèrement l’aiguille dans la direction ascendante pour suspendre l’aiguille au-dessus de la carina.
Cela permet la livraison dans les bronches primaires. Déprimez complètement le piston de seringue pour livrer la charge infectieuse. Retirer l’aiguille de la trachée et jeter.
Retirez la souris de la plate-forme d’intubation en déprimant l’élastique, mais maintenez la souris en position verticale. Obstruer les voies respiratoires nasales en plaçant un doigt directement au-dessus des nares. Maintenez cette position pendant environ une minute ou jusqu’à ce que plusieurs respirations profondes soient observées.
Cette dernière étape garantit que le volume total d’inoculum est livré dans les voies respiratoires inférieures. Retournez l’animal dans sa cage et assurez-vous qu’il y a un rétablissement rapide de l’anesthésie. À certains moments, après l’infection, les poumons infectés peuvent être excisés pour quantifier et évaluer les contributions bactériennes à l’augmentation des morbidités associées à la pneumonie bactérienne secondaire.
Préparez un espace de travail avec les éléments suivants : balance et bateau de pesage stérile, plate-forme de dissection, kit de dissection contenant ciseaux et forceps, et gaze stérile. Pour les besoins de cette démonstration, l’excision des poumons sera effectuée sur un banc. Cependant, afin de maintenir la stérilité tout au long de cette procédure, il est recommandé que l’excision pulmonaire soit effectuée dans un capot d’écoulement laminaire.
Euthanasier une souris infectée avec du CO2 ou une méthode d’euthanasie approuvée par l’IACUC similaire. Placez et fixez la souris infectée sur la plate-forme de dissection. Vaporiser la souris d’éthanol pour maintenir la stérilité sur les surfaces de travail.
À partir de l’ombilicus, utilisez une paire de forceps pour soulever la peau et faire une incision vers le larynx. Saisir la peau de chaque côté de l’incision initiale, tirer la peau loin du corps et couper à travers les connexions tissulaires. Il peut être utile de faire des coupes latérales à travers la peau pour révéler plus de la région thoracique.
À partir de la base du processus xiphoïde, faire une petite incision avec l’intention de percer le diaphragme. Il en résulte une augmentation de la pression dans la cavité thoracique provoquant la rétractation des poumons. Avec les poumons rétractés, continuer l’incision pour libérer le diaphragme.
Retirer les côtes en faisant une incision de chaque côté. Cela exposera la cavité thoracique et les poumons. Pour exciser les poumons saisir la base du cœur avec les forceps et soulever vers le haut.
Placez les ciseaux derrière les poumons et commencer à faire de petites incisions à travers les connexions tissulaires tout en continuant à soulever le cœur vers le haut. Une fois que les poumons ont été excisés, placez-les sur une gaze stérile et retirez le cœur en le soulevant des poumons et en coupant les connexions tissulaires restantes. Transférez les poumons sur le bateau de peser pré-goudronné et enregistrez la masse.
Une fois que les poumons ont été pesés, transférez les poumons dans une solution saline stérile tamponnée de phosphate et rangez-les temporairement sur la glace. Maintenant que les poumons ont été excisés et pesés, les bactéries peuvent être récupérées pour déterminer leur rôle vers la pathogénie. En préparation de la récupération bactérienne, les fournitures suivantes seront nécessaires : un broyeur de tissus, un PBS stérile sans RNase, un RLT tampon complété par du bêta-mercaptoéthanol et des tubes de microcentrifugeuse sans RNase de 1,5 mL.
Commencez par ajouter d’abord un mL de PBS stérile sans RNase au broyeur de tissu. Une fois rempli, conserver le broyeur de tissu sur la glace. Ensuite, préparez une série de tubes stériles de dilution en série sans RNase pour quantifier la charge bactérienne récupérée des poumons infectés.
Transférer les poumons dans le broyeur de tissu préparé et bien homogénéiser le tissu en appuyant sur le piédestal tout en tournant. Ouvrez le broyeur de tissu et aliquot 100 microlitres de l’échantillon homogénéisé dans le premier des tubes de dilution en série préparés. Diluer en série les échantillons et les plaques sur l’agar nutritif pour énumérer les unités formant la colonie.
Les FC peuvent être enregistrés sous forme d’FC par mL ou cfus par mL, par milligramme de tissu pulmonaire. Après l’enlever l’aliquot de 100 microlitres, remplacez le piédestal broyeur et centrifugez l’échantillon à 4000 rpm pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Lorsque la centrifugation est terminée, retirer le supernatant de l’échantillon granulé.
Le surnatant peut être enregistré et stocké à moins 80 degrés Celsius pour une analyse plus approfondie à une date ultérieure. Suspendre à nouveau la pastille tissulaire homogénéisée dans 700 microlitres de bêta-mercaptoéthanol RLT et transférer l’échantillon dans un tube stérile de centrifugeuse de 1,5 mL sans RNase. À ce stade, l’échantillon peut être stocké à moins 80 degrés.
L’ARN peut être purifié à partir du lisier homogénéisé pulmonaire RLT en chargeant l’échantillon dans un tube de microcentrifugeuse de deux mL contenant des perles de silice de 1 millimètre et traité par un batteur de perles pendant 20 secondes à six mètres par seconde. L’ARN est alors immédiatement purifié à l’aide d’une adaptation de la méthode RNeasy telle que rapportée dans Voyich, et autres. Methods in Molecular Biology"2008, et décrit dans le manuscrit accompagnant cette vidéo.
Après purification, le rendement en ARN peut être quantifié à l’aide d’un spectrophotomètre. Une fois quantifié, il est bénéfique de diluer l’ARN résultant en plusieurs aliquots de 50 nanogrammes par microlitre. Cela permet à l’ARN de l’échantillon d’être utilisé pour de multiples analyses sans être soumis à plusieurs cycles de gel-dégel.
L’utilisation de cette technique permet l’installation d’une charge agent pathogène contrôlée directement dans les voies respiratoires inférieures. L’efficacité de ce système de livraison peut être démontrée par l’installation d’une solution bleue brillante coomassie à 1%. La rangée supérieure affiche une paire de poumons non infectés pour servir de contrôle, tandis que la rangée inférieure affiche une paire de poumons qui ont reçu 50 microlitres de la teinture bleue brillante Coomassie 1% grâce à une installation intratracheal.
L’utilisation de ce colorant montre comment l’installation intratracheal fournit une distribution uniforme de la charge pathogène dans et dans les poumons gauche et droit. Une fois infectée, la charge pathogène peut être récupérée et analysée à divers moments après l’installation intratrachéale par excision et homogénéisation du tissu pulmonaire. Pour démontrer l’efficacité de cette technique de rétablissement, deux groupes contenant trois souris chacune ont été infectés par une dose faible et élevée de Staphylococcus aureus.
L’entrée bactérienne a été plaquée sur l’agar nutritif pour énumérer les FC. Une heure après l’installation intratrachéale, les souris ont été euthanasiées, les poumons excisés et homogénéisés dans un broyeur de tissu. Le tissu homogénéisé a été dilué en série et plaqué sur une agar nutritive pour énumérer les FC.
L’ARN isolé du tissu pulmonaire homogénéisé peut être examiné par transcriptase inverse PCR et utilisé pour quantifier l’abondance relative de transcription des gènes cibles. Pour assurer une contamination minimale de l’ADN de fond, il est recommandé qu’une réaction PCR, sans ajout de transcriptase inverse, soit exécuté à côté de toute réaction qRT-PCR. En plus des charges bactériennes, cette technique peut être étendue à l’installation et à l’isolement des charges virales.
Après l’homogénéisation du tissu pulmonaire, l’ARN viral peut être isolé et utilisé pour mesurer l’abondance de transcription des gènes viraux ou construire une courbe standard pour la quantification virale. L’utilisation de ce système fournit un système hautement efficace et reproductible pour étudier la pneumonie bactérienne secondaire. Une fois maîtrisée, cette procédure peut être utilisée dans des expériences à grande échelle.
Travaillant en lots pour euthanasier les souris, l’installation intratracheal peut se produire dans les 30 secondes par souris. Une fois cela terminé, passant à l’excision des poumons, cela peut être complété en environ deux à trois minutes par souris. Bien que les méthodes discutées ici aient été dans le contexte d’une infection bactérienne secondaire, elles peuvent être étendues à n’importe quelle procédure où une livraison contrôlée et la récupération d’un inoculum sont nécessaires.
En plus des méthodes décrites ici, cette procédure peut être complétée par l’ajout d’un lavage bronchoalveolar avant l’excision des poumons. Bien que cela entraîne souvent une diminution de la récupération de la charge pathogène, il bénéficie de l’obtention de données, telles que l’analyse de cytokine, l’activité de déshydrogénase lactate, et l’identification de différentes populations cellulaires. Pour mieux comprendre la pathogénie de la maladie, il devient important d’interroger les contributions de l’hôte et des pathogènes à la maladie.
Le but de cette vidéo était de fournir une méthode simple et efficace pour explorer la pneumonie bactérienne secondaire dans un hôte murin.
