Ce protocole fournit un modèle reproductible de pneumonie qui génère une lésion pulmonaire aiguë robuste. D’autres avantages de ce modèle sont qu’il peut être utilisé pour reproduire le SDRA infectieux ou le syndrome de détresse respiratoire aiguë chez la souris. Comme je l’ai mentionné, ce modèle est hautement reproductible où le niveau de mortalité et de blessure peut être facilement ajusté pour évaluer les phases précoces et tardives des lésions pulmonaires aiguës et leur résolution, ce qui sert de plate-forme pour évaluer les stratégies thérapeutiques.
Bien que ce protocole ne fournisse pas d’approche novatrice pour le diagnostic ou le traitement des lésions pulmonaires, il s’agit d’un modèle fiable où de nouvelles thérapies peuvent être testées, ce qui est particulièrement utile dans les domaines liés à l’immunologie, aux maladies pulmonaires et aux maladies infectieuses. L’un des avantages de cette technique est sa reproductibilité. Cependant, les personnes qui pratiquent cette technique pour la première fois peuvent rencontrer des difficultés pour insérer le cathéter par voie intratrachéale.
C’est pourquoi, idéalement, les personnes qui apprennent cette technique devraient commencer à pratiquer chez les animaux euthanasiés. Pour commencer, réchauffez une plaque de gélose au sang pendant 10 minutes à 37 degrés Celsius dans un shaker ou un incubateur chauffé. Prenez un nouveau flacon bactérien du congélateur et décongelez-le en l’agitant doucement dans un bain-marie à 37 degrés Celsius jusqu’à ce que le flacon soit complètement décongelé.
Évitez de toucher le joint torique ou le capuchon avec de l’eau tiède. Pour compter manuellement les colonies bactériennes sur une plaque, effectuez une dilution 1 fois 10 puissance six et une plaque de 200 microlitres de la dernière dilution sur une plaque de gélose au sang préchauffée. Incuber l’assiette toute la nuit à 37 degrés Celsius.
Le lendemain, déterminez la nouvelle concentration bactérienne en appliquant la formule donnée. Placez la souris anesthésiée sur une surface propre et stérilisée. Accrochez la souris par les incisives et collez doucement les membres antérieurs.
Rasez la région du cou et désinfectez la zone avec de la chlorhexidine et de l’alcool à 70 %. Ensuite, à l’aide de ciseaux chirurgicaux, faites une incision d’un centimètre, superficielle-médiane du cou pour visualiser la trachée. Si une abondance de tissu adipeux est observée, disséquez soigneusement le tissu adipeux verticalement pour visualiser la trachée.
Tirez doucement la langue vers l’extérieur et introduisez un angio-cathéter de calibre 20 dans la bouche, en faisant avancer le cathéter dans la trachée. Appliquez une légère pression sur la trachée pour faciliter l’intubation. Après l’intubation, connectez la souris à un respirateur pour confirmer l’intubation.
Réglez les paramètres du ventilateur sur 200 microlitres de volume courant et 200 coups par minute. Après avoir confirmé l’intubation, débranchez la souris du respirateur et instillez soigneusement 50 microlitres de l’agent bactérien à travers l’angiocathéter à l’aide d’une pipette de 200 microlitres, embout de chargement de gel. Après l’installation, connectez à nouveau la souris au respirateur pour aider à redémarrer la respiration.
Laissez la souris sur le respirateur pendant 30 à 60 secondes pour surveiller la respiration. Si une respiration lente est observée, connectez à nouveau la souris au respirateur. Fermez l’incision en ajoutant une goutte de colle sur la peau.
Rassemblez les plis de la peau et appliquez une légère pression jusqu’à ce que la colle sèche. Posez la souris euthanasiée en décubitus dorsal sur une planche chirurgicale propre et suspendez-la par les incisives. Après avoir pulvérisé la peau de la souris avec de l’éthanol à 70%, à l’aide de ciseaux, faites une petite excision superficielle du cou sur la ligne médiane pour visualiser la trachée.
Canulez la trachée à l’aide d’un cathéter de calibre 20 et ajoutez soigneusement un millilitre de PBS sans calcium par voie intratrachéale à l’aide d’une seringue d’un millilitre. Laissez l’expansion pulmonaire complète, puis aspirez le liquide à l’aide de la même seringue. Répétez la procédure deux fois pour un total de deux millilitres.
Transférez le lavage broncho-alvéolaire, ou BAL, dans une aliquote de deux millilitres. À l’aide de ciseaux, ouvrez la cavité thoracique pour exposer le poumon, le cœur et la trachée. Disséquez soigneusement le diaphragme et retirez la cage thoracique en veillant à ne pas pincer le tissu pulmonaire.
Transect de l’aorte abdominale pour permettre l’exsanguination. Perfuser le tissu pulmonaire en faisant une petite incision d’environ un à deux millimètres dans le ventricule droit à l’aide de ciseaux et en injectant cinq millilitres de PBS froid, à l’aide d’un cathéter de calibre 20. Une fois la perfusion réussie, le tissu pulmonaire devient blanc et pâle, et le PBS quitte le compartiment intravasculaire par l’aorte abdominale.
Ensuite, extrayez soigneusement le poumon et disséquez-le de la trachée. Alternativement, si le poumon est utilisé pour l’histologie, insérez soigneusement un cathéter de calibre 20 pour gonfler les poumons jusqu’à 25 centimètres avec une solution de formol. Une fois les poumons insufflés, passez un cordon de suture 3/O d’environ cinq centimètres de long sous la trachée et attachez-le fermement deux fois pour vous assurer que le formol reste dans le tissu pulmonaire.
Disséquez doucement le poumon du reste des tissus et placez-le dans un tube conique de 15 millilitres contenant 10 millilitres de solution de formol. Centrifugez le BAL à 500 G à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes et retirez le surnageant acellulaire dans un tube séparé. Lysez les globules rouges en ajoutant 100 microlitres de tampon de lyse pendant une minute.
Neutralisez la réaction de lyse en ajoutant un millilitre de PBS. Centrifuger la BAL, et retirer le surnageant avant de remettre la pastille en suspension dans 100 à 300 microlitres de PBS. Ensuite, effectuez un comptage cellulaire avec 0,4 % de colorant bleu trypan par comptage cellulaire automatisé.
Disséquez doucement le poumon des tissus dans un tube conique de 15 millilitres contenant cinq millilitres de PBS froid. Après la dissection, retirez le poumon du PBS et séchez-le à l’aide d’une serviette en papier. Disséquez les poumons droit et gauche d’autres tissus qui ont également été extraits, tels que la trachée.
Préparez un cocktail de digestion comme décrit dans le manuscrit du texte et transférez le poumon dans un tube C contenant un millilitre de cocktail de digestion. Transférez le tube dans le dissociateur tissulaire et suivez le protocole standardisé pour le traitement du tissu pulmonaire. Après dissociation, ajoutez 10 millilitres de PBS froid dans le tube et mélangez correctement.
Filtrez la suspension à cellule unique à l’aide d’une crépine à cellules de 70 microns sur un tube conique de 50 millilitres sur de la glace. Centrifuger la suspension et retirer le surnageant. Ajoutez un millimètre de tampon de lyse pendant une minute à température ambiante.
Ajoutez ensuite 10 millilitres de PBS froid pour arrêter la réaction de lyse et éliminer le surnageant. Remettez les cellules en suspension dans le PBS et effectuez un comptage cellulaire avec coloration au bleu de trypan par comptage automatisé des cellules. Après des lésions pulmonaires induites par une pneumonie bactérienne chez les souris, les groupes infectés présentaient un poids corporel inférieur à celui du témoin non infecté.
Le groupe streptococcus pneumoniae ou Spn a récupéré son poids corporel vers la ligne de base, tandis que les souris infectées par Klebsiella pneumoniae, ou Kpn, ont montré une récupération lente après six jours d’infection. La concentration en protéines BAL et le nombre total de cellules pour le BAL et les poumons étaient nettement plus élevés dans les groupes infectés. Des coupes histologiques représentatives montrant le processus inflammatoire dans les deux modèles ont été obtenues aux deuxième, quatrième et sixième jours après les inoculations, montrant des signes d’inflammation alvéolaire persistante chez les souris infectées par Kpn, même au 10e jour.
Les souris infectées par Kpn ont continué à causer des lésions au 10e jour, tandis que les souris infectées par le Spn ont résolu l’inflammation pulmonaire au sixième jour. Le paysage immunocellulaire par cytométrie en flux multicolore après six jours d’infection par Spn a montré une augmentation du nombre de granulocytes, de macrophages interstitiels, de monocytes, de cellules B et de cellules T, y compris les cellules tueuses naturelles. Lors de l’essai de cette méthode, l’insertion du cathéter est la clé pour avoir des infections reproductibles.
Il s’agit d’une méthode fiable qui sert de plate-forme pour l’identification de cibles pour l’étude des lésions pulmonaires aiguës et leur résolution.
