Les particules de lipoprotéine sont des véhicules de transport indigènes. L’enrichissement de substances étrangères facilite leur utilisation comme transporteur de voies. L’étiquetage spécifique des molécules ou des particules entières permet de mesurer l’absorption cellulaire.
Les deux méthodes d’enrichissement sont rapides et faciles à utiliser, et peuvent être adaptées pour un large éventail de substances. Markus Axmann et Andreas Karner, deux postdocs de mon labo, feront la démonstration de la procédure. Pour commencer la délipidation dans un capot de fumée, mélangez un à deux millilitres de solution HDL préparée contenant cinq milligrammes de particules HDL avec 50 millilitres de mélange pré-refroidi de trois à deux mélanges d’éther de détyle d’éthanol dans un tube de centrifugation conique.
Incuber pendant deux heures à 20 degrés Celsius négatif. Centrifugeuse à 2500 fois g pendant 10 minutes à 10 degrés Celsius négatifs. Jetez le supernatant, resuspendez la pastille en 50 millilitres de mélange d’éther de détyle d’éthanol pré-refroidi, et vortex brièvement.
Incuber une deuxième fois pendant deux heures à 20 degrés Celsius négatifs. Centrifugeuse à nouveau à 2500 fois g pendant 10 minutes à 10 degrés Celsius négatifs. Insérez ensuite des tubes qui fournissent le flux de gaz azoté pour sécher la pastille.
Et le resuspendre en 250 microlitres de tampon A.Déterminer la concentration de protéines en utilisant l’analyse de la protéine Bradford ou un autre approprié. Il est essentiel d’éliminer les restes du mélange d’éther de diéthyle d’éthanol, car ces solvants inhiberaient la relipidation des apolipoprotéines. Ensuite, diluer à une concentration finale d’un milligramme de protéines par 250 microlitres de tampon A.Insérer un tube fournissant du gaz inerte dans la partie solution dans le tube.
Au besoin, conserver la solution pendant la nuit à quatre degrés Celsius sous l’atmosphère inerte du gaz. Pour commencer la reconstitution, dans un tube de verre propre, mélanger 100 microlitres de CO, 13,5 microlitres de C et 500 microlitres de PC. Faites ensuite pivoter le tube de verre tout en rinçant le gaz azoté à l’intérieur du tube pour sécher le mélange afin de produire une couche de surface homogène. Dans un tube de réaction de 0,5 millilitre, préparer une solution de spermine fraîche de 30 millimlaires dans le tampon A.Then mélanger 100 microlitres de microARN synthétique de 10 micromlaires avec 100 microlitres de solution spermine dans un tube de réaction de deux millilitres.
Et incuber pendant 30 minutes à 30 degrés Celsius. Ensuite, transférez la solution incubée de 200 microlitres dans le tube de verre pour réhydrater la couche de surface préparée du mastermix PC-CO-C. Et puis ajouter 50 microlitres d’une solution de désoxycholate de sodium de 30 millilitres par millilitre.
Remuer à quatre degrés Celsius pendant deux heures. Après cela, ajouter 250 microlitres de la solution HDL délipidée dans le tube de verre. Et remuer à quatre degrés Celsius pendant la nuit.
Pour commencer la dialyse, ajoutez d’abord 50 grammes de perles adsorbentes à 800 millilitres d’eau double distillée. Et utilisez un agitateur magnétique pour remuer pendant une minute. Attendez 15 minutes pour que les perles se déposent et décantent le surnatant.
Répétez la procédure avec du PBS pré-refroidi. Cassettes de dialyse pré-humides en PBS. Utilisez une seringue pour ajouter le mélange préalablement préparé dans les cassettes selon les instructions du fabricant.
Ajouter les perles adsorbent traitées par PBS à trois litres de PBS et placer les cassettes dans le PBS pour les dialyser à quatre degrés Celsius. Les perles maintiennent le gradient de densité le long de la membrane de dialyse constante. Changer le tampon et les perles après une heure et deux heures.
Après 24 heures, avec une seringue, extraire la solution de la cassette dans un tube de réaction de 1,5 millilitre pour récupérer la solution de particules HDL reconstituée. Déterminer la concentration de protéines à l’aide de l’analyse bradford. Fournissez du gaz inerte au tube de réaction, scellez-le et stockez la solution de particules HDL reconstituée sous une atmosphère de gaz inerte à quatre degrés Celsius.
Tout d’abord, préparer une solution de spermine fraîche de 30 millimlaires dans de l’eau sans RNAse. Mélangez 100 microlitres de 10 micromolaires de microARN synthétique avec 100 microlitres de solution spermine dans un tube de réaction de deux millilitres. Et incuber pendant 30 minutes à 30 degrés Celsius.
Ajoutez ensuite 100 microlitres de DMSO et 1,2 millilitres de tampon 1X LDL à la solution de spermine microARN préparée. Diluer la solution de particules LDL préparée précédemment avec PBS à une concentration finale d’environ quatre milligrammes par millilitre. Puis dessiner 450 microlitres de la solution diluée dans un tube de réaction de 1,5 millilitre, et mélanger avec 50 microlitres de tampon LDL 10X.
Incubez-le pendant 10 minutes sur la glace. Après l’incubation, combinez la solution de particules LDL de 500 microlitres et la solution microARN-spermine-DMSO de 1,5 millilitre, et incubez-la pendant deux heures à 40 degrés Celsius. Effectuez une dialyse similaire à celle décrite précédemment et stockez la solution de particules LDL étiquetée sous atmosphère de gaz inerte à quatre degrés Celsius.
Pour commencer, diluer la solution de particules HDL ou LDL dans PBS entre un à 100 et un à 1000. Fendre le mica en appuyant sur le ruban adhésif contre le substrat de mica, et en tirant le ruban pour enlever les couches supérieures de mica. Utilisez une pipette pour déposer deux microlitres sur du mica fraîchement fendue pour incuber pendant cinq minutes.
Les particules de lipoprotéine ont tendance à former des membranes de liaison continues sur les surfaces. Par conséquent, il est important d’ajuster la concentration de particules sur la surface du mica pour obtenir des concentrations individuelles. Après l’incubation, rincer l’échantillon avec du PBS.
Remplissez la cellule liquide AFM à grande vitesse avec PBS et montez le scanner porteur de mica jusqu’au stade afm à grande vitesse. Dans le logiciel de contrôle, démarrer le processus d’approche du porte-à-faux à la surface mica. Utilisez des tailles d’analyse inférieures à un micromètre carré et maintenez les forces d’imagerie aussi faibles que possible.
Imagez l’échantillon en mode taraudage. Chargez les données dans le Gwyddion et détectez les particules via les grains de marque par fonction de seuil. Ajustez la valeur du seuil de hauteur pour masquer les particules individuelles.
Habituellement, un niveau d’environ 50% est un bon point de départ. Supprimez l’arrière-plan polynomial pour aplatir l’image et activez l’option exclure la région masquée. Exportez les valeurs maximales de hauteur des particules détectées en utilisant la distribution de diverses caractéristiques céréalières et répétez ces étapes pour toutes les images enregistrées.
Dans cette expérience, la reconstitution des particules de HDL a été exécutée par la délipidation des particules de HDL, suivie de la relipidation et de la dialyse. Un rendement de 50 % des particules HDL reconstituées peut être atteint. Cependant, le même étiquetage avec microARN n’était pas faisable pour l’étiquetage des particules de LDL, en raison de l’hydrophobicité de la protéine B100 d’apolipoprotéine.
Ainsi, DMSO a été utilisé pour la pénétration de la monocouche lipidique des particules LDL, avec un rendement proche de 100% Pendant le contrôle de la qualité, la dilution est critique pour l’analyse. L’image du haut montre une densité de particules trop élevée. L’image du bas convient à l’analyse.
Les fonctions de densité de probabilité des hauteurs de particules ont été calculées pour la comparaison des distributions de taille des particules lipoprotéines de contrôle indigènes, étiquetées et étiquetées. Le changement relatif avant et après la procédure d’étiquetage est négligé. Lorsque vous manipulez des oligonucléotides d’ARN, travaillez sans RNAse.
Utilisez des consommables en plastique jetables frais et portez toujours des gants. N’utilisez que des solutions sans nucléase. L’AFM à grande vitesse n’est qu’une méthode pour déterminer la forme générale des lipoprotéines.
Une autre méthode serait la microscopie électronique. Portez l’équipement approprié de protection personnelle, et travaillez dans une hotte de fumée tout en manipulant l’éther de dithyle.
