Cette étude a été financée par des fonds de Rita Allen subvention de la Fondation à Seena Ajit. Les auteurs tiennent à remercier Erika Balogh et le Dr Soumitra Ghoshroy de l&#39;Université de Caroline du Sud Electron Microscopy Center pour l&#39;utilisation de l&#39;instrument, une assistance scientifique et technique.

Toutes les expériences utilisant des échantillons de sang de l&#39;homme et les rongeurs ont été exécutés en conformité avec toutes les directives, les règlements et les organismes de réglementation. Les sujets humains ont été inscrits après avoir donné un consentement éclairé, tel qu&#39;approuvé par la Drexel University College of Institutional Review Board médecine et de toutes les procédures pour les études effectuées sur des animaux ont été approuvés par Institutional Animal Care Drexel et utiliser Comité. 1. Purification Exosome de sang (~ 5,5 h) CONSEILS <ul><li class="jove_content"> Nous remettre en suspension exosomes d&#39;un tube de sang (~ 10 ml de sang humain et approximativement 2 ml de sang de souris) dans 300 pi de tampon de lyse ARN du kit d&#39;isolation de miARN mirvana. </li><li class="jove_content"> Pour purifier exosomes de milieux de culture de cellules, les médias est filé à 500 g pendant 10 min pour éliminer les cellules et également filtrée à travers un filtre après centrifugation à 12.000 x g 0,22 um. La purification d&#39;exosomes des milieux de culture de cellulesn&#39;a pas besoin d&#39;une dilution en PBS, le lavage PBS ou la seconde étape d&#39;ultracentrifugation. </li><li class="jove_content"> Si les exosomes purifiés seront utilisées pour les études de protéomique, l&#39;ajout d&#39;une étape de centrifugation de gradient de saccharose après l&#39;étape d&#39;ultracentrifugation va diminuer la quantité d&#39;agrégats de protéines et de contaminants 15. </li><li class="jove_content"> La morphologie observée des exosomes peuvent différer en fonction de la source et les étapes de traitement pour les TEM. Nous n&#39;avons pas observé la morphologie en forme de coupelle pour exosomes qui a été précédemment attribuées à des différences dans le traitement de l&#39;échantillon 9,15. Nos images TEM, y compris l&#39;étiquetage immunogold sont similaires aux précédents rapports provenant de différentes sources, y compris le sang, biliaire et culture cortical dérivé exosomes 9,16,17. </li></ul><ol><li> Inversez tube revêtu d&#39;EDTA contenant le sang 5x et placez-les debout à la température ambiante pendant 10-60 min. </li><li> Centrifuger à 2000 xg pendant 15 min à 4 ° C. </li&gt; <li> Recueillir la couche supérieure, le plasma, dans des tubes de 15 ml et garder sur la glace. </li><li> Diluer fluide avec un volume égal de PBS. Centrifuger 30 min à 2000 x g à 4 ° C. </li><li> Transfert à centrifuger les tubes, ajouter 1X PBS pour un volume total de 24 ml et centrifuger 45 min à 12000 g à 4 ° C. </li><li> Transfert à l&#39;ultracentrifugation tubes et centrifuger 2 heures à 110,000 xg à 4 ° C. </li><li> Remettre le culot dans du PBS et centrifuger 1 heure à 100.000 xg à 4 ° C. </li><li> Remettre le culot dans un tampon approprié (tampon de lyse ARN). </li><li> Remettre en suspension dans un tampon PBS ou RIPA pour la microscopie électronique et analyse western blot, respectivement. </li></ol> 2. Purification d&#39;ARN Utilisation d&#39;un kit d&#39;isolation miARN mirvana modification (~ 1 heure) CONSEILS <ul><li class="jove_content"> Préparer la zone d&#39;isolement de l&#39;ARN en portant des équipements de protection individuelle (EPI), essuyer les surfaces et les pipettes avec RNase Zap, et en utilisant des conseils et des tubes filtrants stériles. </li><liclass = &quot;jove_content&quot;&gt; Bien que le protocole du fournisseur donne la possibilité de purifier seulement miRNA, nous isolons toujours ARN total, y compris l&#39;ARNm et Mirna afin que nous puissions étudier à la fois à partir du même échantillon. </li><li class="jove_content"> L&#39;ajout d&#39;une étape de traitement à la DNase sur la colonne élimine les traces d&#39;ADN susceptibles d&#39;être présents. Selon la source des exosomes, l&#39;ADN a été signalé à être absent dans exosomes purifiés à partir des sources, y compris souris et des lignées cellulaires humaines de mât 8, mais des séquences d&#39;ADN chromosomiques ont été détectées dans les exosomes purifiés à partir du support de cardiomyocytes cultivés 18. </li><li class="jove_content"> Nous avons réduit le volume de solution de lavage de 1 à 350 de pi (étape 2.4 ci-dessous) parce que le vendeur fournit juste assez Laver solution 1 pour un 700 plus ul. Si le volume n&#39;est pas qu&#39;il n&#39;y a pas suffisamment de solution disponible pour utiliser la totalité du contenu du kit. Les étapes suivantes ont été réalisées selon les recommandations du fabricant. </li></ul><ol><li> Ajouter 1/10 volume des miRNA Additif Homogenate (30 pi) et incuber sur de la glace pendant 10 min. </li><li> Extraire avec un volume d&#39;acide-phénol: chloroforme égal au volume initial de lysat. Centrifuger et récupérer la phase supérieure dans un nouveau tube. </li><li> Ajouter 1,25 volumes d&#39;éthanol à 100% (375 pi). Vortex. Appliquer au filtre à cartouche et centrifuger 15 sec à 10.000 x g. </li><li> Ajouter la moitié du volume de la solution de lavage des miARN recommandé 1 (350 pi) et centrifuger 15 sec à 10.000 x g. </li><li> Ajouter 10 ul DNase 1 à 70 pi de tampon RDD (Qiagen) pour chaque échantillon. Ajouter 80 ul de colonne et incuber 15 min à température ambiante. </li><li> Ajouter la solution de lavage 1 (350 pi) et centrifuger 15 sec à 10.000 x g. </li><li> Ajouter la solution de lavage 2/3 (500 pi) et centrifuger 15 sec à 10.000 x g. REPEAT. </li><li> On élue avec 40 pl 95 ° C sans nucléase H 2 O. </li><li> Déterminer la concentration de l&#39;ARN et diluer l&#39;ARN à 100 ng / ul. </li></ol> 3. miRNA profilage des exosomes de Blood Avec Taqman Low Density Array (TLDA) Cartes (~ 6,5 h) CONSEILS <ul><li class="jove_content"> Préparer la zone d&#39;isolement de l&#39;ARN en portant PPE, essuyer les surfaces et les pipettes avec RNase Zap, et en utilisant des conseils et des tubes filtrants stériles. </li><li class="jove_content"> Étape de pré-amplification (préampli) est recommandé pour 1-350 ng ARN (350-1,000 échantillons ng ne nécessitent pas l&#39;étape de pré-ampli après synthèse de l&#39;ADNc). Il est important de déterminer si les pré-ampli est nécessaire pour votre échantillon parce que vous devez traiter tous les échantillons dans des conditions égales. Étape de pré-ampli ajoute le coût et les valeurs de Ct avoir un hors coupe acceptable inférieure (32 au lieu de 40). </li><li class="jove_content"> Il est utile de préparer la réaction d&#39;ADNc dans des tubes de la bande au lieu d&#39;une plaque en fonction du nombre de cartes qui peuvent être exécutés en une seule journée. Cela permettrait de minimiser gel-dégel des échantillons d&#39;ADNc qui ne seront pas traitées le jour même. </li><li class="jove_content"> Les exosomes provenant de différentes sources ont diffélouer quantités d&#39;ARN. Ce protocole permet à un maximum de 3 pi matrice d&#39;ARN pour la réaction de synthèse de l&#39;ADNc. Selon la source, la quantité d&#39;ARN exosomales qui peut être isolé peut-être limitée. Alors un tissu typique donnerait suffisamment d&#39;ADNc d&#39;ARN qui serait faite à partir de 100 ng d&#39;ARN dans le volume 3 pl, exosomes à partir de sang humain ou de milieux de culture de cellules humaines contiennent souvent moins d&#39;ARN et d&#39;ADNc doit être faite à partir de moins de matériau de départ. Souris exosomes de sang contiennent des niveaux élevés d&#39;ARN et d&#39;au moins 100 ng à 3 pi peuvent être obtenues. </li></ul><ol><li> Pour préparer l&#39;ADNc à partir d&#39;ARN utilisant des pools Megaplex purifiée inverser amorces transcriptase (groupe A et groupe B contient des amorces pour les miARN sur les cartes microfluidiques module A et B), dégeler les composants de la réaction sur la glace. </li><li> Étiquette deux RNase tubes de 1,5 ml pour la réaction RT avec piscine A amorces ou des amorces du groupe B et ajouter des composants afin de graphique. Ajoutez au moins un volume supplémentaire de composants pour 2 ou plusieurs réactions ou faire un mélange maître selon les recommandations duIl vendeur. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> Composant de réaction RT </td><td> Concentration des composants </td><td> Volume 1 pour l&#39;échantillon (total V / échantillon = 4,5 pi) </td></tr><tr><td> Eau sans nucléase </td><td></td><td> 0,20 pi </td></tr><tr><td> RT tampon Megaplex (10X) </td><td> 1X </td><td> 0,80 pi </td></tr><tr><td> dNTP (100 mm) </td><td> 4,4 mM </td><td> 0,20 pi </td></tr><tr><td> MgCl2 (25 mM) </td><td> 5 mM </td><td> 0,90 pi </td></tr><tr><td> RNase Inhibitor (20U/μl) </td><td> 2 U </td><td> 0,10 pi </td></tr><tr><td> Megaplex RT amorces A ou B (10X) </td><td> 1X </td><td> 0,80 pi </td></tr><tr><td> MultiScribe transcriptase inverse </td><td> 75 U </td><td> 1.50 pi </td></tr></tbody></table><ol start="3"><li> Inverser tubes 6 fois et centrifuge brièvement. Ensuite, pipette 4,5 ul de mélange réactionnel RT dans MicroAmp des bandes de 8 tubes ou une plaque de réaction optique 96 puits MicroAmp. </li><li> Ajouter 100 ng d&#39;ARN et d&#39;ajuster le volume à 3 pi avec de l&#39;eau traitée au DEPC ou ajouter 3 ARN total ul, mélanger avec la pointe de la pipette, et sceller les tubes ou la plaque. Centrifuger brièvement et incuber sur de la glace pendant 5 min. </li><li> Chargez la réaction dans la machine PCR et l&#39;exécuter dans les conditions suivantes (tel que recommandé par le Biosystems protocole de Piscines Megaplex Appliquées): </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> Étape </td><td> Temp </td><td> Heure </td></tr><tr><td> Cycle (40x) </td><td> 16 ° C </td><td> 2 min </td></tr><tr><td></td><td> 42 ° C </td><td> 1 min </td></tr><tr><td></td><td> 50 ° C </td><td> 1 s </td></tr><tr><td> Tenez </td><td> 85 ° C </td><td> 5 min </td></tr><tr><td> Tenez </td><td> 4 ° C </td><td> ∞ </td></tr></tbody></table><ol start="6"><li> Stocker l&#39;ADNc à -20 ° C (bon pour au moins une semaine) ou passez à l&#39;étape pré-ampli qui peut être stocké pendant une semaine. </li><li> Décongeler les amorces de préampli pour la poule A et poule B sur la glace et mélanger par inversion. Swirl Taqman pré-ampli maître mélanger et garder sur la glace aussi. </li><li> Suivre le tableau en ajoutant au moins un volume supplémentaire de composants pour 2 ou plusieurs réactions ou faire un mélange maître tel que recommandé par le vendeur. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> Composant de réaction pré-ampli </td><td> Volume de 1 échantillon </td></tr><tr><td> Eau sans nucléase </td><td> 7,5 pl </td></tr><tr><td> Taqman PreAmp Master Mix (2X) </td><td> 12,5 pi </td></tr><tr><td> Primaires PreAmp Megaplex A ou B (10X) </td><td> 2,5 pl </td></tr></tbody></table><ol start="9"><li> Pipette 2,5 pi RT product dans MicroAmp barrettes de 8 tube ou une plaque de réaction optique 96 puits MicroAmp et distribuer 22,5 ul mélange réactionnel PreAmp dans chaque puits. </li><li> Sceller la plaque, incuber sur de la glace 5 min, puis charger l&#39;échantillon dans la machine PCR. Exécuter dans les conditions suivantes. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> Étape </td><td> Temp </td><td> Heure </td></tr><tr><td> Tenez </td><td> 95 ° C </td><td> 10 min </td></tr><tr><td> Tenez </td><td> 55 ° C </td><td> 2 min </td></tr><tr><td> Tenez </td><td> 72 ° C </td><td> 2 min </td></tr><tr><td> Cycle (12x) </td><td> 95 ° C </td><td> 15 sec </td></tr><tr><td></td><td> 60 ° C </td><td> 4 min </td></tr><tr><td> Tenez </td><td> 99,9 ° C </td><td> 10 min </td></tr><tr><td> Tenez </td><td> 4 ° C </td><td> ∞ </td></tr></tbody></table><ol start="11"><li> Après la réaction préampli est terminée, centrifuger brièvement les tubes ou la plaque, puis ajouter 75 pl 0,1 X TE pH 8,0 à chaque bien ou d&#39;un tube. </li><li> Scellez et mélanger et centrifuger brièvement. Conserver le produit dilué pendant une semaine à -20 ° C ou continuer à charger la plaque. </li><li> Combinez les éléments suivants dans un tube RNase 1,5 ml sur la glace. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> Composant </td><td> Volume pour 1 carte </td></tr><tr><td> TaqMan Universal PCR Master Mix, No AmpErase UNG (2X) </td><td> 450 ul </td></tr><tr><td> Préampli produit dilué </td><td> 9 pl </td></tr><tr><td> Eau sans nucléase </td><td> 441 ul </td></tr></tbody></table><ol start="14"><li> Inverser le tube pour mélanger et centrifuger brièvement. Distribuer 100 ul mélange de réaction PCR dans chaque port de la carte Array MicroRNA Taqman. </li><li> Centrifuger la carte 2 x 1000 g pendant 1 min. Sceller la carte et l&#39;exécuter en utilisant le modèle fourni avec les amorces dans le manuel Applied Biosystems et les réglages faibles ainsi Array Densité Taqman 384. Nous utilisons système Applied Biosystems 7900HT rapide PCR en temps réel. </li></ol> 4. ARNm Analyse par TaqMan (~ 1,5 h) <ol><li> Pour préparer réaction qPCR, mélanger les composants de la réaction dans l&#39;ordre du tableau. Tous les échantillons seront analysés avec des sondes d&#39;amorces pour le gène d&#39;intérêt ainsi que l&#39;ARNr 18S comme gène normalisateur. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> Composant de réaction Taqman </td><td> Volume de 1 échantillon </td></tr><tr><td> Eau sans nucléase </td><td> 7 pl (ajuster basé sur échantillons individuels) </td></tr><tr><td> Taqman rapide Master Mix (2X) </td><td> 10 pl </td></tr><tr><td> Sondes d&#39;amorces TaqMan (20x) </td><td> 1 pl </td></tr><tr><td> ADNc à partir de 100 ng d&#39;ARN </td><td> 2 &amp; mu, L (ajuster basé sur échantillons individuels) </td></tr></tbody></table><ol start="2"><li> Exécutez la plaque de 96 puits en utilisant le bloc 96 puits rapide tel que recommandé par le fabricant (Applied système de PCR en temps réel Applied Biosystems 7900HT rapide). </li></ol>

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Les auteurs n&#39;ont rien à révéler.

Dans ce protocole, nous montrons la quantification des miARN et ARNm des exosomes purifiés par centrifugation différentielle de médias de sang et de culture. Les exosomes sont diverses composantes dépend de leur origine et sont impliqués dans un certain nombre de fonctions biologiques, y compris la réponse immunitaire, la présentation de l&#39;antigène, la communication intracellulaire, et le transfert de l&#39;ARN et des protéines 9,11,12,19,20. Bien que la taille et la forme est un facteur détermi...

MiARN non codantes court modulent l&#39;expression des gènes en se liant à l&#39;ARNm cible. Graine complémentarité de séquence de ~ 7 paires de bases permet miARN à se lier à l&#39;ARNm cible résultant en l&#39;inhibition de la traduction ou de diminution de la stabilité de l&#39;ARNm, les deux pouvant entraîner une diminution de l&#39;expression de la protéine cible 1. Recherche cours de la dernière décennie a prouvé sans équivoque un rôle fondamental pour miARN dans la médiation des fonctions cellulaires. Il ya également eu des efforts considérables dirigée vers dissection miRNA changements moléculaires qui sous-tendent les diverses maladies médiées par 2,3. En outre, l&#39;identification récente de miARN stables dans les fluides corporels 4-6 ouvert la voie à leur utilisation en tant que nouveaux biomarqueurs qui se prêtent à un diagnostic clinique. Un mode de transport des miARN dans les fluides corporels est via exosomes, petites vésicules qui transportent des ARNm, des protéines, des médiateurs lipidiques et microARN dans des cellules receveuses via circulant dans le sang systémiqueion 7-14. Il en résulte une modulation de l&#39;expression des gènes dans les cellules receveuses et représente un nouveau mécanisme de communication cellulaire. Par exemple, les cellules peuvent moduler les processus immunitaires en sécrétant réglementaires et / ou exosomes absorbants contenant des biomolécules impliquées dans l&#39;inflammation comme l&#39;interleukine-1β (IL1β), facteur de nécrose tumorale α (TNF), facteur de croissance transformant β5 (TGFβ5), et miARN qui régulent ces gènes 13. Comme expression des miARN aberrante est une caractéristique commune à une variété de maladies humaines, ces molécules offrent de nouvelles possibilités passionnantes pour la découverte et la validation de nouvelles cibles thérapeutiques 2. MiARN circulants sont présents dans tous les liquides corporels et il est connu que la composition des exosomes est différente basée sur les cellules de base dont ils ont été libérés. Ainsi, ils offrent une avenue pour étudier l&#39;état physiologique des cellules et comment les cellules Alter signalisation mêmets en réponse au stress, y compris les maladies. L&#39;étude des modifications dans la composition des exosomes peuvent donner un aperçu de la transduction de signal et d&#39;enquêter sur leur utilité potentielle en tant que biomarqueurs ou des voies d&#39;intervention thérapeutique. Ici, nous allons démontrer la purification d&#39;exosomes provenant de sources multiples basés sur les protocoles publiés. Ces exosomes seront utilisés pour l&#39;isolation d&#39;ARN suivie par qPCR à identifier et à mesurer les niveaux de miARN présents dans les exosomes.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EDTA coated vacutainer (10 ml tubes)</td>
 <td>BD Diagnostics</td>
 <td>366643</td>
 <td>For exosome purification from human blood</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EDTA coated vacutainer (2 ml tubes)</td>
 <td>BD Diagnostics</td>
 <td>367841</td>
 <td>For exosome purification from mouse blood</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PAXgene Blood RNA Tube</td>
 <td>BD Diagnostics</td>
 <td>762165</td>
 <td>For miRNA isolation from total blood</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>miRVana microRNA isolation kit</td>
 <td>Ambion</td>
 <td>AM1561</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Acid-Phenol: CHCl3</td>
 <td>Ambion</td>
 <td>9721G</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DNase 1</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>79254</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>TaqMan Universal PCR Master Mix, No AmpErase UNG</td>
 <td>Applied Biosystems</td>
 <td>4326614</td>
 <td>For TLDA cards</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Megaplex RT rodent Pool Set v3.0</td>
 <td>Applied Biosystems</td>
 <td>4444746</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Megaplex preamp rodent Pool set v3.0</td>
 <td>Applied Biosystems</td>
 <td>4444747</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Taqman Array Rodent MicroRNA A+B set V3.0</td>
 <td>Applied Biosystems</td>
 <td>4444909</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Megaplex RT Human Pool set V3.0</td>
 <td>Applied Biosystems</td>
 <td>4444745</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Megaplex Preamp human pool set v3.0</td>
 <td>Applied Biosystems</td>
 <td>4444748</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Taqman Array Human MicroRNA A+B Cards Set v3.0</td>
 <td>Applied Biosystems</td>
 <td>4444913</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Taqman MicroRNA RT kit</td>
 <td>Applied Biosystems</td>
 <td>4366596</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Taqman fast universal PCR master mix </td>
 <td>Applied Biosystems</td>
 <td>4366072</td>
 <td>For mRNA qRT-PCR</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tumor necrosis factor (primer probe)</td>
 <td>Applied Biosystems</td>
 <td>Hs01113624_g1 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Vascular endothelial growth factor A (primer probe)</td>
 <td>Applied Biosystems</td>
 <td>Hs00900055_m1</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Maxima First Strand cDNA Synthesis Kit for RT-qPCR</td>
 <td>Thermo Scientific</td>
 <td>K1642</td>
 <td>For mRNA</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HSP70 antibody</td>
 <td>Abcam</td>
 <td>ab94368 </td>
 <td>For western blot</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Anti-rabbit IgG-Gold</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>G7402</td>
 <td>For electron microscopy</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Rabbit-anti CD81</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>SAB3500454</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Nickel 300 mesh carbon formvar grids</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>FCF300-Ni</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Copper 300 mesh carbon formvar grids</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>FCF300-Cu</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
<td></td>
<td></td>
<td></td>
<td>Table 1. Table of specific reagents.</td>
</tr>
 </tbody>
 </table>

purification and microrna profiling of exosomes derived from blood and culture media

Stable miARN sont présents dans tous les liquides corporels et certains miARN qui circulent sont protégés de la dégradation par la séquestration dans de petites vésicules appelées exosomes. Les exosomes peuvent fusionner avec la membrane de plasma entraînant le transfert de l&#39;ARN et des protéines de la cellule cible. Leurs fonctions biologiques sont la réponse immunitaire, la présentation de l&#39;antigène, et de la communication intracellulaire. La livraison des miARN qui peuvent réguler l&#39;expression des gènes dans les cellules receveuses par le sang a ouvert de nouvelles avenues d&#39;intervention cible. En plus d&#39;offrir une stratégie pour la livraison de médicaments ou d&#39;agents thérapeutiques ARN, contenu exosomales peuvent servir de biomarqueurs qui peuvent aider dans le diagnostic, déterminer les options de traitement et le pronostic. Ici, nous allons décrire la procédure d&#39;analyse quantitative miARN et les ARN messagers (ARNm) à partir de exosomes sécrétés dans le sang et les milieux de culture de cellules. Exosomes purifiés seront caractérisés par western blot pour exosmarqueurs Omal et PCR pour ARNm d&#39;intérêt. microscopie électronique à transmission (MET) et immunogold étiquetage seront utilisés pour valider la morphologie et de l&#39;intégrité exosomal. L&#39;ARN total seront purifiés à partir de ces exosomes afin de s&#39;assurer que nous pouvons étudier à la fois l&#39;ARNm et miRNA partir du même échantillon. Après validation intégrité de l&#39;ARN par Bioanalyzer, nous allons effectuer un débit quantitative PCR en temps réel moyen (qPCR) pour identifier le miARN exosomal utilisant TaqMan Array basse densité (TLDA) des cartes et des études d&#39;expression génique pour les transcriptions d&#39;intérêt. Ces protocoles peuvent être utilisés pour quantifier les changements dans les miARN exosomales chez les patients, les modèles de rongeurs et de milieux de culture de cellules avant et après l&#39;intervention pharmacologique. Exosomales contenu varient en raison de la source d&#39;origine et les conditions physiologiques de cellules qui sécrètent des exosomes. Ces variations peuvent donner un aperçu sur la façon dont les cellules et les systèmes à faire face au stress ou à des perturbations physiologiques. Nos données représentatives montrent variations dans miARN présents dans exosomes purifiés à partir du sang de souris, le sang humain et les milieux de culture de cellules humaines. Ici, nous allons décrire la procédure d&#39;analyse quantitative miARN et les ARN messagers (ARNm) à partir de exosomes sécrétés dans le sang et les milieux de culture de cellules. Exosomes purifiés seront caractérisés par western blot des marqueurs exosomales et PCR pour ARNm d&#39;intérêt. microscopie électronique à transmission (MET) et immunogold étiquetage seront utilisés pour valider la morphologie et de l&#39;intégrité exosomal. L&#39;ARN total seront purifiés à partir de ces exosomes afin de s&#39;assurer que nous pouvons étudier à la fois l&#39;ARNm et miRNA partir du même échantillon. Après validation intégrité de l&#39;ARN par Bioanalyzer, nous allons effectuer un débit quantitative PCR en temps réel moyen (qPCR) pour identifier le miARN exosomal utilisant TaqMan Array basse densité (TLDA) des cartes et des études d&#39;expression génique pour les transcriptions d&#39;intérêt. Ces protocoles peuvent être utilisés pour quantifier les changements dans les miARN exosomales in patients, des modèles de rongeurs et de milieux de culture de cellules avant et après l&#39;intervention pharmacologique. Exosomales contenu varient en raison de la source d&#39;origine et les conditions physiologiques de cellules qui sécrètent des exosomes. Ces variations peuvent donner un aperçu sur la façon dont les cellules et les systèmes à faire face au stress ou à des perturbations physiologiques. Nos données représentatives montrent des variations dans les miARN présents dans exosomes purifiés à partir du sang de souris, le sang humain et les milieux de culture de cellules humaines

Après avoir isolé les exosomes de milieux de culture du sang ou des cellules, la pureté des exosomes peut être testée par microscopie électronique (EM) et Western blot (Figures 1A et 1B). Nous avons confirmé nos préparations d&#39;exosomes provenant de diverses sources avec EM et western blot en utilisant des anticorps multiples. Figure 1A montre EM images confirment que les exosomes sont intactes avec un diamètre d&#39;environ 30 nm -100 et contiennent CD81 pa...

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Purification and microRNA Profiling of Exosomes Derived from Blood and Culture Media

La présence de microARN (miARN stables) dans exosomes a généré un immense intérêt comme un nouveau mode de communication intercellulaire, pour leur utilité potentielle en tant que biomarqueurs et comme une voie pour l&#39;intervention thérapeutique. Ici, nous démontrons purification d&#39;exosomes à partir de supports de sang et de culture, suivie par PCR quantitative pour identifier les miARN transportés.

Purification et profilage de microARN des exosomes dérivés du sang et de la culture des médias

Stable miRNAs are present in all body fluids and some circulating miRNAs  are protected from degradation by sequestration in small vesicles called  ...

purification-microrna-profiling-exosomes-derived-from-blood-culture

Research

JoVE Journal

Biology

31.7K vues.  Drexel University College of Medicine. La présence de microARN (miARN stables) dans exosomes a généré un immense intérêt comme un nouveau mode de communication intercellulaire, pour leur utilité potentielle en tant que biomarqueurs et comme une voie pour l'intervention thérapeutique. Ici, nous démontrons purification d'exosomes à partir de supports de sang et de culture, suivie par PCR quantitative pour identifier les miARN transportés.

Vidéo: Purification and microRNA Profiling of Exosomes Derived from Blood and Culture Media

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

Coloration des protéines dans les gels de Coomassie G-250, sans solvant et l&#39;acide acétique organique

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Recherche

Biologie

Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) have shown to be convenient, easy to obtain and culture, and thus are the most widely studied endothelial cells. However, for research focused on processes like angiogenesis, permeability or many others, microvascular endothelial cells (ECs) are a much more physiologically relevant model to study 2. Furthermore, ECs isolated from knockout mice provide a useful tool for analysis of protein function ex vivo. Several approaches to isolate and culture microvascular ECs of different origin have been reported to date 3-7, but consistent isolation and culture of pure ECs is still a major technical problem in many laboratories. Here, we provide a step-by-step protocol on a reliable and relatively simple method of isolating and culturing mouse lung endothelial cells (MLECs). In this approach, lung tissue obtained from 6- to 8-day old pups is first cut into pieces, digested with collagenase/dispase (C/D) solution and dispersed mechanically into single-cell suspension. MLECS are purified from cell suspension using positive selection with anti-PECAM-1 antibody conjugated to Dynabeads using a Magnetic Particle Concentrator (MPC). Such purified cells are cultured on gelatin-coated tissue culture (TC) dishes until they become confluent. At that point, cells are further purified using Dynabeads coupled to anti-ICAM-2 antibody. MLECs obtained with this protocol exhibit a cobblestone phenotype, as visualized by phase-contrast light microscopy, and their endothelial phenotype has been confirmed using FACS analysis with anti-VE-cadherin 8 and anti-VEGFR2 9 antibodies and immunofluorescent staining of VE-cadherin. In our hands, this two-step isolation procedure consistently and reliably yields a pure population of MLECs, which can be further cultured. This method will enable researchers to take advantage of the growing number of knockout and transgenic mice to directly correlate in vivo studies with results of in vitro experiments performed on isolated MLECs and thus help to reveal molecular mechanisms of vascular phenotypes observed in vivo.

Here, we describe a protocol for isolation and culture of murine pulmonary endothelial cells. This method comprises mechanic and enzymatic lung tissue dissociation as well as a 2-step purification process using anti-PECAM-1 and anti-ICAM-2 antibodies conjugated to magnetic beads, which produces a pure endothelial cell population of mostly microvascular origin.

Isolement et culture de cellules endothéliales pulmonaires des souris néonatales

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells ...

Isolation and Characterization of RNA-Containing Exosomes

The field of exosome research is rapidly expanding, with a dramatic increase in publications in recent years. These small vesicles (30-100 nm) of endocytic origin were first proposed to function as a way for reticulocytes to eradicate the transferrin receptor while maturing into erythrocytes1, and were later named exosomes. Exosomes are formed by inward budding of late endosomes, producing multivesicular bodies (MVBs), and are released into the environment by fusion of the MVBs with the plasma membrane2. Since the first discovery of exosomes, a wide range of cells have been shown to release these vesicles. Exosomes have also been detected in several biological fluids, including plasma, nasal lavage fluid, saliva and breast milk3-6. Furthermore, it has been demonstrated that the content and function of exosomes depends on the originating cell and the conditions under which they are produced. A variety of functions have been demonstrated for exosomes, such as induction of tolerance against allergen7,8, eradication of established tumors in mice9, inhibition and activation of natural killer cells10-12, promotion of differentiation into T regulatory cells13, stimulation of T cell proliferation14 and induction of T cell apoptosis15. Year 2007 we demonstrated that exosomes released from mast cells contain messenger RNA (mRNA) and microRNA (miRNA), and that the RNA can be shuttled from one cell to another via exosomes. In the recipient cells, the mRNA shuttled by exosomes was shown to be translated into protein, suggesting a regulatory function of the transferred RNA16. Further, we have also shown that exosomes derived from cells grown under oxidative stress can induce tolerance against further stress in recipient cells and thus suggest a biological function of the exosomal shuttle RNA17. Cell culture media and biological fluids contain a mixture of vesicles and shed fragments. A high quality isolation method for exosomes, followed by characterization and identification of the exosomes and their content, is therefore crucial to distinguish exosomes from other vesicles and particles. Here, we present a method for the isolation of exosomes from both cell culture medium and body fluids. This isolation method is based on repeated centrifugation and filtration steps, followed by a final ultracentrifugation step in which the exosomes are pelleted. Important methods to identify the exosomes and characterize the exosomal morphology and protein content are highlighted, including electron microscopy, flow cytometry and Western blot. The purification of the total exosomal RNA is based on spin column chromatography and the exosomal RNA yield and size distribution is analyzed using a Bioanalyzer.

This paper demonstrates methods for the isolation, purification and detection of exosomes, as well as techniques for analysis of their molecular content. These methods are adaptable for exosome isolation from both cell culture media and biological fluids, and can beyond analysis of molecular content also be useful in functional studies.

Isolement et caractérisation de l&#39;ARN-Contenant exosomes

The field of exosome research is rapidly expanding, with a dramatic increase in publications in recent years. These small vesicles (30-100 nm) of ...

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a variety of neurodegenerative diseases, understanding microtubule based motor transport and its regulation will likely ultimately lead to improved therapeutic approaches. Kinesin-1 is a eukaryotic motor protein which moves in an anterograde (plus-end) direction along microtubules (MTs), powered by ATP hydrolysis. Here we report a detailed purification protocol to isolate active full length kinesin from Drosophila embryos, thus allowing the combination of Drosophila genetics with single-molecule biophysical studies. Starting with approximately 50 laying cups, with approximately 1000 females per cup, we carried out overnight collections. This provided approximately 10 ml of packed embryos. The embryos were bleach dechorionated (yielding approximately 9 grams of embryos), and then homogenized. After disruption, the homogenate was clarified using a low speed spin followed by a high speed centrifugation. The clarified supernatant was treated with GTP and taxol to polymerize MTs. Kinesin was immobilized on polymerized MTs by adding the ATP analog, 5'-adenylyl imidodiphosphate at room temperature. After kinesin binding, microtubules were sedimented via high speed centrifugation through a sucrose cushion. The microtubule pellet was then re-suspended, and this process was repeated. Finally, ATP was added to release the kinesin from the MTs. High speed centrifugation then spun down the MTs, leaving the kinesin in the supernatant. This kinesin was subjected to a centrifugal filtration using a 100 KD cut off filter for further purification, aliquoted, snap frozen in liquid nitrogen, and stored at -80 &deg;C. SDS gel electrophoresis and western blotting was performed using the purified sample. The motor activity of purified samples before and after the final centrifugal filtration step was evaluated using an in vitro single molecule microtubule assay. The kinesin fractions before and after the centrifugal filtration showed processivity as previously reported in literature. Further experiments are underway to evaluate the interaction between kinesin and other transport related proteins.

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

This is a protocol to isolate active full length Kinesin from Drosophila embryos for single-molecule biophysical studies. We show how to collect embryos, make the embryo lysate, and then polymerize microtubules (MTs). Kinesin is purified by immobilizing it on the MTs, spinning down the Kinesin-MT complexes, and then releasing the kinesin from the MTs via ATP addition.

Isolement et purification de la kinésine de Drosophila Embryons

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a ...

Phenotypic and Functional Characterization of Endothelial Colony Forming Cells Derived from Human Umbilical Cord Blood

Longstanding views of new blood vessel formation via angiogenesis, vasculogenesis, and arteriogenesis have been recently reviewed1. The presence of circulating endothelial progenitor cells (EPCs) were first identified in adult human peripheral blood by Asahara et al. in 1997 2 bringing an infusion of new hypotheses and strategies for vascular regeneration and repair. EPCs are rare but normal components of circulating blood that home to sites of blood vessel formation or vascular remodeling, and facilitate either postnatal vasculogenesis, angiogenesis, or arteriogenesis largely via paracrine stimulation of existing vessel wall derived cells3. No specific marker to identify an EPC has been identified, and at present the state of the field is to understand that numerous cell types including proangiogenic hematopoietic stem and progenitor cells, circulating angiogenic cells, Tie2+ monocytes, myeloid progenitor cells, tumor associated macrophages, and M2 activated macrophages participate in stimulating the angiogenic process in a variety of preclinical animal model systems and in human subjects in numerous disease states4, 5. Endothelial colony forming cells (ECFCs) are rare circulating viable endothelial cells characterized by robust clonal proliferative potential, secondary and tertiary colony forming ability upon replating, and ability to form intrinsic in vivo vessels upon transplantation into immunodeficient mice6-8. While ECFCs have been successfully isolated from the peripheral blood of healthy adult subjects, umbilical cord blood (CB) of healthy newborn infants, and vessel wall of numerous human arterial and venous vessels 6-9, CB possesses the highest frequency of ECFCs7 that display the most robust clonal proliferative potential and form durable and functional blood vessels in vivo8, 10-13. While the derivation of ECFC from adult peripheral blood has been presented14, 15, here we describe the methodologies for the derivation, cloning, expansion, and in vitro as well as in vivo characterization of ECFCs from the human umbilical CB.

Endothelial colony forming cells (ECFCs) are circulating endothelial cells with robust clonal proliferative potential that display intrinsic in vivo vessel forming ability. Phenotypic and functional characterization of outgrowth endothelial cells derived from CB are important to identify and isolate bona fide ECFCs for potential clinical application in repairing damaged tissues.

Caractérisation phénotypique et fonctionnelle des cellules endothéliales formant colonie dérivés du sang de cordon ombilical humain

Longstanding views of new blood vessel formation via angiogenesis, vasculogenesis, and arteriogenesis have been recently reviewed1. The presence of ...

Purification of Transcripts and Metabolites from Drosophila Heads

For the last decade, we have tried to understand the molecular and cellular mechanisms of neuronal degeneration using Drosophila as a model organism. Although fruit flies provide obvious experimental advantages, research on neurodegenerative diseases has mostly relied on traditional techniques, including genetic interaction, histology, immunofluorescence, and protein biochemistry. These techniques are effective for mechanistic, hypothesis-driven studies, which lead to a detailed understanding of the role of single genes in well-defined biological problems. However, neurodegenerative diseases are highly complex and affect multiple cellular organelles and processes over time. The advent of new technologies and the omics age provides a unique opportunity to understand the global cellular perturbations underlying complex diseases. Flexible model organisms such as Drosophila are ideal for adapting these new technologies because of their strong annotation and high tractability. One challenge with these small animals, though, is the purification of enough informational molecules (DNA, mRNA, protein, metabolites) from highly relevant tissues such as fly brains. Other challenges consist of collecting large numbers of flies for experimental replicates (critical for statistical robustness) and developing consistent procedures for the purification of high-quality biological material. Here, we describe the procedures for collecting thousands of fly heads and the extraction of transcripts and metabolites to understand how global changes in gene expression and metabolism contribute to neurodegenerative diseases. These procedures are easily scalable and can be applied to the study of proteomic and epigenomic contributions to disease.

Purification of Transcripts and Metabolites from Drosophila Heads

We describe here the procedures for the extraction and purification of mRNA and metabolites from Drosophila heads. We are applying these techniques to better understand the cellular perturbations underlying neuronal degeneration. These methodologies can be easily scaled and adapted for other "omic" projects.

Purification des relevés de notes et de métabolites<em&gt; Drosophila</em&gt; Têtes

For the last decade, we have tried to understand the molecular and cellular mechanisms of neuronal degeneration using Drosophila as a model organism. ...

Isolation of Blood-vessel-derived Multipotent Precursors from Human Skeletal Muscle

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective isolation in culture. Recently, using fluorescence-activated cell sorting (FACS), we and other researchers prospectively identified and purified three subpopulations of multipotent precursor cells associated with the vasculature of human skeletal muscle. These three cell populations: myogenic endothelial cells (MECs), pericytes (PCs), and adventitial cells (ACs), are localized respectively to the three structural layers of blood vessels: intima, media, and adventitia. All of these human blood-vessel-derived stem cell (hBVSC) populations not only express classic MSC markers but also possess mesodermal developmental potentials similar to typical MSCs. Previously, MECs, PCs, and ACs have been isolated through distinct protocols and subsequently characterized in separate studies. The current isolation protocol, through modifications to the isolation process and adjustments in the selective cell surface markers, allows us to simultaneously purify all three hBVSC subpopulations by FACS from a single human muscle biopsy. This new method will not only streamline the isolation of multiple BVSC subpopulations but also facilitate future clinical applications of hBVSCs for distinct therapeutic purposes.

Blood vessels within human skeletal muscle harbor several multi-lineage precursor populations that are ideal for regenerative applications. This isolation method allows simultaneous purification of three multipotent precursor cell populations respectively from three structural layers of blood vessels: myogenic endothelial cells from intima, pericytes from media, and adventitial cells from adventitia.

Isolement des vaisseaux sanguins dérivés multipotentes précurseurs du muscle squelettique humain

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective ...

MicroRNA Expression Profiles of Human iPS Cells, Retinal Pigment Epithelium Derived From iPS, and Fetal Retinal Pigment Epithelium

The objective of this report is to describe the protocols for comparing the microRNA (miRNA) profiles of human induced-pluripotent stem (iPS) cells, retinal pigment epithelium (RPE) derived from human iPS cells (iPS-RPE), and fetal RPE. The protocols include collection of RNA for analysis by microarray, and the analysis of microarray data to identify miRNAs that are differentially expressed among three cell types. The methods for culture of iPS cells and fetal RPE are explained. The protocol used for differentiation of RPE from human iPS is also described. The RNA extraction technique we describe was selected to allow maximal recovery of very small RNA for use in a miRNA microarray. Finally, cellular pathway and network analysis of microarray data is explained. These techniques will facilitate the comparison of the miRNA profiles of three different cell types.

The microRNA (miRNA) profiles of human induced-pluripotent stem (iPS) cells, retinal pigment epithelium (RPE) derived from human induced-pluripotent stem (iPS) cells (iPS-RPE), and fetal RPE, were compared.

Profils MicroRNA d&#39;expression de cellules iPS humaines, l&#39;épithélium pigmentaire rétinien Derived From iPS, et fœtale épithélium pigmentaire rétinien

The objective of this report is to describe the protocols for comparing the microRNA (miRNA) profiles of human induced-pluripotent stem (iPS) cells, ...

Generation and Culture of Blood Outgrowth Endothelial Cells from Human Peripheral Blood

Historically, the limited availability of primary endothelial cells from patients with vascular disorders has hindered the study of the molecular mechanisms underlying endothelial dysfunction in these individuals. However, the recent identification of blood outgrowth endothelial cells (BOECs), generated from circulating endothelial progenitors in adult peripheral blood, may circumvent this limitation by offering an endothelial-like, primary cell surrogate for patient-derived endothelial cells. Beyond their value to understanding endothelial biology and disease modeling, BOECs have potential uses in endothelial cell transplantation therapies. They are also a suitable cellular substrate for the generation of induced pluripotent stem cells (iPSCs) via nuclear reprogramming, offering a number of advantages over other cell types. We describe a method for the reliable generation, culture and characterization of BOECs from adult peripheral blood for use in these and other applications. This approach (i) allows for the generation of patient-specific endothelial cells from a relatively small volume of adult peripheral blood and (ii) produces cells that are highly similar to primary endothelial cells in morphology, cell signaling and gene expression.

This protocol allows for the reliable generation and characterization of blood outgrowth endothelial cells (BOECs) from a small volume of adult peripheral blood. BOECs can be used as a surrogate for endothelial cells from patients with vascular disorders and as a substrate for the generation of induced pluripotent stem cells.

Génération et de la Culture du sang excroissance des cellules endothéliales de sang périphérique humain

Historically, the limited availability of primary endothelial cells from patients with vascular disorders has hindered the study of the molecular ...

Purification of Platelets from Mouse Blood

Platelets are purified from whole blood to study their functional properties, which should be free from red blood cells (RBC), white blood cells (WBC), and plasma proteins. We describe here purification of platelets from mouse blood using three-fold more iohexol gradient medium relative to blood sample volume and centrifugation in a swinging bucket rotor at 400 x g for 20 min at 20 &#176;C. The recovery/yield of the purified platelets were 18.2-38.5%, and the purified platelets were in a resting state, which did not contain any significant number of RBC and WBC. The purified platelets treated with thrombin showed up to 93% activation, indicating their viability. We confirmed that the purified platelets are sufficiently pure using flow cytometric and microscopic evaluation. These platelets can be used for gene expression, activation, granule release, aggregation, and adhesion assays. This method can be used for purification of platelets from the blood of other species as well.

Here, mouse blood was collected in the presence of an anti-coagulant. The platelets were purified by iohexol gradient medium using low speed centrifugation. The platelets were activated with thrombin to investigate if they were viable. The quality of the purified platelets was analyzed by flow cytometry and microscopy.

Purification des plaquettes du sang de souris

Platelets are purified from whole blood to study their functional properties, which should be free from red blood cells (RBC), white blood cells (WBC), ...