שיטת ההקלטה האופטית עם צבע רגיש למתח נחשבת לטכנולוגיה אידיאלית כדי לדמיין כיצד המוח עובד. שיטה זו אפשרה לנו להקליט דינמיקה נוירופסיכולוגית באופן הדוק ואמין במשך 12 שעות, נתן לנו מבט על פעילות נפשית. אנו מנסים להרחיב את היישום כדי לזהות שינויים במעגל הנגרמים על ידי כימיקלים בכל שלב הפיתוח, כגון יישום חומצה יקר לאימהות.
הטכניקה כבר מבוססת היטב. אנא נסו לשחזר מחקרים על ידי ביצוע השיטה המוצגת כאן. כדי להתחיל בהליך זה, לטבול את הראש ערוף בקרח קר ACSF במגש כירורגי נירוסטה.
מוציאים את המוח תוך דקה וממקם אותו בתוך מקור המכיל ACSF מצונן במשך חמש דקות. לאחר מכן, מחלקים את החלק במוח בקו האמצע עם אזמל ומ מניחים את שתי ההמיספרות על בלוק של 4%. לאחר מכן, מקם את בלוק המוח עם שתי ההמיספרות על בלוק 4%agar.
נגב את ה- ACSF העודף מהבלוק באמצעות נייר סינון. לאחר מכן, יש למרוח דבק-על על פלטפורמת הרטט. מניחים עליו את גוש הגר ומנגבים את ההיבקות המוגזמת בנייר סינון.
בעדינות להחיל כמות קטנה של קרח קר ACSF מהחלק העליון של המוח אגר בלוק כדי לעזור לחזק דבק סופר עודף ולמנוע הדבק מלכסות את המוח ולהפריע חיתוך. לאחר מכן, תקן את הפלטפורמה למגש הרטט ושפוך את ה- ACSF שהשתנה. הגדר את הרטט למהירות איטית והגדר את תדר הלהב בהגדרה המרבית שלו.
אז תתחילו לתסתך. מניחים את הפרוסות בפינת תא הפרוסה ברצף כך שניתן יהיה להבדיל בקלות בין סדר הפרוסות. בדרך כלל ניתן להשיג שלוש עד חמש פרוסות מחצי כדור אחד.
לאחר מכן, לחתוך את חלק גזע המוח באמצעות מחט 30 מד. בעזרת מברשת צבע קטנה עם קצה, מניחים את הפרוסה על מסנן הממברנה המוחזק בטבעת פלקסיגלס. מניחים את הטבעת בתא התאוששות לח ולאבטח את הכיסוי כדי לשמור על הלחץ הפנימי גבוה.
בעת מיקום הפרוסה על מסנן הממברנה, התאימו את הכיוון והמיקום של הפרוסה בתוך הטבעת כדי לוודא שהיא מרוכזת היטב ויש לה כיוון עקבי. השאירו את הדגימה ב 28 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות ולאחר מכן בטמפרטורת החדר לפחות 10 עד 30 דקות להחלמה. כדי להכתים את הפרוסות, יש למרוח בעדינות 100 מיקרוליטרים של תותר הכתמים על כל פרוסה ולהדרור ב-20 דקות לטמפרטורת החדר.
לאחר מכן, הכן 50 עד 100 מיליליטר של ACSF במיכל. מניחים את הטבעת עם הדגימה בה כדי לשטוף את פתרון הכתמים. לאחר מכן, מעבירים את הפרוסות השטיפות לתא דגירה אחר.
חכה יותר משעה להתאוששות לפני הניסוי. כדי להתחיל בהליך זה, הפעל את מערכת המגבר, המחשב והמצלמה ופתח את התוכנה. יוצקים ACSF בצינור 50 מיליליטר ומבעבעים אותו עם קרבוגן.
השתמש במשאבה פריסטולית כדי להפיץ את ה- ACSF ולהתאים את קצב הזרימה לכמיליליטר לדקה. לאחר מכן, להתאים את הגובה של פיפטה יניקה, כך רמת הנוזל בתוך תא הניסוי הוא תמיד קבוע. שים את האלקטרודה הקרקעית בתא.
לאחר מכן, למלא את אלקטרודה זכוכית עם כמות קטנה של ACSF ולמקום אותו מחזיק האלקטרודה. חבר את המחזיק למוט של המניפולטור. באמצעות מגבר, ודא כי עמידות האלקטרודה היא כמגה-ם אחד.
בהקלטה, להעביר פרוסה מהתא לח לתא ניסיוני. לחץ בחוזקה על קצה הטבעת לתוך טבעת הסיליקון. היזהר לא לשבור את הממברנה או את החלק התחתון של תא הניסוי.
מתחת למיקרוסקופ מניחים את קצה האלקטרודה המריצה ואת אלקטרודה ההקלטה הפוטנציאלית של השדה על הפרוסה. בדוק את התגובה המעוררת על ידי אספקת גירוי. ודא כי שדה התצוגה מכסה את המעגל העצבי הנכון במערכת ההקלטה האופטית.
לאחר מכן, כוונן את עוצמת אור העירור לכ- 70 עד 80% מהקיבולת המרבית במצלמה. באמצעות מקור האור הפלואורסצנטי, התאם את המוקד למערכת הרכישה. לאחר מכן, התחל את ההקלטה ונתח את הנתונים בתוכנה לרכישת תמונות לאחר הרכישה.
איור זה מראה את האות האופטי הייצוגי על גירוי חשמלי של ה- Schaffer collaterol באזור CA1 של פרוסת היפוקמפוס של עכבר. תמונות עוקבות אלה מציגות את האות האופטי לפני החלת מסננים spacial ו temporal בעוד תמונות אלה מציגים את אותם נתונים לאחר החלת חמש על חמש על חמש מסנן מעוקב פעמיים. בשל קצב הפריימים הגבוה והרזולוציה המרחבית הגבוהה, היישום של המסנן לא לשנות את האות, אבל סינן את הרעש אשר ניתן לראות גם במסלול הזמן נרשם פיקסלים במשפט אחד.
הנה ההשוואה של התגובות האופייניות באזור CA1 של פרוסות ההיפוקמפוס בין עכבר וחולדה. התגובה ההיפר-קוטבית הקטנה נצפית בצד הדיסטלי של ה- CA1 לאחר 24 אלפיות שנייה בפרוסת ההיפוקמפוס של העכבר, אך תגובה היפר-קוטבית מסיבית יותר עקפה את התגובה הדפולארית בפרוסת ההיפוקמפוס של העכבר. לאחר הפרוסות מוכתמות, הם צריכים להימשך מעל 12 שעות ואתה יכול לבצע הקלטות אלקטרופיזיולוגיות אחרות עליהם.
