Il metodo di registrazione ottica con colorante sensibile alla tensione è pensato per essere una tecnologia ideale per visualizzare come funziona il cervello. Questo metodo ci ha permesso di registrare una dinamica neuropsichica in modo stabile e affidabile per 12 ore, ci ha dato una visione dell'attività psichica. Stiamo cercando di espandere l'applicazione per rilevare i cambiamenti di circuito causati dalle sostanze chimiche in tutte le fasi dello sviluppo, come la preziosa applicazione dell'acido alle madri.
La tecnica è già ben consolidata. Si prega di provare a riprodurre gli studi seguendo il metodo presentato qui. Per iniziare questa procedura, immergere la testa decapitata in ACSF ghiacciato in un vassoio chirurgico in acciaio inossidabile.
Estrarre il cervello entro un minuto e posizionare in un bicchiere contenente ACSF refrigerato per cinque minuti. Quindi, dividere la sezione cerebrale alla linea mediana con un bisturi e posizionare entrambi gli emisferi su un blocco di agar al 4%. Quindi, posizionare il blocco cerebrale con entrambi gli emisferi su un blocco di agar al 4%.
Pulire l'ACSF in eccesso dal blocco con una carta da filtro. Successivamente, applicare la supercolla sulla piattaforma del vibratomo. Posizionare il blocco di agar su di esso e pulire l'adesivo eccessivo con una carta da filtro.
Applicare delicatamente una piccola quantità di ghiaccio freddo ACSF dalla parte superiore del blocco di agar cerebrale per aiutare a solidificare la supercolla in eccesso e per impedire alla colla di coprire il cervello e disturbare l'affezione. Successivamente, fissare la piattaforma sul vassoio del vibratomo e versare l'ACSF modificato. Impostare il vibratomo a una velocità lenta e avere la frequenza della lama alla sua massima impostazione.
Quindi inizia a affeggiare. Posizionare le fette nell'angolo della camera a fette in sequenza in modo che l'ordine delle fette possa essere facilmente distinto. Di solito si possono ottenere da tre a cinque fette da un emisfero.
Quindi, tagliare la porzione di tronco encefalico usando un ago calibro 30. Utilizzando un piccolo pennello ribaltato, posizionare la fetta sul filtro a membrana tenuto con un anello in plexiglass. Posizionare l'anello in una camera di recupero umida e fissare il coperchio per mantenere alta la pressione interna.
Quando si posiziona la fetta sul filtro a membrana, regolare la direzione e la posizione della fetta all'interno dell'anello per assicurarsi che sia ben centrata e abbia una direzione coerente. Lasciare il campione a 28 gradi Celsius per 30 minuti e quindi a temperatura ambiente per almeno 10-30 minuti per il recupero. Per macchiare le fette, applicare delicatamente 100 microlitri della soluzione di colorazione su ogni fetta e incubare a 20 minuti per la temperatura ambiente.
Quindi, preparare da 50 a 100 millilitri di ACSF in un contenitore. Posizionare l'anello con il campione in esso per risciacquare la soluzione di colorazione. Quindi, trasferire le fette risciacquate in un'altra camera di incubazione.
Attendere più di un'ora per il ripristino prima dell'esperimento. Per iniziare questa procedura, accendere l'amplificatore, il computer e il sistema di telecamere e aprire il software. Versare ACSF in un tubo da 50 millilitri e bollarlo con carbogeno.
Utilizzare una pompa peristaltica per far circolare l'ACSF e regolare la portata a circa un millilitro al minuto. Quindi, regolare l'altezza della pipetta di aspirazione in modo che il livello del liquido all'interno della camera di esperimento sia sempre costante. Posizionare l'elettrodo di terra nella camera.
Successivamente, riempire l'elettrodo di vetro con una piccola quantità di ACSF e posizionarlo nel supporto dell'elettrodo. Attaccare il supporto all'asta del manipolatore. Utilizzando un amplificatore, assicurarsi che la resistenza dell'elettrodo sia di circa un megaohm.
Nella sessione di registrazione, trasferire una fetta dalla camera umida a una camera sperimentale. Premere saldamente il bordo dell'anello nell'o-ring in silicone. Fare attenzione a non rompere la membrana o il fondo della camera di esperimento.
Al microscopio posizionare la punta dell'elettrodo stimolante e il potenziale elettrodo di registrazione di campo sulla fetta. Controlla la risposta evocata fornendo uno stimolo. Verificare che il campo visivo copra il circuito neurale destro nel sistema di registrazione ottica.
Quindi, regolare l'intensità della luce di eccitazione a circa il 70-80% della capacità massima della fotocamera. Utilizzando la sorgente luminosa fluorescente, regolare la messa a fuoco con il sistema di acquisizione. Quindi, avviare la registrazione e analizzare i dati in un software di acquisizione di immagini dopo l'acquisizione.
Questa figura mostra il segnale ottico rappresentativo sulla stimolazione elettrica del collaterolo di Schaffer nell'area CA1 di una fetta ippocampale del topo. Queste immagini consecutive mostrano il segnale ottico prima dell'applicazione di filtri spaziali e temporali, mentre queste immagini mostrano gli stessi dati dopo aver applicato due volte un filtro cubico cinque per cinque per cinque. A causa dell'elevata frequenza fotogrammi e dell'alta risoluzione spaziale, l'applicazione del filtro non ha cambiato il segnale, ma ha filtrato il rumore che può essere osservato anche nel corso del tempo registrato in pixel in una singola prova.
Ecco il confronto delle risposte tipiche nell'area CA1 delle fette ippocampali tra topo e ratto. La piccola risposta iperpolarizzante si osserva nel lato distale della CA1 dopo 24 millisecondi nella fetta ippocampale del topo, ma una risposta iperpolarizzante più massiccia ha superato la risposta depolarizzante nella fetta ippocampale del ratto. Una volta che le fette sono macchiate, dovrebbero durare per oltre 12 ore ed è possibile eseguire altre registrazioni elettrofisiopatiche su di esse.
