Ce protocole mesure les niveaux subcellulaires d’ubiquitination de protéine et l’activité protéasome dans le cerveau de rongeur permettant dans les sujets des comparaisons de la façon dont l’activité ubiquitine-protéasome change en réponse à l’activité cellulaire, l’apprentissage, ou la maladie. Le protocole permet la collecte de fractions synaptiques, cytoplasmiques et nucléaires à partir du même cerveau de rongeurs. Minimisant la perte, il pourrait être effectué avec de petites quantités de tissus et de l’équipement de laboratoire de base.
Taylor McFadden, un étudiant diplômé de mon laboratoire, démontrera la procédure. Commencez cette procédure par la collecte et la dissection du tissu cérébral de rongeur tel que décrit dans le protocole de texte. Assurez-vous que l’hémisphère utilisé est contrebalé entre les conditions d’extraction pour chaque groupe expérimental.
Retirez le microtube de centrifugeuse de 1,5 millilitre contenant un hémisphère de la région d’intérêt du congélateur de moins 80 degrés Celsius. À l’aide d’un scalpel, transférer le tissu cérébral congelé dans un homogénéiseur en téflon en verre de deux millilitres. Ajouter 500 microlitres de tampon de lyse au tube de téflon.
À l’aide du pilon B, homogénéiser le même tissu avec 15 coups jusqu’à ce qu’aucune quantité visible de matière solide ne soit présente. Utilisez un mouvement tournant à chaque course. Avec une pipette de 1000 microlitres, transférez l’échantillon homogénéisé dans un nouveau tube de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre.
Placer le tube sur de la glace humide et incuber pendant 30 minutes. Placer le tube dans la microcentrifugeuse et faire tourner pendant 10 minutes à 845 fois g en quatre degrés Celsius. Après l’achèvement, retirez soigneusement le supernatant par pipetting et placez-le dans un nouveau tube de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre.
C’est la fraction cytoplasmique. Ajouter 50 microlitres de tampon d’extraction à la pastille qui en résulte et réutiliser par pipetting. Ne pas vortex la pastille.
Placez le tube contenant la pastille résuspendée sur la glace et incubez pendant 30 minutes. Puis centrifuger le tube pendant 20 minutes à 21, 456 fois g en quatre degrés Celsius. Après centrifugation, retirer soigneusement le supernatant par pipetting et placer dans un nouveau tube de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre.
C’est la fraction nucléaire. Homogénéiser un hémisphère de la région d’intérêt comme avant, sauf pour utiliser 500 microlitres de tampon TEVP au lieu de tampon de lyse. À l’aide d’une pipette de 1000 microlitres, transférez l’échantillon homogénéisé dans un nouveau tube de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre.
Centrifugez l’échantillon à 1000 fois g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Recueillir le supernatant et le transférer dans un nouveau tube de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre à l’aide d’une pipette de 1000 microlitres. Centrifugez l’échantillon à 10 000 fois g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius.
Jetez la pastille d’origine qui contient les noyaux et les gros débris. Transférer le supernatant dans un nouveau tube de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre. C’est la fraction cytosolique.
Ajouter 50 microlitres de tampon d’homogénéisation à la pastille et résuspendre par pipetting jusqu’à ce qu’aucun matériau solide n’est visible. Centrifugez l’échantillon à 20 000 fois g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Transférer le supernatant dans un nouveau tube de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre.
Il s’agit de la fraction de membrane synptosomale brute. Pour configurer l’essai, préchauffer le lecteur de plaque à 37 degrés Celsius et tenir à travers la course. Réglez l’excitation à 360 nanomètres et émission à 460 nanomètres.
Si la plaque de puits 96 utilisée est claire, réglez la position optique vers le bas. Si une plaque de puits sombre de 96 est utilisée, réglez la position optique vers le haut. Programmez une course cinétique avec un temps de numérisation de deux heures toutes les 30 minutes.
Reconstituer le tampon d’analyse 20S 10X fourni dans le kit avec 13,5 millilitres d’eau ultrapure. Ajouter 14 microlitres de 100 millimolar ATP au tampon maintenant 1X. Cela améliore considérablement l’activité protéasome dans les échantillons et améliore la fiabilité des analyses.
Reconstituer la norme AMC fournie dans le kit avec 100 microlitres de DMSO. Effectuez des étapes en utilisant la norme AMC dans l’obscurité ou dans des conditions de faible lumière car la norme est sensible à la lumière. Créez une courbe standard d’AMC à partir d’une série de concentrations élevées à faibles d’AMC.
Cette courbe sera utilisée pour l’étalonnage des lecteurs de plaques et l’analyse de l’activité protéasome dans les échantillons homogénéisés. Reconstituer le sous-titre protéasome fourni dans le kit avec 65 microlitres de DMSO. Effectuez également cette étape dans l’obscurité ou dans des conditions de faible lumière car le substrat est sensible à la lumière.
Créez ensuite une dilution d’un à 20 du substrat protéasome dans un nouveau tube de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre à l’aide d’un tampon d’essai 20S. Ajouter une quantité normalisée des échantillons désirés à une plaque de puits de 96. Exécutez chaque échantillon en double.
La quantité d’échantillon nécessaire varie en fonction de la préparation des tissus. En général, 10 à 20 microgrammes suffisent à toute fraction subcellulaire. Porter le volume du puits de l’échantillon à 80 microlitres avec de l’eau ultrapure.
Le montant ajouté dépend du volume d’échantillon ajouté. Dans deux puits distincts, ajouter 80 microlitres d’eau seuls. Ce seront les blancs d’analyse.
Ajouter 10 microlitres de tampon d’analyse 20S à chaque puits, y compris les blancs d’essai. Utilisez un répéteur ou une pipette automatisée pour assurer un volume d’analyse constant dans les puits. Éteignez les lumières ou entrez dans une pièce sombre.
Ajoutez les 100 microlitres de normes AMC diluées à un nouveau puits à l’aide d’un seul puits pour chaque norme. Dans l’obscurité, utilisez un répéteur ou une pipette automatisée pour ajouter 10 microlitres de substrat protéasome dilué aux puits contenant des blancs d’échantillon et d’essai, mais pas la norme AMC. Placez la plaque dans le lecteur de plaque et commencez la course cinétique.
Effectuer la quantification de diverses étiquettes de polyubiquitine dans différentes fractions subcellulaires prélevées dans le tissu cérébral des rongeurs à l’aide d’une variété de protocoles standard de ballonnement occidental en combinaison avec des anticorps uniques en polyubiquitine spécifiques au lien. Certaines images de tache occidentale d’ubiquitine fourniront des colonnes de bandes distinctes tandis que d’autres produisent le modèle de frottis-comme avec peu ou pas de lignes claires. Pour quantifier les taches occidentales d’ubiquitine image, dessinez une boîte autour de la colonne qui prolonge toute l’échelle des normes moléculaires.
Ajustez la boîte si la coloration d’ubiquitine s’étend à travers toute l’échelle. Ceci est commun pour la lysine 48 modifications et varie considérablement d’un compartiment subcellulaire à l’autre. Enfin, soustrayez l’arrière-plan qui est calculé comme la densité optique moyenne de l’arrière-plan entourant immédiatement la colonne de tous les côtés.
On voit ici la quantification de l’activité protéasome en différentes fractions prélevées sur l’amygdale latérale du même animal. Pendant l’essai in vitro d’activité de protéasome, les unités fluorescentes relatives détectées ont augmenté du début à la fin de l’essai dans la fraction synaptique, la fraction cytoplasmique, et la fraction nucléaire. Le bêta-lac inhibiteur du protéasome a empêché les RFUs de changer tout au long de la session.
Des différences subcellulaires ont été observées dans l’activité protéasome dans l’amygdale latérale du même animal. Une augmentation de l’activité de protéasome nucléaire a été détectée chez les animaux formés par rapport aux contrôles qui correspondaient à une diminution de l’activité dans la fraction synaptique. L’activité protéasome cytoplasmique est restée à la ligne de base.
On y voit des différences subcellulaires dans l’ubiquitination protéique spécifique au lien dans l’amygdale latérale du même animal après l’apprentissage. Il y avait une augmentation de l’ubiquitination globale dans la fraction nucléaire suivant l’apprentissage qui s’est corrélée avec une diminution de la fraction cytoplasmique. Après l’apprentissage, l’ubiquitination linéaire a augmenté dans la fraction nucléaire mais pas les fractions cytoplasmiques ou synaptiques.
Fait intéressant, l’ubiquitination K63 a augmenté dans la fraction nucléaire après l’apprentissage qui s’est corrélé avec une diminution de la fraction synaptique. Alors que l’uniquitination K48 a augmenté dans les fractions nucléaires et cytoplasmiques après l’apprentissage, mais pas dans la fraction synaptique. Ce protocole peut également être utilisé pour comprendre la distribution subcellulaire et la fonction d’autres protéines chez le même animal.
