Ce protocole permet d’évaluer l’ubiquitylation d’un substrat spécifique par une ligase E3. Nous savons que la caractérisation de l’interaction ligase-substrat est cruciale pour comprendre leur fonction dans les cellules. Cette technique ne nécessite pas de réactifs coûteux ou d’équipement sophistiqué.
Il a besoin de plasmides et de codage des gènes d’intérêt, de développement d’un test d’immunoprécipitation avec des lysats cellulaires et d’un transfert western pour détecter l’ubiquitylation du substrat. Plusieurs maladies humaines comme le cancer et les troubles neurologiques sont associées à un dérèglement de la ligase E3. Par conséquent, l’identification de l’ubiquitylation du substrat par une ligase E3 spécifique pourrait aider à traiter ou à diagnostiquer ces maladies.
La démonstration de la procédure sera faite par Valentine Spagnol. Pour commencer, cultivez la lignée cellulaire HEK293T jusqu’à une confluence de 80 à 90% dans le milieu Eagles modifié de Dulbecco complété par 10% de sérum bovin fœtal et 100 unités de pénicilline, 100 microgrammes de streptomycine et 0,292 milligrammes par millilitres de L-glutamine. Ensuite, incubez cette culture à 37 degrés Celsius dans un incubateur de culture cellulaire humidifié à 5% de dioxyde de carbone.
Passage des cellules en aspirant le milieu de la boîte de culture à l’aide d’une pipette sérologique et lavez-les une fois avec un millilitre de PBS 1X stérilisé. Ensuite, détachez les cellules en ajoutant un millilitre de solution d’acide éthylènediaminetétraacétique de trypsine et après cinq minutes d’incubation à 37 degrés Celsius, remettez ces cellules en suspension dans deux millilitres de milieu de croissance à l’aide d’une pipette sérologique. Transférer la suspension cellulaire dans un tube frais et propre de 15 millilitres et centrifuger à 500 fois G pendant cinq minutes à température ambiante.
Ensuite, retirez doucement le surnageant et remettez en suspension la pastille cellulaire dans trois millilitres de milieu de croissance en pipetant de haut en bas pour obtenir une suspension cellulaire homogène. Ensuite, transférez un millilitre de cette suspension cellulaire dans une boîte de culture de 100 millimètres traitée par TC contenant neuf millilitres de milieu de croissance. Avant la transfection, certifier si les cellules sont exemptes de contamination et à une confluence adéquate pour les transfections transitoires.
Pour chaque échantillon de transfection, préparer les complexes ADN-polyéthylèneimine en diluant trois microgrammes de chaque plasmide dans 100 microlitres de milieu sérique réduit Opti-MEM 1 sans supplémentation et en le mélangeant doucement en pipetant la solution de haut en bas. Ensuite, décongelez l’ADN-polyéthylèneimine à température ambiante et ajoutez-le dans la solution en suivant une proportion de trois microlitres d’ADN-polyéthylèneimine pour un microgramme d’ADN. Homogénéiser la solution en pipetant de haut en bas.
Ensuite, incubez-le pendant 15 minutes à température ambiante pour permettre la formation de complexes ADN-polyéthylèneimine. Ajouter le volume total de complexes ADN-polyéthylèneimine à chaque plat contenant la culture cellulaire et mélanger doucement en berçant la plaque d’avant en arrière. Ensuite, incubez ces cellules à 37 degrés Celsius dans un incubateur de culture cellulaire humidifié.
Après l’incubation et six heures avant la lyse cellulaire, traiter les cellules transfectées avec un inhibiteur du protéasome 10 micromolaires MG132 et incuber les cellules dans l’incubateur de culture cellulaire humidifié. Ensuite, aspirez le milieu de chaque boîte de culture à l’aide d’une pipette sérologique et lavez les cellules une fois avec un millilitre de 1X PBS. Ensuite, détachez les cellules en ajoutant un millilitre de trypsine et incubez le plat à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes.
Resuspensez les cellules dans un millilitre de milieu de croissance et transférez la suspension cellulaire dans un microtube frais et propre de deux millilitres et centrifugez-la à 500 fois G pendant cinq minutes à température ambiante. Une fois la centrifugation terminée, retirez le surnageant en le versant soigneusement et remettez doucement en suspension la pastille cellulaire dans 200 microlitres de tampon de lyse MP40 glacé complété par le cocktail d’inhibiteurs de la protéase et de la phosphatase. Transférez ensuite cette solution dans un microtube propre de 1,5 millilitre.
Incuber cette cellule lysat pendant 30 minutes sur de la glace, et après l’incubation, centrifuger la cellule lysats à 16 900 fois G pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius. Pendant ce temps, équilibrez les perles anti-HA d’agarose avec un tampon de lyse MP40 glacé. Utilisez 15 microlitres de perles anti-HA d’agarose pour chaque échantillon.
Lavez les billes avec 200 microlitres de tampon de lyse MP40 en les pulsant dans un tube de microcentrifugation à 3 000 fois G pendant une minute à quatre degrés Celsius. Ensuite, aspirez et jetez soigneusement le surnageant avec une pipette et répétez ce processus trois fois. Ensuite, gardez les perles équilibrées sur de la glace jusqu’à utilisation.
Après avoir centrifugé les lysats cellulaires, récupérer le surnageant et quantifier la teneur en protéines dans le lysat total en utilisant la méthode de Bradford pour s’assurer que chaque échantillon soumis à l’immunoprécipitation présente une quantité égale de protéines. Incuber le volume nécessaire de lysat cellulaire avec les billes anti-HA d’agarose équilibrées pendant quatre heures, en tournant doucement dans un incubateur rotatif à quatre degrés Celsius, ce qui permet à l’UXT-V2-HA de se lier aux billes anti-HA d’agarose. Recueillir les billes anti-HA d’agarose en les pulsant dans un tube de microcentrifugation à 3 000 fois G pendant une minute à quatre degrés Celsius.
Aspirer soigneusement et jeter le surnageant. Lavez les perles trois fois avec un tampon de lyse cellulaire MP40 glacé et deux fois avec un tampon FLAG HA glacé. Après le lavage final, retirez soigneusement tout le surnageant à l’aide d’une pipette et éluez la protéine poly-ubiquitylée avec 300 microgrammes par millilitre de peptide HA dilué sur le tampon FLAG HA.
Incuber les billes anti-HA d’agarose avec du peptide HA pendant une heure à quatre degrés Celsius dans une plate-forme shaker à bascule. Ensuite, faites tourner les perles à 3 000 fois G pendant deux minutes à quatre degrés Celsius et retirez soigneusement le surnageant contenant les protéines poly-ubiquitinées. Si nécessaire, conservez l’éluant dans un microtube frais et propre à moins 20 degrés Celsius.
Résoudre les éluants et les lysats cellulaires dans l’électrophorèse et l’immunoblotting en gel de polyacrylamide de dodécylsulfate de sodium à 10%. Pour effectuer un transfert humide Western blotting, placez le gel dans un sandwich de transfert composé de papier filtre, de papier filtre à membrane de gel, amortissez-le avec des tampons et pressez-le ensemble par une grille de support. Ensuite, placez ce système verticalement dans un réservoir rempli de tampon de transfert entre les électrodes en acier inoxydable ou en fil de platine.
Le transfert se produit pendant 90 minutes à 150 volts dans un tampon de transfert humide. Enfin, sondez la membrane de l’immunoblot à l’aide d’anticorps anti-myc. La poly-ubiquitylation spécifique de l’UXT-V2-HA médiée par la protéine F-box 7 dans les cellules a été observée après avoir sondé l’éluant de l’immunoprécipitation anti-HA avec un anticorps anti-myc, qui détecte le myc-ub conjugué au substrat.
La spécificité de l’anti-myc pour le substrat poly-ubiquitylé a été visualisée dans les voies un et deux, dans lesquelles un frottis de protéines poly-ubiquitylées n’a pas été détecté lorsque les cellules ont été co-transfectées avec la protéine F-box 7 et myc-ub en l’absence de plasmide UXT-V2-HA. De plus, aucun frottis correspondant à la poly-ubiquitination des protéines n’a été visualisé dans la combinaison de la protéine F-box 7 et de l’UXT-V2-HA sans le plasmide myc-ub. Lorsqu’un mutant de la protéine F-box 7 ou de la protéine F-box 7 de type sauvage à vecteur vide incapable d’assembler le SCF actif a été transecté en combinaison avec UXT-V2-HA et myc-ub, un fort signal de frottis d’UXT-V2 poly-ubiquitylé n’a été observé que pour la protéine F-box 7 de type sauvage, suggérant que l’UXT-V2 était poly-ubiquitylé par le complexe et les cellules de la protéine SCF F-box 7 par rapport aux témoins.
Les étapes de monoprécipitation, y compris l’incubation des lysats cellulaires avec les billes équilibrées et l’élution des protéines immunoprécipitées, sont essentielles pour atteindre l’objectif de ce protocole. Après cette procédure, un test d’ubiquitylation in vitro doit être effectué pour confirmer la spécificité de l’ubiquitylation du substrat par la ligase E3.
