Les auteurs tiennent à remercier Travis Wheeler et l&#39;atelier d&#39;usinage au Département de Biologie Cellulaire et Physiologie, Université de Pittsburgh pour la construction du stade de l&#39;échantillon cryo-fluorescence, Changlu Tao et Cheng Xu à l&#39;Université des Sciences et Technologies de Chine pour des raisons techniques assistance, et le Dr Teresa Brosenitsch pour la lecture critique du manuscrit. Ce travail a été soutenu par le National Institutes of Health (GM082251 &amp; GM085043).

1. HeLa culture cellulaire sur le carbone, plaquée or EM Finder Grids <ol><li> La décharge luminescente du côté de carbone d&#39;un R2 de 200 mesh / 2 Quantifoil or EM finder grille de moins de 25 mA pendant 25 sec. </li><li> Manteau de la grille EM avec de la fibronectine, par celle-ci, du côté de carbone flottant vers le bas, sur une gouttelette 40 ul de 50 pg / solution de fibronectine ml, puis désinfecter sous lumière UV pendant 2 h dans une hotte de culture de tissus. </li><li> Cellules plaque HeLa sur la grille à une densité de 2 x 10 4 cellules / ml (culture totale de 2 ml) dans une boîte de culture à fond de verre et de croître les cellules à 37 ° C, avec 5% de CO 2, dans du DMEM supplémenté avec 4,5 g / L-glutamine et du glucose, 10% de sérum inactivé par la chaleur de veau foetal, 100 unités / ml de pénicilline et 100 pg / ml de streptomycine pendant environ 18 heures. Des cellules HeLa sont infectées après O / N culture. </li></ol> 2. Infection VIH-1 et des cellules vivantes Imaging <ol><li> Ajouter un tracker de cellules fluorescentes (Red CMTPX, 1 pl / 2 ml) à la culture à fond de verreAntenne (de l&#39;étape 1.3) et incuber le plat à 37 ° C pendant 10 minutes, pour permettre la mise prennent du colorant fluorescent. </li><li> Laver les cellules avec du PBS et ajouter 50 ul du milieu frais préchauffé. </li><li> Placer la capsule sur la chambre de cellule vivante, à 37 ° C, d&#39;un champ balayé microscope confocal du scanner. Sélectionner plusieurs champs (10-15 positions) qui contiennent 1-3 cellules / carrés, avec des cellules entre deux phases de la mitose quand ils sont plus étalée et plat (voir les figures 2c et 2d), depuis cryoEM exige régions relativement minces de l&#39; échantillon. Conservez ces positions pour l&#39;imagerie avenir (étape 2.5). </li><li> Infecter les cellules avec VSV-G particules pseudo-typés VIH-1 qui contiennent GFP-Vpr (nous utilisons 40 pl d&#39;un échantillon contenant 40 ng / ml de p24). Lors de l&#39;ajout des particules virales dans le fond du plat, faire attention de ne pas perturber le réseau EM, depuis les positions de l&#39;imagerie ont déjà été sélectionnés et stockés. </li><li> Immédiatement après l&#39;ajout de virions, recueillir timoi-lapse images confocale 3D à grande vitesse, aux positions précédemment sélectionnés (à partir de l&#39;étape 2.3) pour 20-40 min. </li><li> Les images confocales ont été acquises à l&#39;aide MetaMorph et analysées par suivi de particules en 3D automatisé pour la dynamique des particules simples en utilisant un logiciel Imaris (voir la figure 1). Puisque nous sommes corréler le comportement dynamique de diffraction limitée VIH-1 particules avec ultrastructure cellulaire, imagerie des cellules vivantes time-lapse et le suivi de particules en 3D sont essentiels pour les résultats. Cependant, pour une grande structure statique, une image de fluorescence simples (sans cellules vivantes) serait suffisante pour l&#39;analyse corrélative. </li></ol> 3. Frozen-hydraté EM Préparation des échantillons Pour réduire au minimum le délai entre le prélèvement de la dernière image confocale et cryo-fixation de l&#39;échantillon, le FEI Vitrobot (ou autre dispositif de vitrification) doit être initié et préparé pour plonger de congélation lors de la collecte des images des cellules vivantes confocale de fluorescence.<ol><li> Allumez le dispositif de vitrification et définir sa température climatique à 22 ° C, l&#39;humidité de l&#39;objectif de 100%, le temps buvard à 7 sec, et le temps d&#39;attente et le temps s&#39;écouler à 1 sec. </li><li> Placez la boîte de rangement de grille dans le plongeur Dewar et préparer l&#39;éthane liquide froid. Monter le vase de Dewar sur le dispositif de vitrification. </li><li> Immédiatement après imagerie des cellules vivantes confocal (section 2), placez la boîte de culture sur un bloc de cuivre refroidi à la glace et de la transférer à la salle de préparation des échantillons cryoEM. Chargez la grille EM sur les pinces spécialisées et rapidement effacer loin des médias sur la grille. Le buvard est fait manuellement, avec un papier filtre, puis 4 pi de solution de perle d&#39;or de 15 nm mélangé avec 0,2 um microsphères fluorescentes est immédiatement placé sur la grille. Les perles d&#39;or sont utilisés comme marqueurs de référence pour faciliter la collecte des données de tomographie et d&#39;alignement. Les microsphères fluorescentes sont utilisées pour faciliter la corrélation entre les images fluorescentes et cryoEM (voir les figures 2c-2F). </li><li> Chargez les pinces sur le dispositif de vitrification et de charger le dispositif d&#39;effacer et de plonger gel dans l&#39;éthane liquide 16. Les paramètres buvards optimisés pour obtenir le meilleur résultat sont les suivants: temps de transfert, 7 sec; blot offset, 0; temps de vidange, 1 sec, la température, 22 ° C et humidité de 100%. </li><li> Transférer la grille congelés hydraté à un titulaire cryoEM pour l&#39;imagerie cryoET immédiat, ou à un stockage d&#39;azote liquide Dewar pour une utilisation ultérieure. </li></ol> 4. Cryo-microscopie de fluorescence lumière Un système de fabrication artisanale, la chambre de l&#39;échantillon cryo-fluorescence et le stade (figure 3) est nécessaire pour réaliser les étapes 04.01 au 04.10. Les spécifications détaillées et la description de la scène se trouvent à Jun et al. 15. <ol><li> Remplissez un azote liquide auto-pressurisé Dewar d&#39;azote liquide au moins 2 heures avant de commencer la microscopie cryo-lumière de fluorescence (voir Figure 3a). </li><li> Monter une fabrication artisanale cryo-fétage d&#39;échantillon luorescence 15 (figure 3) sur un microscope optique inversé à fluorescence, tel qu&#39;un Olympus IX 71. </li><li> Relier l&#39;entrée de l&#39;azote liquide de l&#39;étage cryogénique d&#39;échantillon du vase de Dewar auto-pressurisé et placer la sortie de trop-plein d&#39;azote liquide dans un récipient approprié. Raccorder une conduite de gaz d&#39;azote sec à une douille placée sur la lentille d&#39;objectif afin de maintenir la lentille chaud et exempt de gel. </li><li> Placer une plate-forme de bloc de cuivre (flèche noire sur la figure 3b) dans la chambre de cryo-étape pour charger la grille d&#39;échantillon congelé-hydraté. Refroidir et remplir la chambre de cuivre de la cryo-étape avec de l&#39;azote liquide au travers de la conduite d&#39;entrée de l&#39;auto-pression de remplissage de Dewar. </li><li> Lorsque le cryo-étape atteigne la température de l&#39;azote liquide (à ~ 4-6 min), transférer le récipient de stockage de grille (de l&#39;étape 3.5) pour la cryo-étape. </li><li> Placer la grille d&#39;échantillon congelé-hydraté dans la cartouche d&#39;échantillon EM sur le bloc de cuivre et de couper le gdébarrasser en place en utilisant un C-anneau (si vous utilisez une cartouche de microscope Polara), ou placer un anneau de cuivre pré-refroidi en haut (flèche noire sur la figure 3d), pour maintenir le réseau en place et aussi pour faciliter la récupération de la grille après imagerie cryo-fluorescence (si un microscope cryo-électronique non Polara). </li><li> Placer la cartouche (de l&#39;étape 4.6) dans la chambre intérieure de la cryo-étape (tête de flèche blanche sur la figure 3b). </li><li> Cherchez et trouvez les mêmes particules virales à partir des données d&#39;imagerie des cellules vivantes. Depuis la grille EM a un indice, il est facile de localiser la même particule sur la grille dans les deux images des cellules vivantes et des images cryo-florescence. </li><li> Acquérir cryo-DIC et images GFP dans les postes identifiés sous cryo-état à l&#39;aide d&#39;un microscope optique avec un long travail (2.7-4 mm) d&#39;objectif. Au cours de l&#39;imagerie cryo-fluorescence, vérifier périodiquement le niveau d&#39;azote liquide dans la cryo-stade et le remplir, au besoin, pour maintenir la phase d&#39;échantillonnage ci-dessous -170° C. </li><li> A l&#39;issue de l&#39;imagerie cryo-fluorescence, retourner avec précaution la cartouche d&#39;échantillon de la plate-forme de bloc de cuivre et de stocker la cartouche dans un vase de Dewar d&#39;azote liquide pour l&#39;analyse de cryoET futur d&#39;un système Polara. Si vous utilisez un microscope cryo-électronique non Polara, retirer l&#39;anneau de cuivre, de récupérer la grille d&#39;échantillonnage, placez-le dans une boîte de rangement de grille, et stocker l&#39;échantillon dans de l&#39;azote liquide jusqu&#39;à ce que le vase de Dewar échantillon est examiné par cryoET. </li><li> Pour l&#39;analyse des données, chevaucher les cryo-DIC et GFP images acquises (de l&#39;étape 4.9, voir la figure 4b) et de corréler les positions des signaux de GFP dans l&#39;image cryo-fluorescence avec ceux obtenus dans la série imagerie des cellules vivantes. </li></ol> 5. Tomographie cryo-électronique <ol><li> Charger la cartouche de prélèvement dans le poste de transfert de cryo-microscopie électronique équipé d&#39;un canon à émission de champ, telles que Polara G2 microscope. </li><li> Mode sous faible dose recherche à un grossissement de 140X, identifier et enregistrer les cases de la grille associés (provenant de l&#39;étape 4.11) dans un fichier de scène. </li><li> Dans le mode à faible dose recherche à un grossissement de 3500 X, insérez un 100 um objectif d&#39;ouverture, de recherche et de sauvegarder toutes les positions en corrélation avec les signaux GFP dans un second fichier de scène. </li><li> En mode dose-exposition faible, trouver un espace vide pour ajuster l&#39;intensité du faisceau à une dose de 1 ou 2 e - / A 2 et affiner l&#39;axe de basculement, en utilisant la fonction y en scène, en brûlant la glace dans une région de carbone sans importance avec plusieurs perles d&#39;or. </li><li> Dans le mode à faible dose au point, régler la distance de mise au point ~ 3 um et ajuster l&#39;angle d&#39;aligner la direction de se concentrer pour être parallèle à l&#39;axe de basculement. </li><li> Dans le mode à faible dose recherche, rappelons positions enregistrées (de l&#39;étape 5.3), ajuster la hauteur de eucentrique des échantillons et vérifier la plage d&#39;inclinaison de la zone d&#39;intérêt. Acquérir une image de projection avec une dose d&#39;électrons très faible (~ 1 e - / a 2) à 8 à 10 um défocalisation, en expositionMode ure, afin de confirmer les particules virales corrélées pour la tomographie cryo-électronique. </li><li> Passez en mode faible dose-focus. En TEM menu des fonctions auto, faites précéder la hauteur eucentrique automatisé et des fonctions se concentrer sur la zone de mise au point. </li><li> Définissez les paramètres pour l&#39;acquisition d&#39;une inclinaison de la série. Pour la figure 4 dans le présent document, les angles d&#39;inclinaison allant ± 70 °, en dessous et au-dessus de 45 °, au 3 ° et 2 ° par incréments d&#39;inclinaison, respectivement, ont été utilisés, avec un 6 um défocalisation et environ 70 e - / A 2 dose totale. </li><li> Répétez les étapes 5.7 et 5.8 pour toutes les positions enregistrées. Logiciel Batch tomographie peut être utilisé pour la collecte automatisée de données à de multiples positions pour augmenter le débit. </li></ol> 6. Reconstruction en trois dimensions à l&#39;aide IMOD 17 <ol><li> Contrôler la série d&#39;inclinaison brut pour ajuster les valeurs minimale et maximale et la densité de déterminer s&#39;il existe une vue d&#39;être exclus à cause de grand décalage de l&#39;image. </li><li> Commencez eTomo et le panneau de configuration à l&#39;aide de tomographie type d&#39;axe, la taille du pixel, diamètre de repère, etc. Ensuite, créer des scripts de com. </li><li> Configurez la fenêtre principale de telle sorte que plusieurs étapes du calcul de tomographie peuvent être ajustés / suivis simultanément. Modifiez les paramètres nécessaires et exécuter les programmes spécifiques qui sont requis par chaque étape de traitement (voir eTomo tutoriel, <a href="http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/etomoTutorial.html" target="_blank">http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/etomoTutorial.html</a> ). </li><li> Lors de la dernière étape, créer une pile complète alignée (avec une erreur résiduelle moyenne inférieure à 0,6) et de reconstruire tomographies en utilisant un algorithme de rétro-projection pondérée dans IMOD. </li><li> Denoise domaines d&#39;intérêts potentiels en utilisant un programme d&#39;amélioration de la diffusion anisotrope non linéaire 3D de pointe mises en œuvre dans IMOD avec les paramètres appropriés pour améliorer le contraste et la clarté. </li></ol>

<ol>
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L., Zhang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+structure+determination+of+native+mammalian+cells+using+cryo-FIB+and+cryo-electron+tomography.">3D structure determination of native mammalian cells using cryo-FIB and cryo-electron tomography.</a> Journal of Structural Biology. 180, 318-326 (2012).</li><li>Sartori, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+microscopy:+bridging+the+gap+between+fluorescence+light+microscopy+and+cryo-electron+tomography.">Correlative microscopy: bridging the gap between fluorescence light microscopy and cryo-electron tomography.</a> Journal of Structural Biology. 160, 135-145 (2007).</li><li>Schwartz, C. L., Sarbash, V. I., Ataullakhanov, F. I., McIntosh, J. 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R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer+visualization+of+three-dimensional+image+data+using+IMOD.">Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD.</a> Journal of Structural Biology. 116, 71-76 (1996).</li><li>Whitfield, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+genes+periodically+expressed+in+the+human+cell+cycle+and+their+expression+in+tumors.">Identification of genes periodically expressed in the human cell cycle and their expression in tumors.</a> Molecular Biology of the Cell. 13, 1977-2000 (2002).</li><li>Agronskaia, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+fluorescence+and+transmission+electron+microscopy.">Integrated fluorescence and transmission electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 164, 183-189 (2008).</li><li>Marko, M., Hsieh, C., Schalek, R., Frank, J., Mannella, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focused-ion-beam+thinning+of+frozen-hydrated+biological+specimens+for+cryo-electron+microscopy.">Focused-ion-beam thinning of frozen-hydrated biological specimens for cryo-electron microscopy.</a> Nature Methods. 4, 215-217 (2007).</li></ol>

Les auteurs déclarent aucun intérêt financier concurrents.

Nous avons présenté un ensemble simple de protocoles pour fournir une approche corrélative de pointe pour analyser les événements cellulaires dynamiques en utilisant time-lapse imagerie confocale de fluorescence, des cellules vivantes suivie par cryoET. Notre développement méthodologique de corréler imagerie des cellules vivantes 3D à haute résolution cryoET est essentiel d&#39;étudier de nombreux problèmes biologiques complexes, telles que la visualisation rares dynamiques et diffraction des particules vira...

Tomographie cryo-électronique (cryoET) est une puissante technique d&#39;imagerie qui permet la visualisation en trois dimensions (3D) de cellules et de tissus et fournit un aperçu de l&#39;organisation des organites indigènes et les structures cellulaires à la résolution moléculaire dans un proche de l&#39;état physiologique 1. Cependant, la nature, faible contraste de unstained spécimen congelé hydraté, combinée avec leur sensibilité aux rayonnements, il est difficile de localiser les zones d&#39;intérêt à l&#39;intérieur d&#39;une cellule et effectuer ensuite la série inclinaison succès sans endommager la zone cible. Afin de surmonter ces problèmes, une approche corrélative qui combine la microscopie optique et électronique est nécessaire. Les caractéristiques spécifiques mis en évidence par un marquage fluorescent sont identifiés et localisés par microscopie optique à fluorescence, puis leurs coordonnées sont transférés à la microscopie électronique pour l&#39;acquisition de la résolution des données structurelles élevées 3D. Cette méthode permet de localiser corrélative la cible d&#39;unereas d&#39;intérêt à traiter. En raison de la limitation de l&#39;épaisseur de l&#39;échantillon avec cryoEM (&lt;300 nm), actuellement seules les régions périphériques de la cellule sont appropriés pour l&#39;analyse structurale 3D par CryoET. Réduire encore l&#39;épaisseur des échantillons congelés-hydratés par vitré coupe 8 ou par cryo-faisceau d&#39;ions focalisé (FIB) fraisage 9 augmenterait la capacité de l&#39;imagerie corrélative. Auparavant, les méthodes corrélatives ont été principalement utilisés pour faciliter l&#39;acquisition des données cryoET pour les grandes structures et statique 10-13. Dans ces études, cryo-étapes ont été mises en place pour accepter les grilles de cryoEM et monter soit sur ​​un microscope droit ou d&#39;un microscope inversé 10,11,14. Bien que des grilles de commutation semble assez simple dans leurs conceptions, il existe d&#39;autres étapes pour transférer la grille EM, qui augmente les chances que la grille peut être déformé, endommagé et contaminé. Nous avons récemment démontré un progrès technique dansmicroscopie corrélative qui nous permet de visualiser directement des événements dynamiques qui sont par nature difficiles à saisir, comme le VIH-1 et interactions de la cellule hôte à des stades précoces de l&#39;infection 15. Nous y sommes parvenus en concevant et réalisant une étape d&#39;échantillonnage cryo-microscopie lumière qui adapte un système de cartouches pour minimiser les dégâts de l&#39;échantillon due à la manipulation de la grille, facilitant ainsi la corrélation. Notre conception comprend un support de la cartouche d&#39;échantillon intégré, permettant à la fois la cryo-microscopie lumineuse et cryo-électronique à effectuer, de manière séquentielle, sur le même porte-échantillon, sans transfert de l&#39;échantillon, rationalisant ainsi le processus corrélatif. En outre, nous avons également mis en place une procédure d&#39;établir une corrélation précise et fiable en utilisant des billes de latex fluorescentes comme marqueurs fiduciaires.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM 4.5 g/L Glucose w/ L-Glutamine</td>
			<td>Atlanta Biologicals, Inc. Lawrenceville, GA</td>
			<td>12-604F</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Sigma, St. Louis, MO</td>
			<td>F1141-1MG</td>
			<td>HeLa cell culture on EM grids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell tracker</td>
			<td>Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA</td>
			<td>C34552</td>
			<td>Red CMTPX</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein A gold conjugates</td>
			<td>Ted Pella, Inc., Redding, CA</td>
			<td>15822-1</td>
			<td>15 nm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 &mu;m fluorescent microspheres</td>
			<td>Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA</td>
			<td>F8811</td>
			<td>Yellow-green fluorescent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat-inactivated fetal calf bovine serum</td>
			<td>Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA</td>
			<td>10082-139</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass-bottom culture dish</td>
			<td>MatTek Corporation</td>
			<td>P35G-1.5-14-C</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gold quantifoil finder EM grids</td>
			<td>Quantifoil Micro Tools, Jena, Germany</td>
			<td>R2/2 Au NH2 200 mesh</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA</td>
			<td>70011-044</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glow-discharge device 100X</td>
			<td>EMS, Hatfield, PA</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tecnai Polara G2 electron microscope with a Field Emission Gun</td>
			<td>FEI, Hillsboro, OR</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>300 keV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitrobot Mark III</td>
			<td>FEI, Hillsboro, OR</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus IX 71 microscope</td>
			<td>Olympus America Inc., Center Valley, PA</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>LUCPlanFLN 40X/0.6 NA (2.7-4 mm working distance) objective lens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon TiE microscope</td>
			<td>Nikon Instruments, Melville, NY</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>using a 60X/1.35 NA oil immersion objective lens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sweptfield confocal microscope</td>
			<td>Prairie Technologies, Middleton, WI</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tokai Hit live cell chamber</td>
			<td>Tokyo, Japan</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryo-fluorescence sample stage</td>
			<td>Home-made</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Homebuilt by machine shop, see reference 15 for the design.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

correlative microscopy for 3d structural analysis of dynamic interactions

Tomographie cryo-électronique (cryoET) permet la visualisation 3D des structures cellulaires à la résolution moléculaire dans un état ​​proche de l&#39;physiologique 1. Toutefois, la visualisation directe des complexes viraux individuels dans leur environnement cellulaire hôte avec cryoET est difficile 2, en raison de la nature peu fréquente et dynamique de l&#39;entrée virale, en particulier dans le cas de HIV-1. Tandis que l&#39;imagerie des cellules vivantes time-lapse a donné beaucoup d&#39;informations sur de nombreux aspects du cycle de vie du VIH-1 3-7, la résolution offerte par microscopie de cellules vivantes est limitée (~ 200 nm). Notre travail visait à développer une méthode de corrélation qui permet la visualisation directe des événements précoces de l&#39;infection au VIH-1 en combinant microscopie fluorescente des cellules vivantes, la cryo-microscopie fluorescente, et cryoET. De cette manière, les signaux des cellules vivantes et cryo-fluorescent peuvent être utilisés pour guider avec précision l&#39;échantillonnage en cryoET. En outre, des informations structurales obtenues cryoET peut be complétée avec les données fonctionnelles dynamiques acquises par imagerie des cellules vivantes de fluorescent cible marquée. Dans cet article, vidéo, nous fournissons des méthodes et des protocoles détaillés de l&#39;enquête structurelle du VIH-1 et interactions de la cellule hôte en utilisant l&#39;imagerie des cellules vivantes 3D corrélative à grande vitesse et haute résolution cryoET analyse structurelle. Des cellules HeLa infectées avec des particules de VIH-1 ont été caractérisés d&#39;abord par microscopie confocale de cellules vivantes, et la région contenant la même particule virale ont ensuite été analysées par tomographie cryo-électronique pour plus de détails structuraux 3D. La corrélation entre les deux ensembles de données d&#39;imagerie, l&#39;imagerie optique et l&#39;imagerie électronique, a été réalisé en utilisant une étape de microscopie optique de fluorescence cryo-maison-bâti. L&#39;approche décrite ici sera utile, non seulement pour l&#39;étude des interactions virus-cellule hôte, mais aussi pour des applications plus larges de la biologie cellulaire, tels que la signalisation cellulaire, le trafic de récepteur membranaire, et de nombreux autres processus cellulaires dynamiques. &lt;/ P&gt;

Pour caractériser le comportement dynamique des particules virales, des cellules HeLa infectées par le VIH-1 ont été imagées par microscopie confocale de cellules vivantes à grande vitesse et les mouvements de particules ont été analysés par suivi de particules en 3D automatisé (Figure 1). Pour éviter le laps de temps de plusieurs minutes qui peuvent survenir entre la collecte de la dernière image confocale des cellules vivantes et plongez-gel (qui peut être assez long pour perdre corrélé...

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Correlative Microscopy for 3D Structural Analysis of Dynamic Interactions

Nous décrivons une méthode de microscopie corrélative qui combine la microscopie à haute vitesse 3D de cellules vivantes fluorescent lumière et de haute résolution tomographie cryo-électronique. Nous démontrons la capacité de la méthode corrélative par imagerie dynamique, les petites VIH-1 particules en interaction avec des cellules HeLa d&#39;accueil.

Microscopie corrélative pour l&#39;analyse structurale 3D des interactions dynamiques

Cryo-electron tomography (cryoET) allows 3D visualization of cellular structures at molecular resolution in a close-to-physiological state1. However, ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

13.9K vues.  University of Pittsburgh School of Medicine. Nous décrivons une méthode de microscopie corrélative qui combine la microscopie à haute vitesse 3D de cellules vivantes fluorescent lumière et de haute résolution tomographie cryo-électronique. Nous démontrons la capacité de la méthode corrélative par imagerie dynamique, les petites VIH-1 particules en interaction avec des cellules HeLa d'accueil.

Vidéo: Correlative Microscopy for 3D Structural Analysis of Dynamic Interactions

Studying the Stoichiometry of Epidermal Growth Factor Receptor in Intact Cells using Correlative Microscopy

This protocol describes the labeling of epidermal growth factor receptor (EGFR) on COS7 fibroblast cells, and subsequent correlative fluorescence microscopy and environmental scanning electron microscopy (ESEM) of whole cells in hydrated state. Fluorescent quantum dots (QDs) were coupled to EGFR via a two-step labeling protocol, providing an efficient and specific protein labeling, while avoiding label-induced clustering of the receptor. Fluorescence microscopy provided overview images of the cellular locations of the EGFR. The scanning transmission electron microscopy (STEM) detector was used to detect the QD labels with nanoscale resolution. The resulting correlative images provide data of the cellular EGFR distribution, and the stoichiometry at the single molecular level in the natural context of the hydrated intact cell. ESEM-STEM images revealed the receptor to be present as monomer, as homodimer, and in small clusters. Labeling with two different QDs, i.e.,&#160;one emitting at 655 nm and at 800 revealed similar characteristic results.

This protocol describes the labeling of epidermal growth factor receptor (EGFR) on COS7 fibroblast cells, and subsequent correlative light- and electron microscopy of whole cells in hydrated state. The label contained fluorescent quantum dots. The protocol can be used to study the stoichiometry of EGFR at the single molecule level.

L&#39;étude de la Stœchiométrie Epidermal Growth Factor Receptor dans des cellules intactes en utilisant la microscopie corrélative

This protocol describes the labeling of epidermal growth factor receptor (EGFR) on COS7 fibroblast cells, and subsequent correlative fluorescence ...

Recherche

Bio-ingénierie

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions. While these studies have been informative about general cell signaling mechanisms, they neglect important cellular cues received from the structural and mechanical properties of the local microenvironment and extracellular matrix (ECM). To understand how cells interact within a physiological ECM, it is important to study them in the context of 3 dimensional assays. Cell migration, cell differentiation, and cell proliferation are only a few processes that have been shown to be impacted by local changes in the mechanical properties of a 3-dimensional ECM. Collagen I, a core fibrillar component of the ECM, is more than a simple structural element of a tissue. Under normal conditions, mechanical cues from the collagen network direct morphogenesis and maintain cellular structures. In diseased microenvironments, such as the tumor microenvironment, the collagen network is often dramatically remodeled, demonstrating altered composition, enhanced deposition and altered fiber organization. In breast cancer, the degree of fiber alignment is important, as an increase in aligned fibers perpendicular to the tumor boundary has been correlated to poorer patient prognosis1. Aligned collagen matrices result in increased dissemination of tumor cells via persistent migration2,3. The following is a simple protocol for embedding cells within a 3-dimensional, fibrillar collagen hydrogel. This protocol is readily adaptable to many platforms, and can reproducibly generate both aligned and random collagen matrices for investigation of cell migration, cell division, and other cellular processes in a tunable, 3-dimensional, physiological microenvironment.

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Collagen is a core component of the ECM, and provides essential cues for several cellular processes ranging from migration to differentiation and proliferation. Provided here is a protocol for embedding cells within 3D collagen hydrogels, and a more advanced technique for generating randomized or aligned collagen matrices using PDMS microchannels.

Préparation de la 3D collagène Gels et microcanaux pour l&#39;étude des interactions 3D<em&gt; In Vivo</em

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions.  While these studies have been informative about general cell signaling ...

Correlative Light- and Electron Microscopy Using Quantum Dot Nanoparticles

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of human pathology tissue using widefield fluorescence light microscopy and transmission electron microscopy (TEM). To demonstrate the protocol we have immunolabeled ultrathin epoxy sections of human somatostatinoma tumor using a primary antibody to somatostatin, followed by a biotinylated secondary antibody and visualization with streptavidin conjugated 585 nm cadmium-selenium (CdSe) quantum dots (QDs). The sections are mounted on a TEM specimen grid then placed on a glass slide for observation by widefield fluorescence light microscopy. Light microscopy reveals 585 nm QD labeling as bright orange fluorescence forming a granular pattern within the tumor cell cytoplasm. At low to mid-range magnification by light microscopy the labeling pattern can be easily recognized and the level of non-specific or background labeling assessed. This is a critical step for subsequent interpretation of the immunolabeling pattern by TEM and evaluation of the morphological context. The same section is then blotted dry and viewed by TEM. QD probes are seen to be attached to amorphous material contained in individual secretory granules. Images are acquired from the same region of interest (ROI) seen by light microscopy for correlative analysis. Corresponding images from each modality may then be blended to overlay fluorescence data on TEM ultrastructure of the corresponding region.

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of epoxy embedded human pathology tissue. We employ commercial antibody fragment conjugated QDs that are visualized by widefield fluorescence light microscopy and transmission electron microscopy.

Corrélative Light- et Microscopie électronique Utilisation de Quantum Dot Nanoparticules

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of human pathology tissue using ...

A High-throughput Cell Microarray Platform for Correlative Analysis of Cell Differentiation and Traction Forces

Microfabricated cellular microarrays, which consist of contact-printed combinations of biomolecules on an elastic hydrogel surface, provide a tightly controlled, high-throughput engineered system for measuring the impact of arrayed biochemical signals on cell differentiation. Recent efforts using cell microarrays have demonstrated their utility for combinatorial studies in which many microenvironmental factors are presented in parallel. However, these efforts have focused primarily on investigating the effects of biochemical cues on cell responses. Here, we present a cell microarray platform with tunable material properties for evaluating both cell differentiation by immunofluorescence and biomechanical cell&#8211;substrate interactions by traction force microscopy. To do so, we have developed two different formats utilizing polyacrylamide hydrogels of varying Young&#39;s modulus fabricated on either microscope slides or glass-bottom Petri dishes. We provide best practices and troubleshooting for the fabrication of microarrays on these hydrogel substrates, the subsequent cell culture on microarrays, and the acquisition of data. This platform is well-suited for use in investigations of biological processes for which both biochemical (e.g., extracellular matrix composition) and biophysical (e.g., substrate stiffness) cues may play significant, intersecting roles.

Cell differentiation is regulated by a host of microenvironmental factors, including both matrix composition and substrate material properties. We describe here a technique utilizing cell microarrays in conjunction with traction force microscopy to evaluate both cell differentiation and biomechanical cell&#8211;substrate interactions as a function of microenvironmental context.

Un haut-débit Plate-forme Cell biopuces pour corrélative Analyse de la différenciation des cellules et des forces de traction

Microfabricated cellular microarrays, which consist of contact-printed combinations of biomolecules on an elastic hydrogel surface, provide a tightly ...

Correlative Light Electron Microscopy (CLEM) for Tracking and Imaging Viral Protein Associated Structures in Cryo-immobilized Cells

Due to its high resolution, electron microscopy (EM) is an indispensable tool for virologists. However, one of the main difficulties when analyzing virus-infected or transfected cells via EM are the low efficiencies of infection or transfection, hindering the examination of these cells. In order to overcome this difficulty, light microscopy (LM) can be performed first to allocate the subpopulation of infected or transfected cells. Thus, taking advantage of the use of fluorescent proteins (FPs) fused to viral proteins, LM is used here to record the positions of the "positive-transfected" cells, expressing a FP and growing on a support with an alphanumeric pattern. Subsequently, cells are further processed for EM via high pressure freezing (HPF), freeze substitution (FS) and resin embedding. The ultra-rapid freezing step ensures excellent membrane preservation of the selected cells that can then be analyzed at the ultrastructural level by transmission electron microscopy (TEM). Here, a step-by-step correlative light electron microscopy (CLEM) workflow is provided, describing sample preparation, imaging and correlation in detail. The experimental design can be also applied to address many cell biology questions.

Correlative Light Electron Microscopy CLEM for Tracking and Imaging Viral Protein Associated Structures in Cryo-immobilized Cells

A correlative light electron microscopy (CLEM) method is applied to image virus-induced intracellular structures via electron microscopy (EM) in cells that are previously selected by light microscopy (LM). LM and EM are combined as a hybrid imaging approach to achieve an integrated view of virus-host interactions.

Corrélatives microscopie électronique léger (CLEM) de suivi et d’imagerie protéine virale associés Structures des cellules immobilisées Cryo

Due to its high resolution, electron microscopy (EM) is an indispensable tool for virologists. However, one of the main difficulties when analyzing ...

Construction of a Multilayered Mesenchymal Stem Cell Sheet with a 3D Dynamic Culture System

Stem cell therapy shows a promising future in regenerating injured organ and tissues, and the cell sheet technique has been developed to improve the low cell retention and poor survival within the target zone. However, during the in vitro construction process, a solution for maintaining stem cell bioactivity and increasing the cell amount within the cell sheet is urgently needed. Here, this protocol presents a method for constructing a multilayered cell sheet with favorable stem cell bioactivity and optimal operability. Decellularized porcine pericardium (DPP) is prepared by phospholipase A2 (PLA2) decellularization method as the cell sheet scaffold, and rat bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) are isolated and expanded as the seeded cells. The temporary multilayered cell sheet structure is constructed by using RAD16-I peptide hydrogel. Finally, the cell sheet is cultured with a dynamic perfusion system to stabilize the three-dimensional (3D) structure, and the cell sheet could be obtained following a 48-hour culture in vitro. This protocol provides an efficient and feasible method for constructing a multilayered stem cell sheet, and the cell sheet could be developed as a favorable stem cell therapy product in the future.

This article provides an efficient and feasible method for constructing multilayered stem cell sheets with favorable stem cell property.

Construction d’une feuille les cellules souches mésenchymateuses multicouche avec un système de Culture dynamique 3D

Stem cell therapy shows a promising future in regenerating injured organ and tissues, and the cell sheet technique has been developed to improve the low ...

Environmental Dynamic Mechanical Analysis to Predict the Softening Behavior of Neural Implants

When using dynamically softening substrates for neural implants, it is important to have a reliable in vitro method to characterize the softening behavior of these materials. In the past, it has not been possible to satisfactorily measure the softening of thin films under conditions mimicking body environment without substantial effort. This publication presents a new and simple method that allows dynamic mechanical analysis (DMA) of polymers in solutions, such as phosphate buffered saline (PBS), at relevant temperatures. The use of environmental DMA allows measurement of the softening effects of polymers due to plasticization in various media and temperatures, which therefore allows a prediction of the materials behavior under in vivo conditions.

To allow reliable predictions of the softening of polymeric substrates for neural implants in an in vivo environment, it is important to have a reliable in vitro method. Here, the use of dynamic mechanical analysis in phosphate buffered saline at body temperature is presented.

Analyse mécanique dynamique environnementale pour prédire le comportement de ramollissement des Implants neurones

When using dynamically softening substrates for neural implants, it is important to have a reliable in vitro method to characterize the softening behavior ...

3D Analysis of Multi-cellular Responses to Chemoattractant Gradients

Various limitations of 2D cell culture systems have sparked interest in 3D cell culture and analysis platforms, which would better mimic the spatial and chemical complexity of living tissues and mimic in vivo tissue functions. Recent advances in microfabrication technologies have facilitated the development of 3D in vitro environments in which cells can be integrated into a well-defined extracellular matrix (ECM) and a defined set of soluble or matrix associated biomolecules. However, technological barriers have limited their widespread use in research laboratories. Here, we describe a method to construct simple devices for 3D culture and experimentation with cells and multicellular organoids in 3D microenvironments with a defined chemoattractant gradient. We illustrate the use of this platform for analysis of the response of epithelial cells and organoids to gradients of growth factors, such as epidermal growth factor (EGF). EGF gradients were stable in the devices for several days leading to directed branch formation in breast organoids. This analysis allowed us to conclude that collective gradient sensing by groups of cells is more sensitive vs. single cells. We also describe the fabrication method, which does not require photolithography facilities nor advanced soft lithography techniques. This method will be helpful to study 3D cellular behaviors in the context of the analysis of development and pathological states, including cancer.

We describe a method to construct devices for 3D culture and experimentation with cells and multicellular organoids. This device allows analysis of cellular responses to soluble signals in 3D microenvironments with defined chemoattractant gradients. Organoids are better than single cells at detection of weak noisy inputs.

Analyse 3D des réponses multi-cellulaires aux gradients chemoattractant

Various limitations of 2D cell culture systems have sparked interest in 3D cell culture and analysis platforms, which would better mimic the spatial and ...

Substructure Analyzer: A User-Friendly Workflow for Rapid Exploration and Accurate Analysis of Cellular Bodies in Fluorescence Microscopy Images

The last decade has been characterized by breakthroughs in fluorescence microscopy techniques illustrated by spatial resolution improvement but also in live-cell imaging and high-throughput microscopy techniques. This led to a constant increase in the amount and complexity of the microscopy data for a single experiment. Because manual analysis of microscopy data is very time consuming, subjective, and prohibits quantitative analyses, automation of bioimage analysis is becoming almost unavoidable. We built an informatics workflow called Substructure Analyzer to fully automate signal analysis in bioimages from fluorescent microscopy. This workflow is developed on the user-friendly open-source platform Icy and is completed by functionalities from ImageJ. It includes the pre-processing of images to improve the signal to noise ratio, the individual segmentation of cells (detection of cell boundaries) and the detection/quantification of cell bodies enriched in specific cell compartments. The main advantage of this workflow is to propose complex bio-imaging functionalities to users without image analysis expertise through a user-friendly interface. Moreover, it is highly modular and adapted to several issues from the characterization of nuclear/cytoplasmic translocation to the comparative analysis of different cell bodies in different cellular sub-structures. The functionality of this workflow is illustrated through the study of the Cajal (coiled) Bodies under oxidative stress (OS) conditions. Data from fluorescence microscopy show that their integrity in human cells is impacted a few hours after the induction of OS. This effect is characterized by a decrease of coilin nucleation into characteristic Cajal Bodies, associated with a nucleoplasmic redistribution of coilin into an increased number of smaller foci. The central role of coilin in the exchange between CB components and the surrounding nucleoplasm suggests that OS induced redistribution of coilin could affect the composition and the functionality of Cajal Bodies.

We present a freely available workflow built for rapid exploration and accurate analysis of cellular bodies in specific cell compartments in fluorescence microscopy images. This user-friendly workflow is designed on the open-source software Icy and also uses ImageJ functionalities. The pipeline is affordable without knowledge in image analysis.

Analyseur de sous-structure : Un flux de travail convivial pour l’exploration rapide et l’analyse précise des corps cellulaires dans les images de microscopie de fluorescence

The last decade has been characterized by breakthroughs in fluorescence microscopy techniques illustrated by spatial resolution improvement but also in ...

Controlled Strain of 3D Hydrogels under Live Microscopy Imaging

External forces are an important factor in tissue formation, development, and maintenance. The effects of these forces are often studied using specialized in vitro stretching methods. Various available systems use 2D substrate-based stretchers, while the accessibility of 3D techniques to strain soft hydrogels, is more restricted. Here, we describe a method that allows external stretching of soft hydrogels from their circumference, using an elastic silicone strip as the sample carrier. The stretching system utilized in this protocol is constructed from 3D-printed parts and low-cost electronics, making it simple and easy to replicate in other labs. The experimental process begins with polymerizing thick (&#62;100 &#956;m) soft fibrin hydrogels (Elastic Modulus of ~100 Pa) in a cut-out at the center of a silicone strip. Silicone-gel constructs are then attached to the printed-stretching device and placed on the confocal microscope stage. Under live microscopy the stretching device is activated, and the gels are imaged at various stretch magnitudes. Image processing is then used to quantify the resulting gel deformations, demonstrating relatively homogenous strains and fiber alignment throughout the gel&#8217;s 3D thickness (Z-axis). Advantages of this method include the ability to strain extremely soft hydrogels in 3D while executing in situ microscopy, and the freedom to manipulate the geometry and size of the sample according to the user&#8217;s needs. Additionally, with proper adaptation, this method can be used to stretch other types of hydrogels (e.g., collagen, polyacrylamide or polyethylene glycol) and can allow for analysis of cells and tissue response to external forces under more biomimetic 3D conditions.

The presented method involves uniaxial stretching of 3D soft hydrogels embedded in silicone rubber while allowing live confocal microscopy. Characterization of the external and internal hydrogel strains as well as fiber alignment are demonstrated. The device and protocol developed can assess the response of cells to various strain regimes.

Souche contrôlée d’hydrogels 3D sous imagerie par microscopie dynamique

External forces are an important factor in tissue formation, development, and maintenance. The effects of these forces are often studied using specialized ...