Nous tenons à remercier les membres du laboratoire Alto pour des discussions utiles. Nous remercions également le Fonds pour l&#39;imagerie moléculaire et cellulaire à l&#39;UT Southwestern Medical Center, en particulier le Dr Chris Gilpin, Tom Januszewski, et Laurie Mueller pour l&#39;expertise technique et des conseils. Nous remercions également le Dr Dong Xionan pour la lecture critique du manuscrit. Ce travail est soutenu par le NIH subvention AI083359 à NMA

1. Culture des cellules de mammifères <ol><li> Rein de rat normal (NRK), immortalisé cancer du col utérin (HeLa), ou d&#39;autres lignées cellulaires de mammifères appropriées sont mises en culture à 37 ° C, 5% de CO 2, sur des lamelles de verre photodécoupe maillées apposées à vivre plats cellulaires (voir le tableau 1 pour n&#39;importe quel réactif ou appareil utilisé dans ce protocole) dans FBS DMEM + 10% et 1% Pen / Strep. Des précautions doivent être prises pour maintenir un environnement stérile lorsque vous travaillez avec des cultures de cellules de mammifères. </li><li> En fonction de votre temps en ligne expérimentale (0-5 heures après l&#39;injection vs 1-2 jours), la confluence de cellules doit être réglée à ~ 50% ou ~ 25%, respectivement. </li></ol> 2. La micro-injection <ol><li> Préparer protéine désirée, de l&#39;ADN ou de petites molécules dans votre choix de tampon, en fonction de la perméabilité à la culture cellulaire, à un volume final de 50 pl ~. Inertes colorants fluorescents tels que Texas Red ou Bleu Cascadesont inclus afin de marquer les cellules micro-injection, le choix du colorant injection et sonde fluorescente doit avoir une excitation non-recouvrement et des longueurs d&#39;onde d&#39;émission. La concentration de votre molécule d&#39;intérêt nécessaire pour la micro-injection devrait être déterminée de manière empirique, et les colorants fluorescents de suivi sont couramment utilisés à 0,5-1,0 mg / ml. En règle générale, la rhodamine ou un autre fluorophore est lié de façon covalente à votre molécule d&#39;intérêt en utilisant un kit commercial, cependant d&#39;autres méthodes de détection peuvent être utilisés en fonction de la sensibilité. Pour plus d&#39;informations, consultez Considérations critiques ci-dessous. </li><li> Filtrer la solution injectée (~ 50 pi) à travers un filtre de 0,22 um centrifuge. Filtres centrifuges sont préférées à vide et / ou la filtration de seringue qui sont associés à des volumes morts. </li><li> Pour générer l&#39;aiguille microinjection, pipettes en verre borosilicate sont retirés à l&#39;aide d&#39;un Flaming-Brown Micropipette Puller suivants les directives du fabricant. Alternativement, la micro-injectionaiguilles peuvent être achetés auprès de fournisseurs, y compris Eppendorf qui rend aiguilles de microinjection Femtotip. </li><li> Pipeter de 4 pi de produit injecté dans l&#39;extrémité de l&#39;aiguille sans encombre à l&#39;aide de micro-injection Eppendorf 20 Femtotips. Assurez-vous qu&#39;aucun des bulles sont présentes au sein de l&#39;aiguille microinjection tiré. Chargez aiguille micro-injection dans le bras micromanipulateur de la InjectMan Eppendorf FemptoJet relié à un microscope inversé. Pour un bon examen de la procédure de micro-injection, le lecteur est invité à un journal précédente de l&#39;article expériences visualisé 8. </li><li> Placez plat cellule vivante avec lamelle quadrillée et des cellules cultivées dans le support plat du microscope Zeiss inversé. Trouvez des cellules en croissance dans une grille de photodécoupe et notez le code alphanumérique grilles, il sera utilisé dans toutes les étapes ultérieures. L&#39;emplacement des cellules au centre de la lamelle couvre-objet comme étapes subséquentes limiter le transfert de l&#39;échantillon au niveau des bords de la lamelle couvre-objet. </li><li> Bras d&#39;injection manuelle inférieure en place sur la lamelle, et en utilisant le joystick micromanipulateur et les contrôles, l&#39;aiguille d&#39;injection plus faible jusqu&#39;à ce que la pointe effleure la surface des cellules cultivées et limites appuyez sur &#39;pour empêcher le mouvement de l&#39;aiguille au-delà de ce point et ainsi briser le fragile tiré en verre de borosilicate. Tous les autres aspects de la micro-injection de cellules sont réalisées selon Eppendorf FemtoJet manuel de l&#39;utilisateur InjectMan. La technique de micro-injection a été récemment utilisée pour comprendre individuels protéines de virulence sécrétés par les bactéries 9. </li><li> Micro-injection toutes les autres cellules dans le réseau choisi. Avec les cellules cultivées à ~ 50% de confluence, on peut s&#39;attendre ~ 80 cellules par 600 um grille 2 (exemple illustré sur la Fig. 3A). Par conséquent, lors de l&#39;inspection microscopie par fluorescence et électronique, il y aura un n ~ expérimentale de 30-40 et les cellules témoins. </li><li> Placez des cellules vivantes plat de nouveau dans la culture de cellules de mammifères incubateur pour souhaitéetemps comme dicté par le dispositif expérimental. Alternativement, on peut passer directement de la micro-injection d&#39;analyse par microscopie time-lapse d&#39;attendre l&#39;apparition de certaines structures subcellulaires d&#39;intérêt avant la fixation. </li></ol> 3. Microscopie fluorescente <ol><li> Si vous le souhaitez, effectuer des cellules vivantes time-lapse mesures de fluorescence de cellules micro-injection, après quoi, remplacez le support avec du glutaraldéhyde à 2,5% en tampon cacodylate 0,1 M (pH 7,4) et incuber pendant 10 min à température ambiante. Toutefois, si cellules vivantes mesures ne sont pas nécessaires, jetez un milieu de croissance des cellules et fixer les cellules avec 5 ml de formaldéhyde à 3,7% en 1xPBS à température ambiante pendant 10 minutes. Jeter fixateur et remplacer avec 5 ml 1xPBS, passez à l&#39;étape 3.2. Remarque: il est essentiel de ne pas ajouter glutaraldéhyde qu&#39;après la microscopie à fluorescence est terminée. </li><li> Placer le plat des cellules vivantes avec lamelle quadrillée photodécoupe dans un microscope à fluorescence (confocale n&#39;est pas nécessaire pour thil&#39;étape d) recueillir et 5-10 de champ lumineux et des images fluorescentes de la grille appropriée pour documenter l&#39;agencement des cellules (Fig. 4A). Identifier les cellules qui ont été micro-injectés à l&#39;aide des longueurs d&#39;ondes d&#39;excitation et d&#39;émission du colorant inerte injection (Fig. 4B). Il est important d&#39;obtenir des images à des grossissements différents (par exemple 10x et 65x) afin de faciliter l&#39;identification des cellules micro-injectés dans les étapes ultérieures impliquant la microscopie électronique. </li><li> En utilisant un microscope confocal à fluorescence, prélever un Z-stack de cellules micro-injection dans le réseau identifié à l&#39;étape 2.5 ci-dessus. Fort grossissement (100x) est nécessaire afin de corréler des images fluorescentes avec des structures subcellulaires qui seront identifiés en microscopie électronique. </li><li> Les lamelles sont retirés du fond des boîtes de cellules vivantes avec un fluide lamelle enlèvement disponible dans le commerce et placée cellule vers le haut dans une boîte de culture cellulaire contenant 5 ml vierge1xPBS. La lamelle est ensuite traitée pour la microscopie électronique tel que décrit ci-dessous. </li></ol> 4. Transmission Electron Microscopy <ol><li> Remplacer tampon 1xPBS avec du glutaraldéhyde à 2 ml de 2,5% en tampon cacodylate 0,1 M (pH 7,4) et incuber à température ambiante pendant 10 minutes. Incubation plus longue, tout en n&#39;étant pas nécessaire, aideront à l&#39;entretien des structures subcellulaires. Remarque: le formaldéhyde seul n&#39;est pas suffisant pour un fixateur EM analyse. </li><li> Éliminer les cellules fixatrices et tache avec l&#39;addition de 2 ml tétroxyde d&#39;osmium à 1% dans 0,1 M de tampon cacodylate pendant 30 min suivie de trois lavages avec le tampon cacodylate et enfin remplacer tous tampon avec ddH 2 O. </li><li> Suite à des protocoles standard EM, déshydrater l&#39;échantillon dans un graduée (70% à 100%) série de l&#39;éthanol. Préparer la résine Epon et lamelle lieu cellule vers le bas au-dessus d&#39;une résine Epon tube rempli. Permettre la polymérisation pendant 24 heures à 60 ° C. En plaçant la lamelle photodécoupe quadrillé côté cellule newn sur la résine Epon, à la fois les cellules d&#39;intérêt, ainsi que le motif de grille est transférée à la résine pendant la polymérisation Epon (exemple représenté sur la Fig. 3B). </li><li> Retirer des lamelles de résine Epon par immersion rapide dans l&#39;azote liquide et / ou de l&#39;eau bouillante. Inspectez la surface de la résine sous un champ binoculaire à dissection pour localiser la grille d&#39;intérêt (note: le crépitement grille de transférer une image miroir). Une lame de rasoir ou un scalpel stérile, de l&#39;assiette du bloc Epon vers le bas de sorte que seule la grille d&#39;intérêt est au sommet du bloc de résine Epon. </li><li> L&#39;aide d&#39;un ultramicrotome, acquérir des coupes en série du bloc compensé à l&#39;épaisseur souhaitée (~ 70 nm d&#39;épaisseur pour TEM conventionnelle et une épaisseur ~ 250 nm pour tomographique TEM). Contraste des sections avec de l&#39;acétate d&#39;uranyle et au citrate de plomb suivant des protocoles standard. </li></ol> 5. Lumière corrélative et microscopie électronique <ol><li> Relocaliser les cellules d&#39;intérêt dansle microscope électronique à partir d&#39;images obtenues dans les étapes précédentes. Une fois que les cellules micro-injectés d&#39;intérêt ont été localisés, utilisez les confocale à haute résolution des images fluorescentes pour identifier les régions à l&#39;intérieur de la cellule qui sont d&#39;intérêt. Image de celles-ci à haute résolution en utilisant TEM. Utiliser les sites d&#39;intérêt tels que la périphérie de la cellule et l&#39;enveloppe nucléaire pour déterminer fluorescent z pile d&#39;image correspond à la tranche EM. </li><li> Utilisation du programme d&#39;imagerie de votre choix (par exemple, l&#39;image J, Adobe Photoshop, etc), réduire l&#39;opacité de l&#39;image fluorescente de 50% et la superposer à l&#39;image TEM avec laquelle il correspond. Aligner les images en réglant l&#39;échelle (à retenir les proportions) et la rotation de l&#39;image confocale pour correspondre à l&#39;image de TEM. Les ajustements précis de contraste, la netteté, etc dans l&#39;image fluorescente peut aider à l&#39;alignement. Remarque: nous avons constaté que l&#39;hétérochromatine, l&#39;enveloppe nucléaire, et la périphérie de la cellule d&#39;excellents points de repère représentent un pour aiderdans l&#39;orientation des deux images. </li></ol> 6. Considérations critiques <ol><li> Pour grandement faciliter la localisation de la molécule injectée petite, un marqueur fluorescent comme la fluorescéine ou la rhodamine peut être lié de manière covalente en utilisant des kits disponibles dans le commerce. Des informations complémentaires sont acquises par ectopique exprimant une protéine fluorescente subcellulaire marqueur de localisation avant la microinjection. Par conséquent, le choix de fluorophores et inerte colorant suivi microinjection est important. </li><li> Choisir des cellules de micro-injection qui sont adhérentes à proximité du centre de la lamelle couvre-objet et éviter de choisir une grille à proximité du bord. Vous présente la plus grande probabilité pour que les cellules d&#39;intérêt sont transférés à la résine Epon utilisé pour la microscopie électronique. </li><li> Confluence des cellules iest important, comme une plaque complètement confluentes rendra l&#39;identification des cellules micro-injectés dans le microscope électronique à très difficile. Au contraire, les cellules de graines telles qu&#39;elles atteignent environ 50% de confluence le jour d&#39;une courte expérience, ou environ 25% de confluence le jour de la plus longue (1-2 jours) expérience. Utilisez la position et la forme des cellules ainsi que l&#39;espace «vide comme point de repère pour orienter l&#39;image microscopie électronique. </li><li> Confocale épaisseur de coupe optique doit être à l&#39;écoute des besoins de l&#39;expérience et doit donc être déterminée de manière empirique 10. </li><li> Le formaldéhyde et le glutaraldéhyde fixateurs doivent être de la plus haute qualité disponible. Le formaldéhyde se fixer les cellules, tout en préservant les propriétés de fluorescence des deux protéines et de petites molécules fluorescentes (telles que la rhodamine ou FITC). Cependant, il ne conservera pas les structures pour permettre à haute résolution EM. Glutaraldéhyde préserve les membranes et les structures subcellulaires à un haut degré d&#39;analyse EMsis, mais entraver de manière significative la fluorescence. Par conséquent, la fixation en deux étapes est essentielle à la fois pour la fluorescence et la microscopie EM. L&#39;étape de fixation du formaldéhyde peut être omis si l&#39;exécution en temps réel de cellules de mesures, comme la fixation finale peut être effectuée par traitement au glutaraldéhyde. </li></ol> 7. Les résultats représentatifs Cette procédure offre la possibilité de fournir une molécule d&#39;intérêt directement dans le cytoplasme cellulaire eucaryote et surveiller sa localisation et / ou des effets sur l&#39;architecture cellulaire et organeller de millimètre en multi-résolution nanométrique. Une représentation schématique du dispositif expérimental et la procédure est montré dans la figure 2. Cette technique repose sur la micro-injection de cellules cultivées sur une lamelle de verre gravé au laser quadrillé (fig. 3A), qui, après la microscopie confocale, est capable de transférer les cellules d&#39;intérêt, ainsi que le motif de grille à la résine Epon (Fig.3B). Une procédure typique microinjection CLEM donne des images de fluorescence et micrographies électroniques, que lorsqu&#39;elles sont corrélées, permettant à la fois la localisation subcellulaire et l&#39;analyse ultrastructurale. Les cellules cultivées sur une lamelle de verre quadrillé photodécoupe sont micro-injecté avec une molécule d&#39;intérêt après lequel les images à fond clair sont obtenus (figure 4A). Un colorant de repérage inerte est constituée de distinguer les cellules de micro-injection des cellules non micro-injection (figure 4B). Confocaux z piles sont obtenus en utilisant un fluorophore ou un autre identificateur attaché à la molécule d&#39;intérêt microinjectées petit (Fig. 4C). L&#39;échantillon est fixé avec du glutaraldéhyde et traitées pour la microscopie électronique. Les micrographies électroniques sont obtenues et se superpose sur les cellules auxquelles ils correspondent (figure 4D). Les zones qui abritent des signaux fluorescents sont inspectés de façon plus détaillée à plus fort grossissement (Fig. 4E </strong&gt;). <img src="/files/ftp_upload/3650/3650fig1.jpg" alt="Figure 1"/> Figure 1. Chronologie de la procédure CLEM microinjection. En fonction de la configuration expérimentale, la micro-injection et les mesures de fluorescence peut être effectuée sur le même jour. Préparation de l&#39;échantillon pour la microscopie électronique est plus de temps en raison de la consommation de longues incubations étapes et durera 2-3 jours. L&#39;analyse par MET et la corrélation des signaux de fluorescence avec des images de microscopie électronique peut être effectuée en une seule journée. <img src="/files/ftp_upload/3650/3650fig2.jpg" alt="Figure 2"/> La figure 2 illustre la procédure générale de CLEM microinjection Etape 1:.. Repérez les cellules en croissance sur lamelle de verre gravé au laser quadrillé et micro-injection molécule d&#39;intérêt. Étape 2:. Capturez les deux images à fond clair et confocale fluorescentes z piles de cellules microinjectés Étape 3: préparerlamelle pour EM analyse et d&#39;incorporer dans la résine Epon. Utilisation grille transféré, couper bloquer de sorte que les cellules d&#39;intérêt sont au sommet. Étape 4: Faites des coupes en série avec ultramicrotome. Etape 5: Corrélation des images fluorescentes avec EM images. <img src="/files/ftp_upload/3650/3650fig3.jpg" alt="Figure 3"/> . Figure 3 en grille facilite l&#39;identification des cellules d&#39;intérêt panneau A représente la micro-injection de cellules cultivées à ~ 50% de confluence;. Noter la grille identifiant aK. Barre d&#39;échelle est de 100 um. Panneau B montre le quadrillage transféré à partir de la lamelle couvre-objet sur ​​le bloc polymérisé résine Epon qui sera coupée en série après la grille d&#39;intérêt est identifié dans un microscope à dissection. Groupe C représente le motif de grille en vue de transférer de sectionnement . Notez que le crépitement grille de transfert est en marche arrière sur le bloc de résine; scalbar e est de 1200 um. <img src="/files/ftp_upload/3650/3650fig4.jpg" alt="Figure 4"/> .. Figure 4 résultats représentatifs de la lumière corrélative micro-injection et la microscopie électronique Le panneau A montre la micrographie en champ clair de cellules NRK qui poussent sur ​​une lamelle de verre gravé au laser quadrillé, les flèches indiquent deux cellules qui sont visualisés par CLEM en CD panneaux panneau B montre la fluorescence. du colorant inerte suivi, dans ce cas Cascade Blue, utilisé pour identifier des cellules qui ont été microinjectés. Groupe C montre la superposition du champ lumineux et la signature de fluorescence de la rhodamine-petite molécule marquée. Les deux cellules présentées ici sont indiqués par des flèches sur les panneaux A et B. La partie D représente CLEM sur fond clair, microscopie à fluorescence et électronique;. Tête de flèche indique fluorescente lacrymaux imagée à un grossissement supérieur dans Panneau E barres d&#39;échelle sont les suibas: Panneaux A et B, 100 um; C et D, 50 um; E, 100 nm.

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Pas de conflit d&#39;intérêts sont déclarés.

La méthode présentée ici permet la livraison directe des protéines, des acides nucléiques purifiés, ou des petites molécules dans le cytoplasme eucaryote et offre ultra-haute résolution grâce à l&#39;analyse de la corrélation de la microscopie à fluorescence et électronique. L&#39;utilisation de cette méthode est simple mais robuste et peut être réalisée en interne avec de nombreuses installations de base existantes et / ou des laboratoires convenablement équipés en microscopie électronique. La techn...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> Lamelles en photodécoupe et cellules vivantes Plate </td><td> MatTek </td><td> P35G-2-14-CGRD </td><td></td></tr><tr><td> Texas Red </td><td> Invitrogen </td><td> D3329 </td><td></td></tr><tr><td> Cascade Blue </td><td> Invitrogen </td><td> D7132 </td><td></td></tr><tr><td> Rhodamine kit de marquage </td><td> Thermo Scientific </td><td> 53002 </td><td></td></tr><tr><td> 0,22 um unité de filtration centrifuge </td><td> Millipore </td><td> UFC30GV00 </td><td></td></tr><tr><td> Pipettes en verre borosilicate </td><td> Sutter Instruments </td><td> BF100-50-10 </td><td></td></tr><tr><td> Micropipette Puller </td><td> Sutter Instruments </td><td> Modèle P-97 </td><td> Utilisez le programme n ° 4 après l&#39;exécution de test de rampe </td></tr><tr><td> Système de micro-injection FemtoJet </td><td> Eppendorf </td><td> InjectMan NI2 </td><td></td></tr><tr><td> Fluide Retrait lamelle </td><td> MatTek </td><td> PDCF OS 30 </td><td></td></tr><tr><td> Technai microscope électronique à transmission </td><td> FEI </td><td> Technai G2 BioTWIN </td><td></td></tr><tr><td> Ultramicrotombe </td><td> Leica </td><td> EM UC6 </td><td></td></tr></tbody></table>

correlative light and electron microscopy (clem) as a tool to visualize microinjected molecules and their eukaryotic sub-cellular targets

La cellule eucaryote dépend complexe, très réglementé, et fonctionnellement distinctes compartiments membranaires liés à préserver une polarité biochimique nécessaire à la fonction cellulaire adéquate. Comprendre comment les enzymes, les protéines et les composants du cytosquelette gouverner et maintenir cette séparation biochimique est donc d&#39;une importance primordiale. L&#39;utilisation de molécules marquées par fluorescence de localiser et / ou perturbent compartiments subcellulaires a révélé une mine de connaissances et de faire progresser notre compréhension de la régulation cellulaire. Les techniques d&#39;imagerie telles que la microscopie confocale fluorescente et faire déterminer la position d&#39;une molécule fluorescente marqués petite relativement simple, mais la résolution de très petites structures est limitée 1. D&#39;autre part, la microscopie électronique a révélé les détails de la morphologie subcellulaire à très haute résolution, mais son caractère statique, il est difficile de mesurer très dynamique processus avec précision 2,3. Ainsi, la combinaison de la microscopie optique à la microscopie électronique d&#39;un même échantillon, appelé Lumière corrélative et microscopie électronique (CLEM) 4,5, offre le double avantage de l&#39;imagerie de fluorescence ultra-rapide avec la haute résolution de la microscopie électronique 6. Cette technique puissante a été mis en place pour étudier de nombreux aspects de 5,7 biologie cellulaire. Depuis sa création, cette procédure a accru notre capacité à distinguer les architectures subcellulaires et des morphologies à haute résolution. Ici, nous présentons une méthode simplifiée pour la réalisation de micro-injection rapide suivie d&#39;CLEM (Fig. 1). La procédure CLEM micro-injection peut être utilisé pour introduire des quantités spécifiques de petites molécules et / ou des protéines directement dans le cytoplasme de cellules eucaryotes et étudier les effets du millimètre à plusieurs nanomètres résolution (Fig. 2). La technique est basée sur la micro-injectioncellules cultivées sur des lamelles en verre gravé au laser par maille fixé au fond de vaisselle de cellules vivantes et l&#39;imagerie par microscopie confocale à la fois fluorescent et d&#39;électrons. Localisation de la cellule (s) d&#39;intérêt est facilitée par la configuration de grille, qui est facilement transférable, avec des cellules d&#39;intérêt, de la résine Epon utilisé pour l&#39;immobilisation des échantillons et de sectionnement avant analyse par microscopie électronique (fig. 3). Superposition des images fluorescentes et EM permet à l&#39;utilisateur de déterminer la localisation subcellulaire ainsi que les modifications morphologiques et / ou ultrastructurales induites par la molécule d&#39;intérêt microinjecté (Fig. 4). Cette technique se prête à des points de temps allant de ≤ 5 s jusqu&#39;à plusieurs heures, selon la nature de l&#39;échantillon microinjectés.

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Correlative Light and Electron Microscopy CLEM as a Tool to Visualize Microinjected Molecules and their Eukaryotic Sub-cellular Targets

La technique CLEM a été conçu pour analyser la morphologie ultrastructurale des membranes, les organites subcellulaires, et des structures affectées par micro-injection des molécules. Cette méthode combine les techniques puissantes de micromanipulation / microinjection, microscopie confocale à fluorescence et microscopie électronique pour permettre millimètre à résolution nanométrique multi-. Cette technique se prête à une grande variété d&#39;applications.

Lumière corrélative et microscopie électronique (CLEM) comme un outil pour visualiser des molécules et de leurs microinjecté eucaryotes Sous-cellulaires cibles


The eukaryotic cell relies on complex, highly regulated, and functionally distinct membrane bound compartments that preserve a biochemical polarity ...

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Correlative Light and Electron Microscopy (CLEM) as a Tool to Visualize Microinjected Molecules and their Eukaryotic Sub-cellular Targets

19.0K vues.  University of Texas Southwestern Medical Center. La technique CLEM a été conçu pour analyser la morphologie ultrastructurale des membranes, les organites subcellulaires, et des structures affectées par micro-injection des molécules. Cette méthode combine les techniques puissantes de micromanipulation / microinjection, microscopie confocale à fluorescence et microscopie électronique pour permettre millimètre à résolution nanométrique multi-. Cette technique se prête à une grande variété d'applications...

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Electroantennographic Bioassay as a Screening Tool for Host Plant Volatiles

Plant volatiles play an important role in plant-insect interactions. Herbivorous insects use plant volatiles, known as kairomones, to locate their host plant.1,2 When a host plant is an important agronomic commodity feeding damage by insect pests can inflict serious economic losses to growers. Accordingly, kairomones can be used as attractants to lure or confuse these insects and, thus, offer an environmentally friendly alternative to pesticides for insect control.3 Unfortunately, plants can emit a vast number volatiles with varying compositions and ratios of emissions dependent upon the phenology of the commodity or the time of day. This makes identification of biologically active components or blends of volatile components an arduous process. To help identify the bioactive components of host plant volatile emissions we employ the laboratory-based screening bioassay electroantennography (EAG). EAG is an effective tool to evaluate and record electrophysiologically the olfactory responses of an insect via their antennal receptors. The EAG screening process can help reduce the number of volatiles tested to identify promising bioactive components. However, EAG bioassays only provide information about activation of receptors. It does not provide information about the type of insect behavior the compound elicits; which could be as an attractant, repellent or other type of behavioral response. Volatiles eliciting a significant response by EAG, relative to an appropriate positive control, are typically taken on to further testing of behavioral responses of the insect pest. The experimental design presented will detail the methodology employed to screen almond-based host plant volatiles4,5 by measurement of the electrophysiological antennal responses of an adult insect pest navel orangeworm (Amyelois transitella) to single components and simple blends of components via EAG bioassay. The method utilizes two excised antennae placed across a "fork" electrode holder. The protocol demonstrated here presents a rapid, high-throughput standardized method for screening volatiles. Each volatile is at a set, constant amount as to standardize the stimulus level and thus allow antennal responses to be indicative of the relative chemoreceptivity. The negative control helps eliminate the electrophysiological response to both residual solvent and mechanical force of the puff. The positive control (in this instance acetophenone) is a single compound that has elicited a consistent response from male and female navel orangeworm (NOW) moth. An additional semiochemical standard that provides consistent response and is used for bioassay studies with the male NOW moth is (Z,Z)-11,13-hexdecadienal, an aldehyde component from the female-produced sex pheromone.6-8

A method to rapidly screen host plant volatiles by measurement of the electrophysiological response of adult navel orangeworm (Amyelois transitella) antennae to single components and blends via electroantennographic analysis is demonstrated.

Essais biologiques électroantennographique comme outil de dépistage pour les substances volatiles de la plante hôte

Plant volatiles play an important role in plant-insect interactions. Herbivorous insects use plant volatiles, known as kairomones, to locate their host ...

Recherche

Biologie

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway that polypeptide chain follows during co-translational folding to achieve its functional form is still an enigma. In order to understand this process and to determine the exact conformation of the co-translational folding intermediates, it is essential to develop techniques that allow the isolation of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes to allow their further structural analysis.
SecM (secretion monitor) is a 170 amino acid E. coli protein that regulates expression of the downstream SecA (secretion driving) ATPase in the secM-secA operon6. Nakatogawa and Ito originally found that a 17 amino acid long sequence (150-FSTPVWISQAQGIRAGP-166) in the C-terminal region of the SecM protein is sufficient and necessary to cause stalling of SecM elongation at Gly165, thereby producing peptidyl-glycyl-tRNA stably bound to the ribosomal P-site7-9. More importantly, it was found that this 17 amino acid long sequence can be fused to the C-terminus of virtually any full-length and/or truncated protein thus allowing the production of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes7. Thus, when fused or inserted into the target protein, SecM stalling sequence produces arrest of the polypeptide chain elongation and generates stable RNCs both in vivo in E. coli cells and in vitro in a cell-free system. Sucrose gradient centrifugation is further utilized to isolate RNCs.
The isolated RNCs can be used to analyze structural and functional features of the co-translational folding intermediates. Recently, this technique has been successfully used to gain insights into the structure of several ribosome bound nascent chains10,11. Here we describe the isolation of bovine Gamma-B Crystallin RNCs fused to SecM and generated in an in vitro translation system.

We describe here a technique that is now routinely used to isolate stably bound ribosome nascent chain complexes (RNCs). This technique takes advantage of the discovery that a 17 amino acid long SecM "arrest sequence" can halt translation elongation in a prokaryotic (E. coli) system, when inserted into (or fused to the C-terminus) of virtually any protein.

Utilisation de la séquence d&#39;arrêt SecM comme un outil pour isoler les polypeptides Ribosome Bound

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and temporal resolution to study in vivo hematopoiesis using the murine bone marrow transplant experimental model. Genetic combinatorial marking using lentiviral vectors encoding fluorescent proteins (FPs) enabled cell fate mapping through advanced microscopy imaging. Vectors encoding five different FPs: Cerulean, EGFP, Venus, tdTomato, and mCherry were used to concurrently transduce HSPCs, creating a diverse palette of color marked cells. Imaging using confocal/two-photon hybrid microscopy enables simultaneous high resolution assessment of uniquely marked cells and their progeny in conjunction with structural components of the tissues. Volumetric analyses over large areas reveal that spectrally coded HSPC-derived cells can be detected non-invasively in various intact tissues, including the bone marrow (BM), for extensive periods of time following transplantation. Live studies combining video-rate multiphoton and confocal time-lapse imaging in 4D demonstrate the possibility of dynamic cellular and clonal tracking in a quantitative manner.

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

Combinatorial 5 fluorescent proteins marking of hematopoietic stem and progenitor cells allows in vivo clonal tracking via confocal and two-photon microscopy, providing insights into bone marrow hematopoietic architecture during regeneration. This method allows non-invasive fate mapping of spectrally-coded HSPCs-derived cells in intact tissues for extensive periods of time following transplantation.

In vivo suivi clonale de cellules souches hématopoïétiques et progénitrices Marqué par cinq protéines fluorescentes confocale et multiphotonique Microscopie

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

Correlative Confocal and 3D Electron Microscopy of a Specific Sensory Cell

Delineation of a cell&#8217;s ultrastructure is important for understanding its function. This can be a daunting project for rare cell types diffused throughout tissues made of diverse cell types, such as enteroendocrine cells of the intestinal epithelium. These gastrointestinal sensors of food and bacteria have been difficult to study because they are dispersed among other epithelial cells at a ratio of 1:1,000. Recently, transgenic reporter mice have been generated to identify enteroendocrine cells by means of fluorescence. One of those is the peptide YY-GFP mouse. Using this mouse, we developed a method to correlate confocal and serial block-face scanning electron microscopy. We named the method cocem3D and applied it to identify a specific enteroendocrine cell in tissue and unveil the cell&#8217;s ultrastructure in 3D. The resolution of cocem3D is sufficient to identify organelles as small as secretory vesicles and to distinguish cell membranes for volume rendering. Cocem3D can be easily adapted to study the 3D ultrastructure of other specific cell types in their native tissue.

Here, we introduce a method, cocem3D, to unveil the ultrastructure of a specific cell in its native tissue by bridging confocal and serial block-face scanning electron microscopy.

Corrélative confocale et microscopie électronique 3D d&#39;une cellule sensorielle spécifique

Delineation of a cell&#8217;s ultrastructure is important for understanding its function. This can be a daunting project for rare cell types diffused ...

Scanning Electron Microscopy of Macerated Tissue to Visualize the Extracellular Matrix

Fibrosis is a component of all forms of heart disease regardless of etiology, and while much progress has been made in the field of cardiac matrix biology, there are still major gaps related to how the matrix is formed, how physiological and pathological remodeling differ, and most importantly how matrix dynamics might be manipulated to promote healing and inhibit fibrosis. There is currently no treatment option for controlling, preventing, or reversing cardiac fibrosis. Part of the reason is likely the sheer complexity of cardiac scar formation, such as occurs after myocardial infarction to immediately replace dead or dying cardiomyocytes. The extracellular matrix itself participates in remodeling by activating resident cells and also by helping to guide infiltrating cells to the defunct lesion. The matrix is also a storage locker of sorts for matricellular proteins that are crucial to normal matrix turnover, as well as fibrotic signaling. The matrix has additionally been demonstrated to play an electromechanical role in cardiac tissue. Most techniques for assessing fibrosis are not qualitative in nature, but rather provide quantitative results that are useful for comparing two groups but that do not provide information related to the underlying matrix structure. Highlighted here is a technique for visualizing cardiac matrix ultrastructure. Scanning electron microscopy of decellularized heart tissue reveals striking differences in structure that might otherwise be missed using traditional quantitative research methods.

Shown here is a method for visualizing extracellular matrix ultrastructure in decellularized cardiac tissues.

Microscopie électronique à balayage du tissu macéré pour visualiser la matrice extracellulaire

Fibrosis is a component of all forms of heart disease regardless of etiology, and while much progress has been made in the field of cardiac matrix ...

Preparation of Prokaryotic and Eukaryotic Organisms Using Chemical Drying for Morphological Analysis in Scanning Electron Microscopy (SEM)

Scanning electron microscopy (SEM) is a widely available technique that has been applied to study biological specimens ranging from individual proteins to cells, tissues, organelles, and even whole organisms. This protocol focuses on two chemical drying methods, hexamethyldisilazane (HMDS) and t-butyl alcohol (TBA), and their application to imaging of both prokaryotic and eukaryotic organisms using SEM. In this article, we describe how to fix, wash, dehydrate, dry, mount, sputter coat, and image three types of organisms: cyanobacteria (Toxifilum mysidocida, Golenkina sp., and an unknown sp.), two euglenoids from the genus Monomorphina (M. aenigmatica and M. pseudopyrum), and the fruit fly (Drosophila melanogaster). The purpose of this protocol is to describe a fast, inexpensive, and simple method to obtain detailed information about the structure, size, and surface characteristics of specimens that can be broadly applied to a large range of organisms for morphological assessment. Successful completion of this protocol will allow others to use SEM to visualize samples by applying these techniques to their system.

Preparation of Prokaryotic and Eukaryotic Organisms Using Chemical Drying for Morphological Analysis in Scanning Electron Microscopy SEM

SEM analysis is an effective method to aid in species identification or phenotypic discrimination. This protocol describes the methods for examining specific morphological details of three representative types of organisms and would be broadly applicable to examining features of many organismal and tissue types.

Préparation des organismes procaryotes et eucaryotes à l’aide de séchage chimique pour l’analyse morphologique en microscopie électronique (MEB)

Scanning electron microscopy (SEM) is a widely available technique that has been applied to study biological specimens ranging from individual proteins to ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the imaging modality in a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM), which is used to obtain stacks of sequential images for 3D reconstruction and modelling. High-pressure freezing (HPF) allows close to native structural preservation, but the subsequent freeze substitution often does not provide sufficient contrast, especially for a bigger specimen, which is needed for high-quality imaging in the SEM required for 3D reconstruction. Therefore, in this protocol, after the freeze substitution, additional contrasting steps are carried out at room temperature. Although these steps are performed in a microwave, it is also possible to follow traditional bench processing, which requires longer incubation times.The subsequent embedding in minimal amounts of resin allows for faster and more precise targeting and preparation inside the FIB-SEM. This protocol is especially useful for samples that require preparation by high-pressure freezing for a reliable ultrastructural preservation but do not gain enough contrast during the freeze substitution for volume imaging using FIB-SEM. In combination with the minimal resin embedding, this protocol provides an efficient workflow for the acquisition of high-quality volume data.

Here we present a protocol for combining two sample processing techniques, high-pressure freezing and microwave-assisted sample processing, followed by minimal resin embedding for acquiring data with a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM). This is demonstrated using a mouse tibial nerve sample and Caenorhabditis elegans.

Préparation de l’échantillon biologique par congélation à haute pression, amélioration du contraste assistée par micro-ondes et minime résine enrobage pour l’imagerie de Volume

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...

Cryo-Electron Microscopic Grid Preparation for Time-Resolved Studies using a Novel Robotic System, Spotiton

The capture of short-lived molecular states triggered by the early encounter of two or more interacting particles continues to be an experimental challenge of great interest to the field of cryo-electron microscopy (cryo-EM). A few methodological strategies have been developed that support these &#34;time-resolved&#34; studies, one of which, Spotiton-a novel robotic system-combines the dispensing of picoliter-sized sample droplets with precise temporal and spatial control. The time-resolved Spotiton workflow offers a uniquely efficient approach to interrogate early structural rearrangements from minimal sample volume. Fired from independently controlled piezoelectric dispensers, two samples land and rapidly mix on a nanowire EM grid as it plunges toward the cryogen. Potentially hundreds of grids can be prepared in rapid succession from only a few microliters of a sample. Here, a detailed step-by-step protocol of the operation of the Spotiton system is presented with a focus on troubleshooting specific problems that arise during grid preparation.

The protocol presented here describes the use of Spotiton, a novel robotic system, to deliver two samples of interest onto a self-wicking, nanowire grid that mix for a minimum of 90 ms prior to vitrification in liquid cryogen.

Préparation de grille cryo-microscopique électronique pour des études résolues dans le temps à l’aide d’un nouveau système robotique, Spotiton

The capture of short-lived molecular states triggered by the early encounter of two or more interacting particles continues to be an experimental ...

Ultrastructural Localization of Endogenous LC3 by On-Section Correlative Light-Electron Microscopy

The visualization of autophagic organelles at the ultrastructural level by electron microscopy (EM) is essential to establish their identity and reveal details that are important for understanding the autophagic process. However, EM methods often lack molecular information, obstructing the correlation of ultrastructural information obtained by EM to fluorescence microscopy-based localization of specific autophagy proteins. Furthermore, the rarity of autophagosomes in unaltered cellular conditions hampers investigation by EM, which requires high magnification, and hence provides a limited field of view.
In answer to both challenges, an on-section correlative light-electron microscopy (CLEM) method based on fluorescent labeling was applied to correlate a common autophagosomal marker, LC3, to EM ultrastructure. The method was used to rapidly screen cells in fluorescence microscopy for LC3 labeling in combination with other relevant markers. Subsequently, the underlying ultrastructural features of selected LC3-labeled spots were identified by CLEM. The method was applied to starved cells without adding inhibitors of lysosomal acidification.
In these conditions, LC3 was found predominantly on autophagosomes and rarely in autolysosomes, in which LC3 is rapidly degraded. These data show both the feasibility and sensitivity of this approach, demonstrating that CLEM can be used to provide ultrastructural insights on LC3-mediated autophagy in native conditions-without drug treatments or genetic alterations. Overall, this method presents a valuable tool for ultrastructural localization studies of autophagy proteins and other scarce antigens by bridging light microscopy to EM data.

Here, we present a protocol for optimized on-section correlative light-electron microscopy based on endogenous, fluorescent labeling as a tool to investigate the localization of rare proteins in relation to cellular ultrastructure. The power of this approach is demonstrated by ultrastructural localization of endogenous LC3 in starved cells without Bafilomycin treatment.

Localisation ultrastructurale de la LC3 endogène par microscopie électronique luminescente corrélative sur coupe

The visualization of autophagic organelles at the ultrastructural level by electron microscopy (EM) is essential to establish their identity and reveal ...

Nouveau protocole pour la fluorescence simultanée et la préservation des ultrastructures

Epon Post Embedding Correlative Light and Electron Microscopy

Correlative light and electron microscopy (CLEM) is a comprehensive microscopy that combines the localization information provided by fluorescence microscopy (FM) and the context of cellular ultrastructure acquired by electron microscopy (EM). CLEM is a trade-off between fluorescence and ultrastructure, and usually, ultrastructure compromises fluorescence. Compared with other hydrophilic embedding resins, such as glycidyl methacrylate, HM20, or K4M, Epon is superior in ultrastructure preservation and sectioning properties. Previously, we had demonstrated that mEosEM can survive osmium tetroxide fixation and Epon embedding. Using mEosEM, we achieved, for the first time, Epon post embedding CLEM, which maintains the fluorescence and the ultrastructure simultaneously. Here, we provide step-by-step details about the EM sample preparation, the FM imaging, the EM imaging, and the image alignment. We also improve the procedures for identifying the same cell imaged by FM imaging during the EM imaging and detail the registration between the FM and EM images. We believe one can easily achieve Epon post embedding correlative light and electron microscopy following this new protocol in traditional EM facilities.

Pleins feux sur l’auteur : Progrès de la microscopie corrélative à la lumière et de la microscopie électronique avec préservation des protéines fluorescentes

We present a detailed protocol for Epon post-embedding correlative light and electron microscopy using a fluorescent protein called mScarlet. This method can maintain the fluorescence and the ultrastructure simultaneously. This technique is amenable to a wide variety of biological applications.