Les auteurs sont reconnaissants à Fondazione Filarète pour son aide et son appui à la publication de cet article. Nous tenons également à remercier Centro Europeo di Nanomedicina pour l&#39;utilisation du microscope électronique à transmission TECNAI G2.

Une. Plasmide, culture cellulaire, et transfection avec ER protéines fluorescentes <ol><li> Le plasmide utilisé dans cette étude est constitué d&#39;une version améliorée de la GFP fusionnée à son extrémité C-terminale de la région de la queue de l&#39;isoforme d&#39;ER de rat cytochrome b (5) (abrégé ici en tant que b (5)) par l&#39;intermédiaire d&#39;une séquence de liaison. La région de queue contient la séquence entière (Pro94-Asp134) qui reste associée à la membrane après le clivage par la trypsine de b natif (5), y compris la DMT de 17 résidus (domaine transmembranaire), flanqué par des séquences polaires amont et aval (UPS et DPS) . Le lieur est constitué de l&#39;épitope myc suivi de [(Gly) 4 Ser] 3, et l&#39;ensemble de l&#39;ADNc est inséré dans les sites Hind3-Xba1 du vecteur d&#39;expression de mammifère pcDNA3. Les détails de la construction de ce plasmide ont été décrites dans une publication antérieure dans laquelle elle est désignée comme la GFP-ER 16. </li><li> Cultivez cellules COS-7 en milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) additionné de 10% fetal de sérum bovin, 2 mM de L-glutamine, 1% de pénicilline / streptomycine dans un incubateur à 37 ° C et 10% de CO 2. </li><li> Transfection. La plaque 3 x 10 5 cellules sur une lamelle de verre ronde dans une plaque à 6 puits et, le jour suivant, transfecter avec le système JetPEI comme décrit par le fabricant. A noter que le rapport optimal JetPEI / ADN a été testé afin de déterminer l&#39;efficacité de transfection maximale en fonction du plasmide et la lignée cellulaire utilisée: dans notre cas, une JetPEI: rapport d&#39;ADN de 2:1 conduit à 70-80% de l&#39;efficacité de transfection. </li></ol> 2. Direct fluorescence microscopie confocale à balayage <ol><li> Imagerie des cellules vivantes. Placer la lamelle sur laquelle les cellules transfectées ont été ensemencées dans une chambre de cellule de la culture de l&#39;acier pour 24 mm lamelles remplis avec du DMEM w / o rouge de phénol, complété avec 10% de FBS, 2 mM de L-glutamine, 1% de pénicilline / streptomycine, 25 mM d&#39;HEPES , 50 ug / ml de cycloheximide et 1:100 OxyFluor pour empêcher les échantillons de photoblanchiment. Un microscop SP5 confocalee équipé d&#39;un incubateur à CO2 à température contrôlée (37 ° C et 5% CO 2) est utilisé pour des expériences d&#39;imagerie des cellules vivantes, avec d GFP-ER étant visualisé en utilisant un laser à 488 nm et d&#39;un filtre 525/50 passe de la bande d&#39;émission. </li><li> récupération de fluorescence après photoblanchiment (FRAP). Dessiner une région d&#39;intérêt (ROI), correspondant à une structure OSER, et blanchir à l&#39;aide de 20 itérations et une combinaison de 488 nm (100% d&#39;un laser Argon 30 mW, ce qui correspond à 5,5-6 mW à l&#39;échantillon) et 405 nm (60% de 30 mW Diode laser 405, correspondant à 11,6 mW à l&#39;échantillon) lasers qui, dans notre expérience, conduit à photoblanchiment efficace et rapide. </li><li> Enregistrer la reprise de la fluorescence dans les régions d&#39;intérêt blanchis en prenant une seule image toutes les 10 secondes pendant 10 minutes (temps de pixel = 1,61 ps / px). </li><li> perte de fluorescence dans photoblanchiment (FLIP). Dessinez un retour sur investissement correspondant à une structure OSER, et l&#39;eau de Javel comme décrit ci-dessus. Le blanchiment est répété toutes les 30 secondes,et les images post-blanchiment sont enregistrées toutes les 10 secondes pendant 30 minutes (temps de pixel = 1,61 ps / px). </li><li> FRAP et FLIP analyse. Toutes les images sont analysées en utilisant le logiciel ImageJ ( <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html" target="_blank">http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html</a> ). Dans les expériences de FRAP, la récupération de la fluorescence de la ROI blanchie est mesurée au cours du temps et normalisées par rapport à la fluorescence totale des cellules blanchie, qui est toujours contrôlée pour être constante dans le temps. </li><li> Pour les expériences de FLIP, tirer un retour sur investissement en dehors de l&#39;OSER blanchi et couvrant l&#39;ensemble de la cellule. Mesurer l&#39;intensité de la fluorescence au cours du temps et à normaliser les niveaux de fluorescence d&#39;un retour sur investissement tirés sur une cellule non blanchie afin de corriger toute diminution de la fluorescence provoquée par la formation d&#39;image lui-même. </li><li> Dans toutes les expériences, soustrait le signal de fond (déterminé dans une zone à l&#39;extérieur des cellules) à partir des intensités de fluorescence des régions d&#39;intérêt. Enfin, tracer les résultats en utilisant Gr.aphPad logiciel Prism. </li></ol> 3. Ultrastructurale Analyse par microscopie électronique à transmission Compte tenu de la toxicité de la plupart des réactifs, toutes les procédures devraient être effectuées portant un laboratoire approprié. manteau et des gants sous une hotte. <ol><li> Après élimination de la lamelle de la boîte de Pétri, fixer les cellules cultivées restantes sur le fond de la cuvette en monocouche en utilisant filtré 2% de glutaraldéhyde dans 0,1 M de tampon cacodylate, pH 7,4, pendant 10 min à température ambiante. </li><li> Grattez les cellules en utilisant un grattoir en téflon et les transférer dans 1,5 ml tubes Eppendorf. Sédimenter les cellules par centrifugation à 9000 g pendant 10 min. Retirer le surnageant, ajouter du fixateur frais, et laisser une nuit à 4 ° C. </li><li> Laver les pastilles avec le tampon, puis post-fixation avec une solution de tétroxyde d&#39;osmium à 1% dans du tampon cacodylate pendant 1 heure à température ambiante. </li><li> Rincer à l&#39;eau MilliQ, et en bloc tache avec1% d&#39;acétate d&#39;uranyle dans de l&#39;eau distillée pendant entre 20 à 60 min. </li><li> Déshydrater les échantillons en série croissante d&#39;éthanol (70%, 80%, 90%, 100% et 100% pendant 10 min chacun), et le laver deux fois brièvement dans de l&#39;oxyde de propylène (15 min chacun). </li><li> Infiltrer les échantillons dans un mélange d&#39;oxyde de propylene + Epon (1:1) (à partir de 2 h à une nuit). </li><li> Incorporer dans une résine époxy Epon durci à 60 ° C pendant au moins 24 h. </li><li> Section des blocs de résine taillés manuellement à l&#39;aide d&#39;un ultramicrotome LEICA UC6 équipé d&#39;un couteau de diamant de 45 ° pour obtenir sections d&#39;une épaisseur de 60-70 nm. Recueillir les sections sur les 300 mailles des grilles de cuivre. </li><li> Colorer les sections sur la grille avec une solution saturée d&#39;acétate d&#39;uranyle (20 min) et du citrate de plomb (7 min), bien se laver les grilles en les plongeant dans de l&#39;eau filtrée bi-distillée, et laissez-les sécher à température ambiante. </li><li> Les grilles colorées sont observées en utilisant un microscope électronique à transmission TECNAI G2, et les images sont capturées en utilisant un Bottcaméra CCD om-monté à différents grossissements finales (allant généralement de 6,000-39,000 X). </li></ol>

<ol>
	<li>Fasana, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+VAPB+mutant+linked+to+amyotrophic+lateral+sclerosis+generates+a+novel+form+of+organized+smooth+endoplasmic+reticulum.">A VAPB mutant linked to amyotrophic lateral sclerosis generates a novel form of organized smooth endoplasmic reticulum.</a> FASEB J. 24, 1419-1430 (2010).</li><li>Borgese, N., Francolini, M., Snapp, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endoplasmic+reticulum+architecture:+structures+in+flux.">Endoplasmic reticulum architecture: structures in flux.</a> Curr. Opin. Cell Biol. 18, 358-364 (2006).</li><li>Ronchi, P., Colombo, S., Francolini, M., Borgese, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmembrane+domain-dependent+partitioning+of+membrane+proteins+within+the+endoplasmic+reticulum.">Transmembrane domain-dependent partitioning of membrane proteins within the endoplasmic reticulum.</a> J. Cell Biol. 181, 105-118 (2008).</li><li>Lippincott-Schwartz, J., Snapp, E., Kenworthy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+protein+dynamics+in+living+cells.">Studying protein dynamics in living cells.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2, 444-456 (2001).</li><li>Lee, M. C., Miller, E. A., Goldberg, J., Orci, L., Schekman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bi-directional+protein+transport+between+the+ER+and.">Bi-directional protein transport between the ER and.</a> 20, 87-123 (2004).</li><li>Snapp, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+stacked+ER+cisternae+by+low+affinity+protein+interactions.">Formation of stacked ER cisternae by low affinity protein interactions.</a> J. Cell Biol. 163, 257-269 (2003).</li><li>Papiani, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Restructured+endoplasmic+reticulum+generated+by+mutant+amyotrophic+lateral+sclerosis-linked+VAPB+is+cleared+by+the+proteasome.">Restructured endoplasmic reticulum generated by mutant amyotrophic lateral sclerosis-linked VAPB is cleared by the proteasome.</a> J. Cell Sci. 125, 3601-3611 (2012).</li><li>Almsherqi, Z. A., Kohlwein, S. D., Deng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cubic+membranes:+a+legend+beyond+the+Flatland*+of+cell+membrane+organization.">Cubic membranes: a legend beyond the Flatland* of cell membrane organization.</a> J. Cell Biol. 173, 839-844 (2006).</li><li>Federovitch, C. M., Ron, D., Hampton, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamic+ER:+experimental+approaches+and+current+questions.">The dynamic ER: experimental approaches and current questions.</a> Curr. Opin. Cell Biol. 17, 409-414 (2005).</li><li>Takei, K., Mignery, G. A., Mugnaini, E., Sudhof, T. C., De Camilli, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inositol+1,4,5-trisphosphate+receptor+causes+formation+of+ER+cisternal+stacks+in+transfected+fibroblasts+and+in+cerebellar+Purkinje+cells.">Inositol 1,4,5-trisphosphate receptor causes formation of ER cisternal stacks in transfected fibroblasts and in cerebellar Purkinje cells.</a> Neuron. 12, 327-342 (1994).</li><li>Feldman, D., Swarm, R. L., Becker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+study+of+rat+liver+and+liver+neoplasms+after+long-term+treatment+with+phenobarbital.">Ultrastructural study of rat liver and liver neoplasms after long-term treatment with phenobarbital.</a> Cancer Res. 41, 2151-2162 (1981).</li><li>Sprocati, T., Ronchi, P., Raimondi, A., Francolini, M., Borgese, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+and+reversible+restructuring+of+the+endoplasmic+reticulum+induced+by+PDMP+in+cultured+cells.">Dynamic and reversible restructuring of the endoplasmic reticulum induced by PDMP in cultured cells.</a> J. Cell Sci. 119, 3249-3260 (2006).</li><li>Costantini, L. M., Fossati, M., Francolini, M., Snapp, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+the+tendency+of+fluorescent+proteins+to+oligomerize+under+physiologic+conditions.">Assessing the tendency of fluorescent proteins to oligomerize under physiologic conditions.</a> Traffic. 13, 643-649 (2012).</li><li>Pyszniak, A. M., Welder, C. A., Takei, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+surface+distribution+of+high-avidity+LFA-1+detected+by+soluble+ICAM-1-coated+microspheres.">Cell surface distribution of high-avidity LFA-1 detected by soluble ICAM-1-coated microspheres.</a> J. Immunol. 152, 5241-5249 (1994).</li><li>Taylor, J. P., Hardy, J., Fischbeck, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxic+proteins+in+neurodegenerative+disease.">Toxic proteins in neurodegenerative disease.</a> Science. 296, 1991-1995 (2002).</li><li>Winklhofer, K. F., Tatzelt, J., Haass, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+two+faces+of+protein+misfolding:+gain-+and+loss-of-function+in+neurodegenerative+diseases.">The two faces of protein misfolding: gain- and loss-of-function in neurodegenerative diseases.</a> EMBO J. 27, 336-349 (2008).</li><li>Borgese, N., Gazzoni, I., Barberi, M., Colombo, S., Pedrazzini, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+of+a+tail-anchored+protein+to+endoplasmic+reticulum+and+mitochondrial+outer+membrane+by+independent+but+competing+pathways.">Targeting of a tail-anchored protein to endoplasmic reticulum and mitochondrial outer membrane by independent but competing pathways.</a> Mol. Biol. Cell. 12, 2482-2496 (2001).</li><li>Chudakov, D. M., Matz, M. V., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+proteins+and+their+applications+in+imaging+living+cells+and+tissues.">Fluorescent proteins and their applications in imaging living cells and tissues.</a> Physiol Rev. 90, 1103-1163 (2010).</li><li>Bancaud, A., Huet, S., Rabut, G., Ellenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+perturbation+techniques+to+study+mobility+and+molecular+dynamics+of+proteins+in+live+cells+FRAP,+photoactivation,+photoconversion,+and+FLIP.">Fluorescence perturbation techniques to study mobility and molecular dynamics of proteins in live cells FRAP, photoactivation, photoconversion, and FLIP.</a> Cold Spring Harb. Protoc. 2010, (2010).</li><li>Michida, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+endothelin+1+in+hemorrhagic+shock-induced+gastric+mucosal+injury+in+rats.">Role of endothelin 1 in hemorrhagic shock-induced gastric mucosal injury in rats.</a> Gastroenterology. 106, 988-993 (1994).</li></ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à révéler.

Les protocoles et les méthodes d&#39;imagerie décrites dans le présent document ont été utilisées pour étudier la distribution et la mobilité des transfectées TA protéines fluorescentes résidents dans le RE de cellules vivantes. Nous avons également analysé l&#39;effet de l&#39;expression excessive de ces protéines sur l&#39;architecture de ce compartiment sous-cellulaire à l&#39;aide d&#39;analyses ultrastructurales. La combinaison de cellules vivantes imagerie confocale et l...

La découverte de la protéine verte fluorescente (GFP) et ses variantes spectrales, et le développement parallèle de la microscopie à fluorescence, ont ouvert complètement nouvelles avenues pour la recherche sur le comportement des protéines dans les cellules. Des techniques telles que la récupération de fluorescence après photoblanchiment (FRAP) et la perte de fluorescence dans photoblanchiment (FLIP), qui sont possibles en raison de la capacité intrinsèque de fluorophores à éteindre leur fluorescence sous éclairage intense, sont basées sur l&#39;imagerie des cellules vivantes confocale et l&#39;utilisation de transfectées des protéines de fusion fluorescente 3.1. Ils sont largement utilisés pour évaluer non seulement la localisation des protéines, mais aussi leur mobilité et le transport vésiculaire, qui peut révéler des indices importants concernant leur fonction 4. La caractéristique unique des cellules eucaryotes est la présence de compartiments intracellulaires qui ont des compositions lipidiques et protéiques spécifiques. Bien que les organites sont physiquement isolated, ils doivent communiquer entre eux et partager des composants moléculaires, afin de maintenir l&#39;homéostasie cellulaire. La voie de sécrétion garantit que les protéines et les lipides synthétisés dans le RE atteindre la destination finale correcte dans laquelle ils exercent leur fonction. Organites intracellulaires peuvent également être reliés par des sites de contact dynamiques qui permettent aux molécules (lipides) pour être directement échangés entre les compartiments. En outre, de nombreuses protéines ont de grands complexes assemblés dans hétéromériques ou associé avec des espèces lipidiques spécifiques (radeaux lipidiques / microdomaines) afin de devenir fonctionnellement active ou être transportés vers leur destination finale. Tous ces aspects biologiques influencent fortement les propriétés cinétiques des protéines, et peuvent donc être étudiés de façon appropriée au moyen des techniques décrites ci-dessous. Notre groupe a largement utilisé FRAP et FLIP combinée avec la microscopie électronique pour étudier l&#39;architecture de l&#39;urgence et de ses différents sousdomaines. L&#39;ER est la première station de la voie de sécrétion et joue un rôle clé dans les protéines et les lipides de tri 5. Il est un organite très dynamique dont les sous-domaines distincts refléter ses nombreuses fonctions différentes (c&#39;est à dire des protéines et des lipides de biosynthèse et de la traite, le repliement des protéines, Ca 2 + stockage et la libération, et le métabolisme des xénobiotiques). Cependant, même si elles sont morphologiquement, spatialement et fonctionnellement distinctes, ces domaines sont continus les uns avec les autres, et leur abondance relative peuvent être modifiées dans des cellules dans des conditions physiologiques et pathologiques. Les plus connus et les domaines généralement spatialement distincts de l&#39;ER sont l&#39;enveloppe nucléaire, et le RE lisse et rugueux, mais nous et d&#39;autres avons démontré qu&#39;il existe des structures ER avec une architecture plus élaborée et organisation tridimensionnelle dans divers types de cellules et les tissus dans des conditions physiologiques qui peuvent également être induites par les moyens de stimuli stressants tels que l&#39;hypoxie, la drogueadministration, ou la sur-expression de protéines transmembranaires 2,6 ER-résident (et les références qui y sont). Nous avons récemment démontré la présence de telles structures dans des modèles cellulaires de maladies humaines 1,7. Originaire de la citernes empilées de RE lisse, ils ont reçu le nom collectif de réticulum endoplasmique lisse organisé (OSER) en 2003 6, mais ils sont également connus comme karmellae, lamelles, et cristalloïde ER sur la base de leur architecture qui, comme leur taille, peut varier. Après que les cellules sont transfectées avec la GFP fusionnée à la région de la queue cytosolique ancrée (TA) des protéines ER-résident (d EGFP-RE), la tendance à la dimérisation de la GFP dans faiblement trans altère considérablement l&#39;organisation et de la structure de l&#39;ER. FRAP et FLIP expériences ont montré que d EGFP-ER est libre de se diffuser à l&#39;intérieur OSER, et le fait qu&#39;il se déplace de l&#39;ER réticulaire à la OSER et vice versa &lt;/ Em&gt; indique que les agrégats sont en continuité avec l&#39;ER réticulaire environnante. L&#39;analyse ultrastructurale nous a permis de corréler les données de fluorescence avec une description détaillée de l&#39;architecture OSER et l&#39;organisation au niveau de l&#39;échelle nanométrique: OSER sont toujours constitués d&#39;empilements de citernes paires de RE lisse mais peuvent avoir différentes formes d&#39;organisation spatiale, tels que disposés régulièrement sinusoïdale tableaux ou des spirales, ou des tableaux tubulaires &quot;cristalloïdes&quot; hexagonaux. Ces réarrangements conduisent à des morphologies cubes 8 qui, comme ils l&#39;ont été trouvés dans les cellules dans des conditions physiologiques 9 et contraintes suivants tels que l&#39;hypoxie 10, traitement de la toxicomanie 11, et le cancer 9, peuvent avoir un potentiel important en tant que marqueurs ultrastructuraux. Après cette première démonstration en utilisant des protéines de fusion GFP, nous avons utilisé des expériences d&#39;imagerie pour analyser la prolifération des domaines de l&#39;urgence en réponse aux traitements pharmacologiques 12, assess la tendance des protéines fluorescentes pour oligomériser dans des cellules 13, et d&#39;enquêter sur le rôle d&#39;un mutant, protéines TA SLA liés à la formation d&#39;agrégats intracellulaires d&#39;origine ER qui peuvent être pertinents à son 1,8 de pathogénicité. Il a été suggéré que la formation d&#39;agrégats intracellulaires (ce qui se produit dans de nombreuses maladies neurodégénératives 14) peut être un mécanisme de protection destinée à empêcher les interactions entre les protéines mutantes toxiques et les composants de la cellule autour de 15. Ce qui suit est une description d&#39;une combinaison de méthodes de microscopie optique et électronique pour enquêter sur des constructions dont les C-terminal domaines hydrophobes sont insérés dans la membrane du RE, et une analyse de leur comportement dynamique et les effets de leur surexpression sur le domaine de l&#39;urgence l&#39;architecture à des cellules en culture (voir la figure 1 pour un organigramme du protocole expérimental).

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of Material/ Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Dulbecco's Modified Eagle medium (DMEM)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>41966029</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Dulbecco's Modified Eagle medium (DMEM) w/o phenol red</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31053028</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10270106</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>L-Glutamine 200 mM solution</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25030-024</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>jetPEI</td>
			<td>Polyplus Transfection</td>
			<td>PP10110</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>OxyFluor</td>
			<td>Oxyrase Inc.</td>
			<td>OF-0005</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Glutaraldehyde Grade I</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G5882</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Sodium Cacodylate Trihydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C0250</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Osmium Tetroxide 4% solution</td>
			<td>Electron Microscopy Science</td>
			<td>19150</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Uranyl Acetate dihydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>73943</td>
			<td>slightly radioactive</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Propylene Oxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>82320</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>EPON embedding medium kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>45359-1EA-F</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Lead Citrate </td>
			<td>Electron Microscopy Science</td>
			<td>17800</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Bench top centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5415 D</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Spectral Confocal Microscope </td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>TCS SP5</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>CO2 Microscope Cage Incubation System </td>
			<td>OkoLab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Ultramicrotome </td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>UC6</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Diamond knife </td>
			<td>Diatome</td>
			<td>Ultra 45 &deg;</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Transmission Electron Microscope </td>
			<td>FEI</td>
			<td>Tecnai G2</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>GraphPad Prism Software</td>
			<td>GraphPad Software, Inc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>steel culture cell chamber for 24 mm coverslip</td>
			<td>Bioscience Tools</td>
			<td>CSC-25</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Electron Microscopy grids</td>
			<td>Electron Microscopy Science</td>
			<td>G300Cu</td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

visualization of endoplasmic reticulum subdomains in cultured cells

Les lipides et des protéines dans les cellules eucaryotes sont continuellement échangés entre compartiments cellulaires, bien que ceux-ci conservent leur composition et les fonctions distinctif malgré le trafic interorganelle moléculaire intense. Les techniques décrites dans le présent document sont des moyens puissants de l&#39;étude des protéines et de la mobilité des lipides et le trafic in vivo et dans leur environnement physiologique. récupération de fluorescence après photoblanchiment (FRAP) et la perte de la fluorescence dans photoblanchiment (FLIP) sont largement utilisés techniques d&#39;imagerie des cellules vivantes pour étudier le trafic intracellulaire par l&#39;intermédiaire de la voie de l&#39;exo-endocytose, la continuité entre les organelles ou des sous-compartiments, la formation de complexes protéiques, et la localisation des protéines en microdomaines lipidiques, qui peut être observée dans des conditions physiologiques et pathologiques. Les limites de ces approches sont principalement dues à l&#39;utilisation de protéines de fusion fluorescente, et leurs inconvénients potentiels comprennent un artefact sur-expression dans les cellules et la possibilité de différences dans le repliement et la localisation des protéines marquées et natives. Enfin, comme la limite de résolution de la microscopie optique (environ 200 nm) ne permet pas d&#39;enquête de la structure fine de l&#39;ER ou les sous-compartiments spécifiques qui peuvent provenir de cellules en situation de stress (c&#39;est à dire l&#39;hypoxie, l&#39;administration du médicament, l&#39;expression trop de transmembranaire protéines ER résidents) ou dans des conditions pathologiques, nous combinons l&#39;imagerie des cellules vivantes des cellules transfectées cultivées avec ultrastructurale analyse basée sur la microscopie électronique à transmission.

La figure 2 montre une étude d&#39;FRAP d&#39;exemple de la mobilité de la protéine. La mobilité de la protéine EGFP d-ER est démontrée par la récupération rapide de la fluorescence après photoblanchiment dans OSER blanchies. Pour l&#39;analyse quantitative, la mi-temps et fraction mobile ont été calculées à partir des données mesurées expérimentalement par ajustement de l&#39;équation monoexponentielle suivante: F (t) = F + poste (poste</...

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Visualization of Endoplasmic Reticulum Subdomains in Cultured Cells

Nous décrivons des méthodes d&#39;imagerie nous utilisons pour étudier la distribution et la mobilité des protéines fluorescentes transfectées résidant dans le réticulum endoplasmique (RE) par l&#39;intermédiaire de l&#39;imagerie confocale de cellules vivantes. Nous analysons également ultrastructuralement l&#39;effet de leur expression sur l&#39;architecture de ce compartiment subcellulaire.

Visualisation de réticulum endoplasmique sous-domaines dans les cellules cultivées

The lipids and proteins in eukaryotic cells are continuously exchanged between cell compartments, although these retain their distinctive composition and ...

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Research

JoVE Journal

Biology

12.9K vues.  Fondazione Filarete.  Nous décrivons des méthodes d'imagerie nous utilisons pour étudier la distribution et la mobilité des protéines fluorescentes transfectées résidant dans le réticulum endoplasmique (RE) par l'intermédiaire de l'imagerie confocale de cellules vivantes. Nous analysons également ultrastructuralement l'effet de leur expression sur l'architecture de ce compartiment subcellulaire. 

Vidéo: Visualization of Endoplasmic Reticulum Subdomains in Cultured Cells

Counting and Determining the Viability of Cultured Cells

Determining the number of cells in culture is important in standardization of culture conditions and in performing accurate quantitation experiments. A hemacytometer is a thick glass slide with a central area designed as a counting chamber. Cell suspension is applied to a defined area and counted so cell density can be calculated. 

Determining the number of cells in culture is important in standardization of culture conditions and in performing accurate quantitation experiments. In this video, we demonstrate how cells are counted using a hemacytometer.

Comptage et détermination de la viabilité des cellules cultivées

Determining the number of cells in culture is important in standardization of culture conditions and in performing accurate quantitation experiments. A ...

Recherche

Biologie

Visualization of the Interstitial Cells of Cajal (ICC) Network in Mice

The interstitial cells of Cajal (ICC) are mesenchymal derived "pacemaker cells" of the gastrointestinal (GI) tract that generate spontaneous slow waves required for peristalsis and mediate neuronal input from the enteric nervous system1. Different subtypes of ICC form distinct networks in the muscularis of the GI tract 2,3. Loss or injury to these networks is associated with a number of motility disorders4. ICC cells express the KIT receptor tyrosine kinase on the plasma membrane and KIT immunostaining has been used for the past 15 years to label the ICC network5,6. Importantly, normal KIT activity is required for ICC development5,6. Neoplastic transformation of ICC cells results in gastrointestinal stromal tumor (GIST), that frequently harbor gain-of-function KIT mutations7,8. We recently showed that ETV1 is a lineage-specific survival factor expressed in the ICC/GIST lineage and is a master transcriptional regulator required for both normal ICC network formation and for of GIST tumorigenesis9. We further demonstrate that it cooperates with activating KIT mutations in tumorigenesis. Here, we describe methods for visualization of ICC networks in mice, largely based on previously published protocols10,11. More recently, the chloride channel anoctamin 1 (ANO1) has also been characterized as a specific membrane marker of ICC11,12. Because of their plasma membrane localization, immunofluorescence of both proteins can be used to visualize the ICC networks. Here, we describe visualization of the ICC networks by fixed-frozen cyrosections and whole mount preparations.

Visualization of the Interstitial Cells of Cajal ICC Network in Mice

The interstitial cells of Cajal (ICC) are the pacemaker cells of the gastrointestinal (GI) tract. They form complex networks between smooth muscle cells and post-ganglionic neuronal fibers to regulate GI contractility. Here, we present immunofluorescence methods cross-sectional and whole-mount visualization of murine ICC networks.

Visualisation des cellules interstitielles de Cajal (CIC) Réseau Souris

The interstitial cells of Cajal (ICC) are mesenchymal derived "pacemaker cells" of the gastrointestinal (GI) tract that generate spontaneous slow waves ...

Visualization of Endoplasmic Reticulum Localized mRNAs in Mammalian Cells

In eukaryotes, most of the messenger RNAs (mRNAs) that encode secreted and membrane proteins are localized to the surface of the endoplasmic reticulum (ER). However, the visualization of these mRNAs can be challenging. This is especially true when only a fraction of the mRNA is ER-associated and their distribution to this organelle is obstructed by non-targeted (i.e. "free") transcripts. In order to monitor ER-associated mRNAs, we have developed a method in which cells are treated with a short exposure to a digitonin extraction solution that selectively permeabilizes the plasma membrane, and thus removes the cytoplasmic contents, while simultaneously maintaining the integrity of the ER. When this method is coupled with fluorescent in situ hybridization (FISH), one can clearly visualize ER-bound mRNAs by fluorescent microscopy. Using this protocol the degree of ER-association for either bulk poly(A) transcripts or specific mRNAs can be assessed and even quantified. In the process, one can use this assay to investigate the nature of mRNA-ER interactions.

Here we describe a method to visualize endoplasmic reticulum-associated mRNAs in mammalian tissue culture cells. This technique involves the selective permeabilization of the plasma membrane with digitonin to remove cytoplasmic contents followed by fluorescent in situ hybridization to detect either bulk poly(A) mRNA or specific transcripts.

Visualisation des ARNm localisés dans le réticulum endoplasmique des cellules de mammifères

In eukaryotes, most of the messenger RNAs (mRNAs) that encode secreted and membrane proteins are localized to the surface of the endoplasmic reticulum ...

Chromosome Preparation From Cultured Cells

Chromosome (cytogenetic) analysis is widely used for the detection of chromosome instability. When followed by G-banding and molecular techniques such as fluorescence in situ hybridization (FISH), this assay has the powerful ability to analyze individual cells for aberrations that involve gains or losses of portions of the genome&#160;and rearrangements involving one or more chromosomes. In humans, chromosome abnormalities occur in approximately 1 per 160 live births1,2, 60-80% of all miscarriages3,4, 10% of stillbirths2,5, 13% of individuals with congenital heart disease6, 3-6% of infertility cases2, and in many patients with developmental delay&#160;and birth defects7. Cytogenetic analysis of malignancy is routinely used by researchers and clinicians, as observations of clonal chromosomal abnormalities have been shown to have both diagnostic and prognostic significance8,9.&#160; Chromosome isolation is invaluable for gene therapy and stem cell research of organisms including nonhuman primates and rodents10-13.
Chromosomes can be isolated from cells of live tissues, including blood lymphocytes, skin fibroblasts, amniocytes, placenta, bone marrow, and tumor specimens. Chromosomes are analyzed at the metaphase stage of mitosis, when they are most condensed and therefore more clearly visible. The first step of the chromosome isolation technique involves the disruption of the spindle fibers by incubation with Colcemid, to prevent the cells from proceeding to the subsequent anaphase stage. The cells are then treated with a hypotonic solution and preserved in their swollen state with Carnoy&#39;s fixative. The cells are then dropped on to slides and can then be utilized for a variety of procedures. G-banding involves trypsin treatment followed by staining with Giemsa to create characteristic light and dark bands. The same procedure to isolate chromosomes can be used for the preparation of cells for procedures such as fluorescence in situ hybridization (FISH), comparative genomic hybridization (CGH), and spectral karyotyping (SKY)14,15.

Chromosomes can be isolated from live cells such as lymphocytes or skin fibroblasts, and from organisms including humans or mice. These chromosome preparations can be further utilized for routine G-banding and molecular cytogenetic procedures such as fluorescence in situ hybridization (FISH), comparative genomic hybridization (CGH), and spectral karyotyping (SKY).

Chromosome Préparation partir des cellules cultivées

Chromosome (cytogenetic) analysis is widely used for the detection of chromosome instability. When followed by G-banding and molecular techniques such as ...

Organelle Transport in Cultured Drosophila Cells: S2 Cell Line and Primary Neurons.

Drosophila S2 cells plated on a coverslip in the presence of any actin-depolymerizing drug form long unbranched processes filled with uniformly polarized microtubules. Organelles move along these processes by microtubule motors. Easy maintenance, high sensitivity to RNAi-mediated protein knock-down and efficient procedure for creating stable cell lines make Drosophila S2 cells an ideal model system to study cargo transport by live imaging. The results obtained with S2 cells can be further applied to a more physiologically relevant system: axonal transport in primary neurons cultured from dissociated Drosophila embryos. Cultured neurons grow long neurites filled with bundled microtubules, very similar to S2 processes. Like in S2 cells, organelles in cultured neurons can be visualized by either organelle-specific fluorescent dyes or by using fluorescent organelle markers encoded by DNA injected into early embryos or expressed in transgenic flies. Therefore, organelle transport can be easily recorded in neurons cultured on glass coverslips using living imaging. Here we describe procedures for culturing and visualizing cargo transport in Drosophila S2 cells and primary neurons. We believe that these protocols make both systems accessible for labs studying cargo transport.

Organelle Transport in Cultured Drosophila Cells: S2 Cell Line and Primary Neurons.

Drosophila S2 cells and cultured neurons are great systems for imaging of motor-driven organelle transport in vivo. Here we describe detailed protocols for culturing both cell types, their imaging and analysis of transport.

Organite Transport en culture d&#39;<em&gt; Drosophila</em&gt; Cellules: S2 Cell Line et neurones primaires.

Drosophila S2 cells plated on a coverslip in the presence of any actin-depolymerizing drug form long unbranched processes filled with uniformly polarized ...

Visualization of G3BP Stress Granules Dynamics in Live Primary Cells

SGs can be visualized in cells by immunostaining of specific protein components or polyA+ mRNAs. SGs are highly dynamic and the study of their assembly and fate is important to understand the cellular response to stress. The deficiency in key factors of SGs like G3BP (RasGAP SH3 domain Binding Protein) leads to developmental defects in mice&#160;and alterations of the Central Nervous System. To study the dynamics of SGs in cells from an organism, one can culture primary cells and follow the localization of a transfected tagged component of SGs. We describe time-lapse experiment to observe G3BP1-containing SGs in Mouse Embryonic Fibroblasts (MEFs). This technique can also be used to study G3BP-containing SGs in live neurons, which is crucial as it was recently shown that these SGs are formed at the onset of neurodegenerative diseases like Alzheimer&#39;s disease. This approach can be adapted to any other cellular body and granule protein component, and performed with transgenic animals, allowing the live study of granules dynamics for example in the absence of a specific factor of these granules.

Stress granules (SGs) are cytoplasmic RNA granules containing stalled ribonucleoprotein particles (RNPs), and important in cellular response to various stresses. Dynamics of SGs can be followed in live cells by visualizing the localization of a tagged component of SGs in transfected primary cells after stress.

Visualisation de G3BP stress Granules dynamique dans les cellules primaires en direct

SGs can be visualized in cells by immunostaining of specific protein components or polyA+ mRNAs. SGs are highly dynamic and the study of their assembly ...

Massively Parallel Reporter Assays in Cultured Mammalian Cells

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory activities. The potential throughput of this assay has, however, been limited by the need to individually clone and assay the activity of each sequence on interest using protein fluorescence or enzymatic activity as a proxy for regulatory activity. Advances in high-throughput DNA synthesis and sequencing technologies have recently made it possible to overcome these limitations by multiplexing the construction and interrogation of large libraries of reporter constructs. This protocol describes implementation of a Massively Parallel Reporter Assay (MPRA) that allows direct comparison of hundreds of thousands of putative regulatory sequences in a single cell culture dish.

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory activities. Coupling candidate regulatory elements to reporter genes that carry identifying sequence tags enables massive parallelization of these assays.

Essais Reporter massivement parallèles dans des cellules de mammifères en culture

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory ...

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, electrical excitability and cell proliferation. The diversity and specificity of Ca2+ signaling derives from mechanisms by which Ca2+ signals are generated to act over different time and spatial scales, ranging from cell-wide oscillations and waves occurring over the periods of minutes to local transient Ca2+ microdomains (Ca2+ puffs) lasting milliseconds. Recent advances in electron multiplied CCD (EMCCD) cameras now allow for imaging of local Ca2+ signals with a 128 x 128 pixel spatial resolution at rates of &#62;500 frames sec-1 (fps). This approach is highly parallel and enables the simultaneous monitoring of hundreds of channels or puff sites in a single experiment. However, the vast amounts of data generated (ca. 1 Gb per min) render visual identification and analysis of local Ca2+ events impracticable. Here we describe and demonstrate the procedures for the acquisition, detection, and analysis of local IP3-mediated Ca2+ signals in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators using both wide-field epi-fluorescence (WF) and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. Furthermore, we describe an algorithm developed within the open-source software environment Python that automates the identification and analysis of these local Ca2+ signals. The algorithm localizes sites of Ca2+ release with sub-pixel resolution; allows user review of data; and outputs time sequences of fluorescence ratio signals together with amplitude and kinetic data in an Excel-compatible table.

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Here we present techniques for imaging local IP3-mediated Ca2+ events using fluorescence microscopy in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators together with an algorithm that automates identification and analysis of these events.

Imagerie Ca locale<sup&gt; 2+</sup&gt; Signaux de cellules de mammifères cultivées

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, ...

Silencing of BRCA2 to Identify Novel BRCA2-regulated Biological Functions in Cultured Human Cells

Silencing of the tumor suppressor protein BRCA2 and its detection by conventional biochemical analyses represent a great technical challenge owing to the large size of the human BRCA2 protein (approximately 390 kDa). We report modifications of standard siRNA transfection and immunoblotting protocols to silence human BRCA2 and detect endogenous BRCA2 protein, respectively, in human epithelial cell lines. Key steps include a high siRNA to transfection reagent ratio and two subsequent rounds of siRNA transfection within the same experiment. Using these and other modifications to the standard protocol we consistently achieve more than 70% silencing of the human BRCA2 gene as judged by immunoblotting analysis with anti-BRCA2 antibodies. In addition, denaturation of the cell lysates at 55 &#176;C instead of the conventional 70-100 &#176;C and other technical optimizations of the immunoblotting procedure allow detection of intact BRCA2 protein even when very low amounts of starting material are available or when BRCA2 protein expression levels are very low. Efficient silencing of BRCA2 in human cells offers a valuable strategy to disrupt BRCA2 function in cells with intact BRCA2, including tumor cells, to examine new molecular pathways and cellular functions that may be affected by pathogenic BRCA2 mutations in tumors. Adaptation of this protocol for efficient silencing and analysis of other &#39;large&#39; proteins like BRCA2 should be readily achievable.

Silencing of BRCA2 to Identify Novel BRCA2-regulated Biological Functions in Cultured Human Cells

Gene silencing by siRNA represents a convenient experimental strategy to analyze BRCA2-dependent biological functions with immediate implications to better understand cancer biology. A method to efficiently silence BRCA2, along with the experimental procedure to detect and quantify changes in BRCA2 protein expression by immunoblotting in human cell lines, is presented.

Silence de<em&gt; BRCA2</em&gt; D&#39;identifier les fonctions biologiques de BRCA2 réglementés nouveaux dans les cellules humaines en culture

Silencing of the tumor suppressor protein BRCA2 and its detection by conventional biochemical analyses represent a great technical challenge owing to the ...

Monitoring Endoplasmic Reticulum Calcium Homeostasis Using a Gaussia Luciferase SERCaMP

The endoplasmic reticulum (ER) contains the highest level of intracellular calcium, with concentrations approximately 5,000-fold greater than cytoplasmic levels. Tight control over ER calcium is imperative for protein folding, modification and trafficking. Perturbations to ER calcium can result in the activation of the unfolded protein response, a three-prong ER stress response mechanism, and contribute to pathogenesis in a variety of diseases. The ability to monitor ER calcium alterations during disease onset and progression is important in principle, yet challenging in practice. Currently available methods for monitoring ER calcium, such as calcium-dependent fluorescent dyes and proteins, have provided insight into ER calcium dynamics in cells, however these tools are not well suited for in vivo studies. Our lab has demonstrated that a modification to the carboxy-terminus of Gaussia luciferase confers secretion of the reporter in response to ER calcium depletion. The methods for using a luciferase based, secreted ER calcium monitoring protein (SERCaMP) for in vitro and in vivo applications are described herein. This video highlights hepatic injections, pharmacological manipulation of GLuc-SERCaMP, blood collection and processing, and assay parameters for longitudinal monitoring of ER calcium.

Monitoring Endoplasmic Reticulum Calcium Homeostasis Using a Gaussia Luciferase SERCaMP

Endoplasmic reticulum calcium homeostasis is disrupted in diverse pathologies. A secreted ER calcium monitoring protein (SERCaMP) reporter can be used to detect disruptions in the ER calcium store. This protocol describes the use of a Gaussia luciferase SERCaMP to examine ER calcium homeostasis in vitro and in vivo.

Suivi réticulum endoplasmique homéostasie calcique l&#39;aide d&#39;un<em&gt; Gaussia</em&gt; Luciférase SERCaMP

The endoplasmic reticulum (ER) contains the highest level of intracellular calcium, with concentrations approximately 5,000-fold greater than cytoplasmic ...