Ce protocole décrit comment les larves transgéniques de poisson zèbre peuvent être employées pour fournir un essai quantitatif in vivo de la vascularisation de xénogreffe de tumeur. Le principal avantage de cette technique par rapport aux techniques précédentes est qu’elle permet à l’investigateur de quantifier avec précision les changements dans les niveaux de vascularisation xénogreffe. L’étape clé consiste à s’assurer que les cellules tumorales sont injectées correctement dans les larves de poisson zèbre afin que les étapes subséquentes d’imagerie et de quantitation ne soient pas compromises.
Après avoir grandi et étiqueté les cellules B16-F1 avec du colorant fluorescent, commencez à préparer les embryons à l’implantation. Remplir un plat de 35 millimètres d’une méthylcellulose de 2 % dans la solution E3 jusqu’à un quart du volume du plat. À l’aide d’une pipette de transfert, placer environ 50 embryons transgéniques préparés précédemment sur la méthylcellulose tout en minimisant le volume de solution E3 transférée.
À l’aide d’une pointe de pipette microcapillaire, disposer les embryons de façon à ce qu’ils soient tous orientés verticalement, la tête vers le haut, la queue vers le bas et l’embryon avec son côté gauche vers le haut. Ajouter 50% ECM à une pastille cellulaire B16-F1 préparée précédemment pour produire un mélange de cellules à ECM dans un rapport de deux pour un. Bien mélanger en pipetage et en remuant, et conserver le mélange sur la glace.
Utilisez une pipette microcapillaire pour prendre jusqu’à trois à 10 microlitres de cellules. Insérez soigneusement la pointe pipette dans une aiguille de microinjection préparée précédemment, puis éjectez le mélange matricielle B16-F1 à l’extrémité de l’aiguille. Insérez l’aiguille dans le porte-aiguille et inclinez-la à un angle de 45 degrés par rapport au plat.
Utilisez des pinces à épiler pour briser le bout de l’aiguille pour faire un trou assez grand pour que les cellules soient éjectées de l’aiguille sans presser les cellules. Allumez le cylindre d’air pressurisé fixé à l’appareil d’injection, puis allumez momentanément l’injecteur en mode continu pendant au plus une seconde pour pousser les cellules jusqu’au bout de l’aiguille. Dirigez l’aiguille vers le sac jaune d’un embryon, et poussez-le à travers le sac jaune dans une direction ventrale jusqu’à ce que la pointe de l’aiguille a émergé du sac jaune et pousse l’épiderme embryonnaire sur le côté ventral de l’embryon, juste postérieur au cœur.
Poussez soigneusement et légèrement le bout de l’aiguille vers l’avant jusqu’à ce qu’elle ait créé un petit espace entre l’épiderme et la membrane du sac jaune. Pulsez l’injecteur pour éjecter une partie du mélange cellulaire dans cet espace périvitelline. Examinez attentivement la taille, la forme et l’emplacement de la xénogreffe au fur et à mesure de son implantation, et ajustez le numéro d’impulsion et la position de l’aiguille en conséquence pour assurer une xénogreffe correctement implantée.
Répétez les impulsions jusqu’à ce que 500 à 800 cellules aient été injectées dans l’espace périvitelline, créant un renflement visible qui s’étend au moins la moitié du chemin le long du fond du sac jaune. Retirer l’aiguille de l’embryon. Après l’injection de tous les embryons, utilisez une pointe de pipette microcapillaire pour pousser tous les embryons ensemble afin qu’ils puissent être pipetted avec le moins de méthylcellulose que possible.
Transférer les embryons dans un plat de récupération contenant de l’E3 avec du PTU et du bleu méthylène. Puis pipette doucement E3 autour des embryons pour les laver, puis incuber à 34 degrés Celsius. Puis l’image des embryons anesthésiés à l’aide d’un microscope confocal.
Utilisez un canal laser approprié pour les cellules tumorales pour déterminer un volume à imager, permettant au moins une ou deux sections optiques de chaque côté de la greffe. Utilisez des intervalles de section qui sont à environ cinq micromètres l’un de l’autre pour créer une pile Z. Utilisez l’imagerie à deux canaux pour imager à la fois les vaisseaux sanguins et la xénogreffe tumorale.
Imagez la xénogreffe tumorale et les vaisseaux sanguins pour une larve, et répétez ces étapes pour que chaque larve soit photographiée. Pour commencer par la quantitation de la réponse angiogénique à la xénogreffe zebrafish, transférer précédemment créé Z pile fichiers d’image confocale d’une xénogreffe tumorale à un nouveau dossier sur le logiciel d’analyse d’image 3D. Pour créer le protocole de volume tumoral pour mesurer le volume de xénogreffe tumorale, allez à l’onglet Mesure sur le menu supérieur de la fenêtre, puis à partir de la liste des protocoles qui apparaît faire glisser le protocole nommé Trouver des objets à l’espace qui est intitulé Drag Tasks Here To Make Measurements.
Après s’être assuré que ce protocole est défini pour mesurer les objets dans le canal tumoral, faites glisser les protocoles nommés Clip To ROIs et Faites le retour sur investissement de la population de la liste des protocoles aux tâches de traînée ici pour faire des mesures de l’espace, en s’assurant que ces deux commandes s’appliquent aux objets identifiés par Trouver des objets. Avant de calibrer les paramètres de ce protocole, rendez-vous au menu dropdown au-dessus de l’étiquette Mode en haut à gauche de la fenêtre, et sélectionnez la vue Mise au point étendue. Désélectionner les canaux non tumoraux dans la vitre à l’extrême droite en cliquant sur le cercle noir sous chaque rubrique de canal afin que seul le canal tumoral puisse être vu.
Ensuite, utilisez l’outil main levée en haut de la fenêtre pour dessiner une région d’intérêt, ou roi, autour de tout le volume tumoral. Dans le panneau ci-dessous l’image, sélectionnez l’étiquette Résumé, puis définissez l’option Affichage pour afficher la population deux. Pour calibrer, sur la tâche Trouver des objets, cliquez sur l’astérisque pour ouvrir la fenêtre paramètres.
Ajustez le seuil en utilisant l’intensité, et déterminez le seuil inférieur jusqu’à ce que seules les cellules tumorales soient sélectionnées et non la fluorescence de fond. Déterminez la taille minimale de l’objet de sorte que seules les cellules intactes sont mesurées, par opposition aux petits éléments de débris cellulaires, en fixant la taille minimale de l’objet à 100 micromètres cubes. Enregistrez ce protocole sous forme de volume tumoral en cliquant sur l’onglet Mesures sur le menu supérieur et en cliquant sur Enregistrer le protocole.
Utilisez les mêmes paramètres pour mesurer toutes les xénogreffes. Pour mesurer le volume des vaisseaux sanguins associés à la xénogreffe, créez un nouveau protocole en allant au menu supérieur, puis en cliquant sur l’onglet Mesures, puis en clear protocol. Faites glisser les objets de recherche et le clip aux tâches ROIs dans l’espace qui s’intitule Drag Tasks Here To Make Measurements pour ce protocole.
Assurez-vous que la première commande est définie pour mesurer les objets dans le canal des vaisseaux sanguins et que la commande suivante est définie pour s’appliquer aux objets identifiés par la première commande. Puis désélectionner les canaux non-vaisseaux dans le volet d’extrême droite de sorte que seuls les vaisseaux sanguins peuvent être vus. Déterminez les paramètres du protocole de volume du navire de la même manière que pour le protocole de volume tumoral précédemment décrit, et enregistrez ce protocole sous le nom de volume du navire.
Effacer le protocole, et tirer un retour sur investissement autour de la xénogreffe, en prenant soin de ne pas inclure toute autofluorescence non tumorale. Pour mesurer la somme du volume des objets dans le canal tumoral à l’intérieur de ce retour sur investissement, cliquez sur l’onglet Mesures, sélectionnez la commande protocole de restauration, choisissez le protocole volume tumoral et cliquez sur Restaurer. À l’aide du nouveau retour sur investissement effectué par le protocole volume tumoral, cliquez sur l’onglet Mesures et sélectionnez la commande protocole de restauration, choisissez le protocole volume du navire et cliquez sur la ligne de somme pour calculer le volume total d’objets dans le canal du navire à l’intérieur de ce roi.
Divisez le volume de vaisseau par le volume de tumeur, et multipliez la réponse par 100 pour obtenir une valeur en pourcentage de vascularisation de greffe. En imagerie d’une xénogreffe individuelle à six, 24 et 48 heures après l’implantation, la réponse angiogénique à différents moments peut être calculée, avec la plus grande réponse angiogénique entre 24 et 48 heures après l’implantation et les niveaux maximaux de vascularisation de greffe observés autour de 48 heures. L’imagerie confocale en accéléré d’une xénogreffe B16-F1 implantée dans un embryon de poisson zèbre post-fécondation de deux jours montre des vaisseaux sanguins étiquetés GFP qui poussent à travers la xénogreffe, formant un réseau de torsion avec des vaisseaux de taille irrégulière et de morphologie typiques du réseau vasculaire anormal observé dans les tumeurs mammifères.
Les xénogreffes incubées dans l’inhibiteur du VEGFR montrent une grande réduction des vaisseaux par rapport aux xénogreffes témoins incubées dans le DMSO. Dans les embryons témoins, il y avait un vaste réseau vasculaire qui s’étendait sur toute la région de xénogreffe, la réponse angiogénique typique observée après l’implantation des cellules B16-F1. Une fois quantifiée, la réponse angiogénique montre une réduction claire de la vascularisation de greffe dans les xénogreffes inhibiteur-traitées de VEGFR par rapport aux contrôles.
Le canal tumoral montre une masse de cellules B16-F1 étiquetées fluorescentement sous le sac jaune, qui affiche l’autofluorescence. Par conséquent, un retour sur investissement doit être soigneusement tiré autour de la xénogreffe, en prenant soin de ne pas inclure l’une des autofluorescences du sac jaune. Le protocole de volume de tumeur a identifié toutes les cellules de B16-F1 dans le ROI, a mesuré leur volume, et a coupé le ROI à leur volume.
Le protocole de volume des vaisseaux tumoraux dans ce nouveau retour sur investissement coupé a permis l’identification de tous les vaisseaux associés à la masse des cellules B16-F1 et a mesuré leur volume. Les valeurs des protocoles de volume de volume de tumeur et de vaisseau de tumeur peuvent être employées pour donner une mesure de vascularisation de greffe. La tractabilité génétique et la perméabilité du poisson zèbre permettent l’étude des voies de signalisation élevées dans l’angiogenèse tumorale, et il peut également agir comme une plate-forme de dépistage pour identifier les composés anti-angiogéniques.
